Análise Transcriptômica Revela Subgrupos Movidos por Mitocondrias em Lesões de Dermatite Atópica

Summary

Dermatite atópica (DA) é uma doença inflamatória crônica da pele com grande heterogeneidade molecular. Este estudo identifica dois subgrupos de Alzheimer transcriptomicamente distintos, impulsionados pela expressão diferencial dos genes mitocondrials e pela infiltração imune, e revela quatro genes hub como potenciais biomarcadores para a estratificação do paciente.

Abstract

A dermatite atópica (DA) é uma doença inflamatória crônica de pele comum e com prevalência global. Sua heterogeneidade clínica e mecanismos moleculares complexos representam desafios significativos para o desenvolvimento de terapias eficazes. Explorar a heterogeneidade molecular da Alzheimer usando dados transcriptômicos da pele lesional, caracterizar seus perfis biológicos e imunes, e identificar os principais genes subjacentes à diferenciação. Genes diferencialmente expressos foram identificados usando DESeq2, seguidos por análises de via e coexpressão via GSEA e WGCNA, respectivamente. Genes relacionados a mitocondriais foram extraídos por módulos DEGs e WGCNA que se intersectam com o banco de dados MitoCarta3.0, e sua relevância funcional foi avaliada por meio do enriquecimento GO e KEGG. Genes hub foram identificados por análise de redes de interação proteína-proteína, que posteriormente foram usadas para construir um modelo de classificação. Reguladores transcricionais foram previstos usando hTFtarget, enquanto a infiltração de células imunes foi quantificada usando CIBERSORT. Dois subgrupos moleculares foram identificados. O Cluster 1 foi enriquecido em vias de sinalização e adesão celular, enquanto o Cluster 2 apresentou regulação para cima da fosforilação oxidativa e processos relacionados a proteasomas. Um total de 85 genes associados à mitocôndria, principalmente envolvidos no metabolismo energético, foram diferencialmente expressos entre os agrupamentos. A análise da rede PPI identificou quatro genes centrais (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2), que foram significativamente regulados em alta no Cluster 1. Um classificador baseado em genes hub demonstrou forte poder discriminatório (área sob a curva > 0,7). Os principais reguladores transcricionais previstos incluíam ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA. O perfilamento imunológico revelou maior infiltração de células T regulatórias no Cluster 1 e aumento das células T auxiliares foliculares no Cluster 2. Este estudo revela dois subtipos de Alzheimer molecular e imunologicamente distintos, caracterizados por função mitocondrial diferencial e assinaturas de microambiente imunológico.

Introduction

A dermatite atópica (DA) é uma doença inflamatória crônica de pele comum e que afeta até 20% das crianças e 10% dos^{adultos 1}. É caracterizado por coceira intensa e lesões eczematosas^recorrentes. Clinicamente, a Alzheimer surge de uma interação dinâmica entre suscetibilidade poligênica (por exemplo, mutações de perda de função da FLG), desregulação imunológica e exposições ambientais como baixa umidade e disbiose^{microbiana 3}. Embora a DA compartilhe algumas características fisiopatológicas com a psoríase, suas apresentações clínicas são mutuamente exclusivas, com efeitos genéticos diferentes em vias compartilhadas e alterações imunes^{distintas 4}.

A Alzheimer é uma doença heterogênea, caracterizada por perfis transcriptomáticos diversos em diferentes grupos de pacientes e sintomas^{da doença 5}. Análises integradas de tecidos cutâneos e células mononucleares do sangue periférico mostraram que características clínicas como eritema e papulação estão associadas a assinaturas imunológicas distintas, refletindo a interação entre a pele local e as respostas imunes^{sistêmicas 6}. Estudos transcriptômicos em larga escala destacam ainda mais o papel das vias da IL-13 na patogênese da DA, enquanto a DA apresenta maior heterogeneidade molecular do que a psoríase, com variações nos padrões de expressão gênica ligadas à gravidade da doença, idade de início e contexto^{genético 5,7}. Essas diferenças ressaltam a complexidade da patogênese da DA e a necessidade de abordagens personalizadas em pesquisa e terapia.

