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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Liyuan, Faculdade de Medicina Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia Huazhong [Aprovação nº: 2026IEC (RYJ016)]. Todos os pacientes deram consentimento informado, e a coleta e uso de amostras clínicas estavam em conformidade com as diretrizes éticas relevantes da Declaração de Helsinque. Os principais materiais experimentais e instrumentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
Coleta de amostras clínicas de tecido e detecção da expressão de CDCP1
Amostras cirúrgicas de tecido foram coletadas de sete pacientes diagnosticados com carcinoma nasofaríngeo em nosso hospital entre janeiro de 2019 e dezembro de 2019. Simultaneamente, amostras de tecido nasal de seis pacientes com rinite foram coletadas como controles. Todas as amostras de tecido foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido após a coleta para extração subsequente de RNA.
Extração de RNA e detecção quantitativa por PCR em tempo real
O RNA total foi extraído de amostras de tecido conforme as instruções do fabricante. Para cada amostra, 50–100 mg de tecido foram processados em gelo em 1 mL de reagente de extração usando um homogeneizador de tecido. A homogeneização foi realizada por 30 segundos e repetida 3 vezes para garantir a completa disrupção do tecido. Após a ruptura do tecido, cada lisado recebeu 200 μL de clorofórmio. Os tubos foram sacudidos vigorosamente por vórtice por 15 s, mantidos em temperatura ambiente por 3 minutos e depois girados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para separar as fases. A camada aquosa transparente foi removida sem perturbar a interfase e transferida para um novo tubo.
O RNA foi recuperado dessa fração aquosa adicionando isopropanol em uma proporção de volume de 1:1. Após uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C para pelletar o RNA. O sobrenadante foi descartado, e o pellet foi enxaguado uma vez com 1 mL de etanol 75%. Após um segundo passo de centrifugação a 7.500 × g . por 5 minutos a 4 °C, a lavagem com etanol foi removida. O pellet de RNA foi então secado ao ar por 5–10 minutos em temperatura ambiente e ressuspenso em 20 μL de água livre de RNase. A quantidade e pureza do RNA foram determinadas espectrofotometricamente.
Para a preparação de cDNA, 1 μg de RNA total foi usado para transcrição reversa. A reação foi realizada a 37 °C por 15 minutos e depois aquecida a 85 °C por 5 segundos. A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi posteriormente realizada com TB Green Premix Ex Taq II em um Sistema de PCR em Tempo Real. Cada reação de 20 μL continha 2 μL de molde de cDNA, espoletas diretas e reversas a 0,4 μmol/L cada, 10 μL de SYBR Green premix e água livre de nuclease. O protocolo de amplificação começou com desnaturação a 95 °C por 30 segundos. Em seguida, vinham 40 ciclos, sendo que cada ciclo consistia em 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s para recozimento/extensão. As sequências de espoletas estão listadas na Tabela 1.
Detecção imunohistoquímica da expressão proteica CDCP1
As amostras de tecido foram inicialmente fixadas em paraformaldeído a 4% por 24 horas, seguidas por desidratação padrão, imersão de parafina e preparação de seções de 4 μm de espessura. As seções de parafina foram então tratadas com xileno para remover parafina e reidratadas sequencialmente por soluções de etanol graduadas. Para o desmascaramento do antígeno, as lâminas eram colocadas em um tampão de citrato (pH 6,0) e aquecidas em panela de pressão por 3 minutos após a solução atingir a ebulição. A atividade endógena da peroxidase foi extinta expondo as seções a 3% de peróxido de hidrogênio por 10 minutos.
Após o bloqueio da atividade enzimática endógena, as secções foram incubadas durante a noite a 4 °C, com o anticorpo primário anti-CDCP1 diluído a 1:200. No dia seguinte, as lâminas foram tratadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte por 30 minutos em temperatura ambiente. A visualização do sinal foi realizada usando um kit de substrato DAB, e as seções foram posteriormente contra-coloridas com hematoxilina. Por fim, as lâminas foram desidratadas, montadas e examinadas sob um microscópio óptico.
Cultura celular e agrupamento
Células de carcinoma nasofaríngeo humano CNE2 e HK1 foram mantidas em DMEM de alta glicemia, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora contendo 5% de CO₂. Quando as células atingiram 70%–80% de confluência, foram transfectadas segundo os seguintes grupos: Grupo controle (Controle): transfectado com vetor vazio ou siRNA controle negativo; Grupo de superexpressão CDCP1 (CDCP1-OE): transfectado com plasmídeo de superexpressão CDCP1 ; Grupo de silenciamento CDCP1 (si-CDCP1): transfectado com siRNA CDCP1 ; Grupo experimental de resgate (CDCP1-OE + U0126): tratado com o inibidor específico ERK1/2 U0126 (10 μmol/L) por 48 horas com base na superexpressão do CDCP1 .