As proteínas mitocondriais desempenham um papel importante na patogênese da DA, por meio de vias desreguladas do estresse oxidativo e metabólica. Estudos revelam aumento da atividade dos complexos mitocondrial I e II em queratinócitos não lesionais da DA, levando à oxidação excessiva dos ácidos graxos de cadeia longa e à produção elevada de ROS, o que aumenta a disfunção da barreira epidérmica ^8,9. Simultaneamente, análises proteômicas identificam proteínas reduzidas da via antioxidante NRF2 e componentes mitocondriais na pele da DA, reduzindo a resolução do estresse^{oxidativo 10}. Danos ao DNA mitocondrial contribuem ainda mais para respostas inflamatórias, enquanto intervenções como o uso de antioxidantes direcionados para mitocondrias demonstram eficácia na restauração da homeostase epidérmica ao mitigar^{ROS 11,12}. Esses achados destacam as proteínas mitocondriais como tanto motores da patologia da Alzheimer quanto potenciais alvos terapêuticos.

Análises recentes do transcriptoma da Alzheimer avançaram significativamente a compreensão de sua arquitetura genética e heterogeneidade molecular. O primeiro perfil de sequenciamento de RNA da DA revelou o aumento da expressão na via TREM-1 e na citocina^{IL-36 13}. A análise ponderada da rede de co-expressão gênica baseada no perfil de expressão gênica revelou ainda módulos moleculares distintos e genes centrales, como HSPA4, LCE3E e LCE3D, que orquestram respostas inflamatórias e queratinização, destacando potenciais alvos^{terapêuticos 14}. Esses estudos ressaltam o valor da transcriptômica multi-tecido e da modelagem de risco poligênica para refinar a previsão de doenças e revelar as complexas bases da DA. No entanto, estudos existentes têm focado predominantemente na transcriptômica geral da DA, sem resolver especificamente o papel dos genes mitocondriais na definição de subgrupos moleculares. O presente estudo avança além das análises transcriptômicas anteriores ao integrar múltiplos conjuntos de dados GEO para identificar subgrupos de AD baseados em agrupamento consensual e intersectar sistematicamente genes expressos diferencialmente, módulos WGCNA e um catálogo curado de genes mitocondriais para identificar genes mitocondriais centrais que definem a identidade de subgrupos e podem servir como novos biomarcadores.

Com a hipótese de que a pele lesional da Alzheimer possui subgrupos transcriptômicos molecularmente distintos caracterizados pela expressão diferencial de genes mitocondriais, o que pode fundamentar a heterogeneidade clínica da Alzheimer. Para testar isso, este estudo integrou dados de sequenciamento de RNA de estudos publicados e coletou dados de expressão gênica de amostras de pele de lesões de 266 pacientes com DA. Subgrupos moleculares foram identificados com base no agrupamento consensual da expressão gênica, e a expressão gênica foi comparada entre os dois subgrupos moleculares. Os genes que impulsionam essa diferença mostram enriquecimento funcional na sinalização celular e na fosforilação oxidativa. Além disso, foram examinados genes mitocondriais que diferenciam os dois grupos moleculares, e os principais genes hub foram identificados dentro de uma rede de interação proteína-proteína. Esses achados destacam a heterogeneidade genética da doença da DA, ampliando o conhecimento sobre os papéis das proteínas mitocondriais na patologia da DA.

Protocol

Este estudo utilizou conjuntos de dados de expressão gênica disponíveis publicamente do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Nenhum dado identificável pelo paciente foi acessado, e nenhuma nova amostra de pacientes foi coletada. Portanto, não foi necessária aprovação do conselho de revisão institucional (IRB) nem consentimento do paciente para essa análise secundária de dados públicos disponíveis. O software e os bancos de dados utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1 Dados e recursos

Os dados do transcriptoma de pacientes com dermatite atópica (DA) foram obtidos do banco de dados GEO, incluindo quatro estudos: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ e GSE277961 (N = 43)¹⁷. Todos os conjuntos de dados continham dados brutos ou pré-normalizados de contagem provenientes de biópsias cutâneas lesionais. Matrizes de contagem bruta foram baixadas e integradas entre os estudos. Os efeitos dos lotes de estudos cruzados foram corrigidos usando o método ComBat-seq (pacote sva R, v3.44.0) para harmonizar os perfis de expressão entre os quatro conjuntos de dados GEO antes da análise posterior. Todos os quatro conjuntos de dados são baseados em RNA-seq realizado em amostras de biópsia de pele humana e foram alinhados ao genoma de referência humano GRCh38 usando pipelines específicos para o estudo. A quantificação da expressão em nível gênico foi realizada usando a anotação gênica Ensembl (v105).

2 Agrupamento por consenso

O agrupamento consensual não supervisionado foi realizado usando o pacote Consensus ClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ para estratificar 266 amostras de pele lesional de pacientes com DA com base em perfis transcriptômicos. Antes do agrupamento, os dados brutos de contagem de todos os estudos foram combinados, e os efeitos de lote cruzados foram corrigidos usando a função removeBatchEffect do pacote limma. Os dados de expressão gênica foram então transformados por estabilização de variância (VST) usando DESeq2 e filtrados para reter os 5.000 genes mais variáveis do top. O agrupamento foi realizado usando agrupamento hierárquico com correlação de Pearson e ligação média em 1.000 iterações, subamostrando 80% das amostras por iteração. O melhor número de clusters (k variações de 2 a 10) foi determinado avaliando a função de distribuição cumulativa consensual (CDF), gráficos de área delta e escores de consenso por cluster. Os clusters resultantes foram validados usando mapas de calor consensuais e PCA e usados em análises biológicas e clínicas posteriores.

3 Análise diferencial de expressão gênica

Os níveis de expressão gênica foram comparados entre subgrupos moleculares usando o encapsulamento DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. Dados brutos de contagem foram inseridos para estimar a dispersão gene a gene e ajustados a um modelo binomial negativo. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados usando o teste de Wald, e os resultados foram filtrados usando um limiar de significância de valor p ajustado < 0,01 e variação absoluta de log2 vezes > 1.

4 Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos

A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) foi realizada usando o pacote clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. Todos os genes foram classificados pela variação log2 fold da análise de expressão diferencial, e a função GSEA foi aplicada com os parâmetros eps = 0, minGSSize = 10 e maxGSSize = 500, enquanto outras configurações foram mantidas no padrão. O enriquecimento foi realizado contra os conjuntos de genes MSigDB Hallmark. Para cada cluster molecular (Cluster 1 e Cluster 2), as três vias enriquecidas mais avançadas foram selecionadas com base no valor p nominal e na pontuação de enriquecimento normalizado (NES). Os resultados foram visualizados usando o pacote GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 Análise ponderada de redes de coexpressão gênica

O WGCNA foi realizado no perfil de expressão gênica de pacientes com DA para identificar módulos de co-expressão gênica associados à identidade de subtipo transcriptômico usando o pacote R WGCNA (v1.73)²². Os genes foram filtrados para manter os 75% superiores com a maior variância em todas as amostras. Uma rede de coexpressões com sinais foi construída usando uma potência de limiar suave selecionada de 1 a 30 para aproximar a topologia sem escala. Módulos gênicos foram identificados por agrupamento hierárquico e corte dinâmico de árvores. Associações módulo-traço foram estudadas correlacionando autogênios de módulos co-expressos com os rótulos de subtipos moleculares, e módulos que apresentassem correlação significativa (p < 0,05) com subtipo molecular foram selecionados para análise posterior.

6 Proteínas mitocondriais em subgrupos moleculares da Alzheimer

Para identificar genes associados à mitocondria dentro dos módulos DEGs e WGCNA, esses conjuntos de genes foram sobrepostos à lista curada de proteínas mitocondriais do MitoCarta3.0-23. Os genes que se cruzam foram considerados proteínas mitocondriais supostas relevantes para o contexto da doença da DA.

7 Ontologia genética e análise de enriquecimento KEGG

Identificar as principais funções celulares e processos biológicos que diferenciam subgrupos moleculares. Análises de enriquecimento GO e KEGG foram realizadas para genes associados à mitocondria usando clusterProfiler. O enriquecimento GO foi realizado separadamente para as categorias de Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF), utilizando a função enrichGO com OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "TODOS" e parâmetros padrão. O enriquecimento da via KEGG foi realizado usando a função enrichKEGG com o organismo definido como "has". Termos enriquecidos com valor p ajustado < 0,05 foram considerados significativos.

8 Redes de interação proteína-proteína

Os 85 DEGs e os genes mitocondriais sobrepostos do módulo associado ao DA foram consultados no banco de dados STRING (https://string-db.org)²⁴ para recuperar IBPs conhecidos e previstos. A análise de topologia de rede foi realizada usando sete medidas (Grau, Proximidade, Intermediedade, Autovetor, PageRank, Hub e Autoridades) para classificar a importância dos nós de cada proteína. Os 30 genes mais bem classificados de cada medida foram selecionados, e as interseções entre as sete abordagens foram visualizadas usando um gráfico UpSet. Os 4 genes intersectantes das medidas foram usados para construir um modelo de classificação baseado em seus níveis de expressão gênica. A precisão, sensibilidade, especificidade e área do modelo sob a curva ROC (AUC) foram calculadas para avaliar o desempenho da classificação.