A transfecção foi realizada conforme as instruções do fabricante. As células foram placadas 24 horas antes da transfecção em placas de 6 poços a 2 × 10células de 5 poços, com cada poço contendo 2 mL de meio livre de antibióticos. A transfecção foi iniciada quando as culturas atingiram aproximadamente 70% de confluência. O meio de cultura era então removido e substituído por meio fresco sem soro. Para cada poço, 2 μg de DNA plasmídico ou 100 pmol de siRNA foram preparados separadamente de 5 μL de reagente de transfecção, com cada componente diluído em 250 μL de meio contendo soro reduzido. Ambas as misturas foram mantidas em temperatura ambiente por 5 minutos. O ácido nucleico diluído e o reagente de transfecção foram então combinados e deixados em repouso por 20 minutos em temperatura ambiente para gerar os complexos de transfecção. Esses complexos foram adicionados às células em direção à gota, distribuídos suavemente pelo poço e incubados com as células por 6 horas. Após o término do período de incubação, a mistura de transfecção era removida e as células recebiam um meio completo contendo 10% de FBS.
Ensaio de proliferação celular
Às 48 h após a transfecção, células CNE2 e HK1 de cada grupo foram coletadas e semeadas em placas de 96 poços com densidade de 3 × 10 células3 por poço com 100 μL de meio por poço, com cinco poços replicados por grupo. Após as células terem sido cultivadas por 24, 48 ou 72 horas, 10 μL de solução de MTT a 5 mg/mL foram adicionados a cada poço. As placas foram então incubadas novamente a 37 °C com 5% de CO₂ por mais 4 horas. Após essa incubação, o sobrenadante da cultura foi cuidadosamente descartado, e 100 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço para dissolver os cristais de formazan. As placas foram agitadas por 10 minutos para garantir a dissolução completa. A absorvância era então registrada com um leitor de microplacas a 570 nm, usando 630 nm como comprimento de onda de referência.
Ensaio de atividade da apoptose
Às 48 horas após a transfecção, células CNE2 de cada grupo foram coletadas, e a atividade da Caspase-3 foi detectada usando um Kit de Ensaio de Atividade Caspase-3, conforme as instruções do fabricante. Um total de 100 μL de tampão de lise foi adicionado a 1 × 106 células, lisado em gelo por 15 minutos e depois centrifugado a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante resultante foi transferido para análise subsequente. Para o ensaio Caspase-3, cada poço recebeu 50 μL de tampão de reação e 5 μL de substrato de Caspase-3 (DEVD-pNA). A placa era então mantida em 37 °C por 2 horas, e a absorvância era medida em 405 nm com um leitor de microplaca.
Análise do Western blot
Às 48 horas da transfecção, células CNE2 e HK1 de cada grupo experimental foram colhidas para extração de proteínas. As células foram interrompidas em um tampão RIPA contendo inibidores de protease e mantidas no gelo por 30 minutos. Os lisados resultantes foram centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C, após o que as frações sobrenadantes foram coletadas. A concentração de proteína foi medida com um kit de ensaio de proteínas BCA.
Para a análise western blot, 30 μg de proteína total de cada amostra foram misturados com 5x de tampão de carga e aquecidos a 100 °C por 10 minutos para desnaturalizar as proteínas. As amostras foram separadas em géis SDS-PAGE a 10% a 120 V por 90 minutos, seguidas por transferência para membranas PVDF a corrente constante de 300 mA por 90 minutos. Após a transferência, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente.
As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra CDCP1 (1:1.000), E-cadherin (1:1.000), Vimentina (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000).
No dia seguinte, as membranas foram enxaguadas em TBST 3 vezes, com cada lavagem durando 10 minutos. Depois, foram expostos a anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte por 1 hora em temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais de TBST, os sinais proteicos foram visualizados usando um substrato de quimioluminescência ECL. A intensidade da banda foi medida com o software ImageJ, e o GAPDH foi usado como controle de normalização.
Análise estatística
Todos os experimentos foram conduzidos de forma independente 3 vezes. Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). As diferenças entre múltiplos grupos foram avaliadas por análise unidirecional da variância (ANOVA), e o método de Tukey foi utilizado para comparações post hoc par a par. Um valor P de < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.