9 Análise da regulação transcricional

O banco de dados hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ foi consultado para recuperar interações TF-alvo suportadas experimentalmente para quatro genes hub que se intersectam. A rede reguladora resultante do gene TF foi construída e visualizada usando os pacotes R igraph²⁶ e ggraph²⁷ .

10 Análise de infiltração de células imunes de RNA-seq em bulk

O algoritmo^{CIBERSORT 28} (https://cibersort.stanford.edu/) foi usado para estimar as proporções relativas de 22 tipos de células imunes em dados de transcriptoma de pele lesional. Dados normalizados de expressão gênica foram inseridos no CIBERSORT (v0.1.0) junto com a matriz de assinatura LM22. A análise foi realizada com 1.000 permutações e a normalização de quantis desativada. Amostras com valores p de saída CIBERSORT < 0,05 foram consideradas para análise downstream. As frações estimadas de células imunes foram comparadas entre subgrupos moleculares usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon com correção FDR para comparações múltiplas entre os 22 tipos de células imunes (p.adajust.method = "FDR"), e os resultados foram visualizados com boxplots usando o pacote ggplot2²⁹ R.

Results

Subgrupos transcricionais na dermatite atópica

Dados de RNA-seq de 266 amostras de pacientes com DA foram analisados para investigar a heterogeneidade transcricional dentro da doença. Após controle de qualidade e correção para efeitos de lote em múltiplos estudos, o agrupamento consensual não supervisionado revelou dois subgrupos moleculares distintos (Figura 1A). A estabilidade do cluster e o número ótimo de cluster foram avaliados usando o gráfico da função de distribuição cumulativa (CDF) (Figura 1B), gráfico da área delta (Figura 1C) e mapa de calor da matriz de consenso (Figura 1D). Juntos, esses resultados apoiam a existência de dois subtipos transcricionais robustos na DA, refletindo a heterogeneidade genética subjacente.

Genes diferencialmente expressos entre subgrupos da Alzheimer

O gráfico t-SNE baseado na matriz de expressão gênica normalizada validou ainda mais os subgrupos transcricionais identificados por agrupamento por consenso. O gráfico t-SNE revelou dois clusters bem separados, cada um correspondendo a um dos subgrupos previamente definidos (Figura 2A), apoiando a presença de perfis moleculares distintos entre pacientes com DA. A expressão diferencial entre os dois subgrupos foi então analisada usando DESeq2, com um limiar de p < ajustado de 0,01 e |log₂ de variação de folds| > 1. O gráfico vulcânico resultante (Figura 2B) mostrou genes (DEGs) expressos diferencialmente, indicando forte divergência transcricional. Os 10 genes mais regulados para cima são ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN e AHNAK no cluster 1 e C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D e PMPCA no cluster 2 (Figura 2C).

Subgrupo de DA associado ao conjunto genético

A Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos (GSEA) revelou perfis distintos de enriquecimento funcional entre os dois clusters transcriptômicos (Figura 3A). O Cluster 1 apresentou enriquecimento significativo para vias envolvidas na sinalização e adesão celular, incluindo adesão focal (Figura 3B) e via de sinalização MAPK (Figura 3C), sugerindo um estado ativo caracterizado por interações aprimoradas entre célula e célula extracelular e proliferação. Em contraste, o Cluster 2 apresentou forte enriquecimento para fosforilação oxidativa (Figura 3D) e função proteassoma (Figura 3E), sugerindo um fenótipo metabólico oxidativo e proteolítico ativo.

Genes co-expressos em grupos moleculares da Alza de Alzheimer

Para identificar módulos de coexpressão associados a subtipos transcriptômicos, o WGCNA foi realizado após o pré-processamento dos dados. Amostras atípicas foram inicialmente identificadas e removidas com base no agrupamento hierárquico das distâncias amostrais para garantir a robustez da construção da rede a jusante (Figura 4A). Uma potência de limiar suave foi então selecionada usando o critério de topologia livre de escala, com uma potência de 6 escolhida para alcançar um R² > sem escala de 0,85 (Figura 4B). Módulos gênicos foram identificados por meio de agrupamento hierárquico e corte dinâmico de árvores, seguidos por agrupamento autogênico para fundir módulos intimamente relacionados (Figura 4C e Figura 4D). A rede gênica resultante foi visualizada usando um mapa de calor de sobreposição topológica, confirmando a presença de padrões distintos de co-expressão gênica (Figura 4E). A análise de relação módulo-traço revelou uma correlação forte e significativa entre o módulo MEyellow (_gene N = 743) e o subgrupo molecular (Figura 4F).

Enriquecimento funcional do subgrupo da Alzheimer associada aos genes mitocondriais

A análise de enriquecimento GO e KEGG foi então realizada nos genes intersectados (N = 85) entre os DEGs, genes do módulo MEyellow e uma lista de proteínas mitocondriais do MitoCarta3.0 (Figura 5A) para investigar os papéis funcionais dos genes associados à mitocondria que impulsionam as diferenças transcricionais entre clusters. A análise das vias KEGG identificou enriquecimento em vias de fosforilação oxidativa e metabólica (Figura 5B). A análise de enriquecimento GO revelou uma super-representação significativa de termos associados à função mitocondrial, incluindo síntese de ATP mitocondrial impulsionada pela força motriz de prótons, complexo de cadeia respiratória e atividade de NADH desidrogenase (Figura 5C), sugerindo que esses genes estão principalmente associados ao metabolismo e regulação da energia mitocondrial.

Genes mitocondriais hub na diferenciação molecular da DA

Para identificar os genes-chave nos 85 genes associados ao subgrupo do transcriptoma mitocondrial, foi construída uma rede de IBP (Figura 6A). Com base na classificação em cada uma das sete medidas topológicas (veja métodos), os 30 melhores genes foram selecionados, e suas interseções analisadas e visualizadas em um gráfico UpSet (Figura 6B). Essa análise resultou em quatro genes hub consistentemente identificados como nós centrais com base em todos os critérios de classificação (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). Seus perfis de expressão foram examinados nos dois clusters transcriptômicos e constataram que todos os quatro genes hub estavam significativamente regulados para cima no Cluster 1 em comparação com o Cluster 2 (Figura 6C). A análise de correlação de expressão gênica par a par mostrou correlações positivas entre os quatro genes, indicando regulação coordenada, com CHCHD5 e ISOC2 apresentando a correlação mais forte (Figura 6D). Além disso, um modelo de classificação que construímos usando a expressão desses quatro genes demonstrou poder discriminatório robusto entre os dois clusters, com a curva ROC mostrando uma área sob a curva (AUC) > 0,7 (Figura 6E). Além disso, foi realizada uma análise de rede regulatória por fatores de transcrição (TF) para estudar os mecanismos regulatórios que regem a expressão dos quatro genes hubs identificados. Todos os fatores de transcrição conhecidos e previstos que potencialmente regulam esses genes hubs foram consultados a partir do hTFtarget, e os resultados foram integrados e visualizados como uma rede reguladora transcricional (Figura 7). Na rede reguladora do gene TF-hub, o BAD teve o maior número de TFs, e ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA interagiram com os quatro genes hub, sugerindo um mecanismo regulatório compartilhado.

Comparação da infiltração de células imunes entre subgrupos da Alzheimer

Para investigar o cenário imunológico associado aos subgrupos transcriptômicos, foi realizada uma análise de infiltração de células imunes usando o CIBERSORT, que estima as proporções relativas de 22 tipos de células imunes com base em dados de transcriptoma em massa (Figura 8). Entre os subconjuntos imunológicos, as células T regulatórias (Tregs) foram significativamente mais abundantes no Cluster 1, sugerindo um microambiente imunossupressor potencialmente associado à atividade mitocondrial e vias de sinalização com regulação máxima nesse grupo. Em contraste, as células T auxiliares foliculares foram significativamente enriquecidas no Cluster 2, indicando uma resposta imune adaptativa potencialmente mais ativa nesse subgrupo.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os dados transcriptômicos analisados neste estudo estão disponíveis publicamente no repositório Gene Expression Omnibus (GEO) sob os números de acesso GSE121212, GSE157194, GSE193309 e GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Figura 1: Agrupamento consensual de amostras de lesão de dermatite atópica com base em perfis transcriptômicos. (A) Mapa de calor e agrupamento hierárquico da matriz de consenso entre amostras de dermatite atópica (DA). (B) Gráfico consensual da função de distribuição cumulativa (CDF) usado para determinar o número ótimo de agrupamentos (k = 2–10). (C) Gráfico de área delta mostrando a variação relativa da área sob a curva CDF para cada k. (D) Atribuição consensual de agrupamento para k = 2. Cada coluna representa uma amostra individual, e as cores indicam a pertença ao cluster (Cluster 1, vermelho; Cluster 2, verde-azulado). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Expressão diferencial gênica de subtipos moleculares de dermatite atópica. (A) gráfico de imersão estocástica de vizinhos (t-SNE) distribuído por t (t-SNE) de amostras de AD. Cada ponto representa uma amostra projetada em duas dimensões e é colorido de acordo com a atribuição de clusters. (B) Gráfico vulcânico de genes diferencialmente expressos (DEGs) entre o Cluster 1 e o Cluster 2. Cada ponto representa um gene, representado por log2 de variação de vezes (eixo x) e −log10 valor p ajustado (eixo y). Pontos vermelhos e azuis indicam genes significativamente aumentados no Cluster 1 e no Cluster 2, respectivamente, enquanto pontos cinzentos indicam genes não significativos. (C) Mapa de calor dos 10 genes mais altamente expressos no Cluster 1 e no Cluster 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos de subtipos moleculares de dermatite atópica. (A) Gráfico de barras bilateral mostrando os resultados do GSEA entre o Cluster 1 e o Cluster 2, com as vias superiores significativamente enriquecidas. As vias enriquecidas no Cluster 1 são mostradas à direita, e as enriquecidas no Cluster 2 à esquerda. (B–E) Gráficos representativos de enriquecimento para adesão focal, via de sinalização MAPK, fosforilação oxidativa e vias de proteasoma. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Análise ponderada da rede de coexpressão gênica de amostras de dermatite atópica. (A) Agrupamento de amostras de dendrograma baseado em perfis de expressão gênica. (B) Índice de ajuste e conectividade média de topologia livre de escala entre potências de limiar suave (1–30). (C) Agrupamento e mapa de calor dos autogênios dos módulos, com cores indicando correlações par a par. (D) Dendrograma de agrupamento hierárquico mostrando genes agrupados em módulos co-expressos. (E) Mapa de calor da matriz de sobreposição topológica (TOM), representando similaridade de co-expressões entre pares de genes. (F) Mapa de calor das relações módulo–traço, mostrando correlações entre autogênios do módulo e características clínicas. Coeficientes de correlação são exibidos dentro de cada célula, e a intensidade da cor indica a intensidade e a direção da correlação (vermelho, positivo; azul, negativo). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Ontologia gênica e enriquecimento da via KEGG de genes mitocondriais associados a subtipos. (A) Diagrama de Venn mostrando sobreposição entre DEGs, genes de módulos associados a subtipos e genes mitocondriais. (B) Gráfico de bolhas das 20 principais vias KEGG enriquecidas de genes que se intersetam. (C) Os 10 principais termos de Ontologia Genética Enriquecida (GO) para Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF). Todas as análises de enriquecimento foram realizadas usando um valor p ajustado < 0,05 (taxa de falsa descoberta) como limiar de significância. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Análise de interação proteína-proteína e identificação de genes hub. (A) Rede de interação proteína-proteína (PPI) de 85 genes que se intersetam. Nós representam proteínas, e arestas indicam interações previstas ou validadas experimentalmente a partir do banco de dados STRING. (B) Gráfico UpSet mostrando interseções entre os 30 genes mais ranqueados com base em sete medidas de centralidade de rede. (C) Diagramas de caixa mostrando níveis de expressão de quatro genes hub no Cluster 1 e Cluster 2. (D) Análise de correlação par a par entre os quatro genes hub. (E) Curva característica operacional do receptor (ROC) mostrando desempenho de classificação, com sensibilidade plotada em função da especificidade. A área sob a curva (AUC) indica precisão geral. A significância estatística no painel (C) foi avaliada usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon (*p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Rede reguladora de genes hub. Círculos vermelhos representam genes hub e círculos azuis representam fatores de transcrição associados (TFs). As bordas indicam interações regulatórias. O tamanho de cada nó central reflete o número de TFs interagindo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Comparação da infiltração de células imunes entre subgrupos de dermatite atópica. Diagramas de caixa mostrando as proporções estimadas de 22 tipos de células imunes em cada grupo (Cluster 1, vermelho; Cluster 2, verde-azulado). Asteriscos (*) indicam diferenças estatisticamente significativas entre agrupamentos, avaliadas usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon com correção de taxa de descoberta falsa para comparações múltiplas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

A dermatite atópica é um distúrbio inflamatório da pele prevalente e geneticamente heterogêneo, apresentando desafios significativos para estratégias de tratamento personalizadas. Este estudo fornece insights sobre a heterogeneidade molecular da DA, identificando dois subgrupos transcricionais distintos em 266 amostras de pele lesional de pacientes com DA. Esses subgrupos apresentam diferentes enriquecimentos biológicos e infiltração de células imunes, com o Cluster 1 caracterizado por vias ativas de sinalização e adesão celular e um enriquecimento de células T reguladoras (Tregs), enquanto o Cluster 2 é definido pelo aumento da fosforilação oxidativa e da função dos proteassomas, juntamente com um aumento das células T auxiliares foliculares. Importante destacar que quatro genes associados à mitocondria (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2) foram identificados e que apresentam regulação positiva no Cluster 1. Eles são genes centrais na rede PPI de 85 genes que definem os dois subtipos transcriptômicos e podem ser regulados simultaneamente por fatores de transcrição, incluindo ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA.

Os dois agrupamentos distintos foram identificados com base no padrão de expressão gênica, o que sugere que a Alzheimer apresenta uma heterogeneidade significativa na expressão gênica. Estudos anteriores mostraram que essa heterogeneidade pode ser impulsionada por mecanismos genéticos, epigenéticos e imunológico que definem endotipos moleculares^{distintos 5,30,31}. Entre os dois agrupamentos, também foi observada infiltração de células imunes diferentes, cluster 1 caracterizado por células T reguladoras e cluster 2 enriquecido com células T auxiliares foliculares (Tfh), implicando heterogeneidade imunológica subjacente e mecanismos potencialmente diferentes da doença na coorte da DA. Um agrupamento dominado por Treg sugere um ambiente imunológico onde mecanismos regulatórios são proeminentes, possivelmente refletindo tentativas de controlar a inflamação ou uma resposta compensatória à ativação imunológica^{crônica 32,33}. No entanto, na DA, a função do Treg pode ser prejudicada apesar do aumento dos números, o que pode não suprimir efetivamente a inflamação. Em contraste, um agrupamento enriquecido com Tfh aponta para um aumento da ajuda das células B, aumento da atividade germinal e provável aumento da produção de IgE, que são marcas de respostas alérgicas e formas mais graves ou extrínsecas de AD^34,35. Sabe-se que as células TFH suportam diferenciação de células B e troca de classe de anticorpos, e sua expansão está correlacionada com a atividade da doença e sensibilização^{alérgica 36}. A presença desses agrupamentos distintos pode refletir diferentes fenótipos clínicos, gravidades da doença ou respostas à terapia, e destaca a importância de abordagens personalizadas na pesquisa e tratamento da DA.

Sabe-se que a disfunção mitocondrial desempenha um papel significativo na patogênese da Alzheimer por meio de mecanismos como a manutenção da barreira^{epidérmica 37}, a produção de espécies reativas de oxigênio³⁸ e a regulação da resposta imunocelular³⁹. Quatro proteínas mitocondriais foram identificadas como nós centrais dos genes associados à diferenciação transcriptômica, que podem prever o subtipo molecular com alta precisão (AUC>0,7). Embora nenhum estudo anterior tenha demonstrado a ligação direta desses genes com a DA, esses resultados sugerem que eles são potenciais biomarcadores para estratificar pacientes com DA e avaliar a disfunção mitocondrial em pacientes com EA. BAD (agonista associado à BCL2 da morte celular) é um membro pró-apoptótico da família BCL-2 envolvido na sinalização apoptótica mitocondrial; sua regulação para cima no Cluster 1 pode refletir o aumento do esforceamento apoptótico mitocondrial nesse subtipo. BOLA1 é uma proteína mitocondrial implicada na biogênese de aglomerados ferro-enxofre e na regulação do estresse oxidativo. CHCHD5 (domínio helicoil-helix-coiled-coiled-helix contendo 5) é uma proteína da membrana interna mitocondrial associada à organização das cristas e à eficiência da cadeia de transporte de elétrons. ISOC2 (domínio isocorismatase contendo 2) tem sido associado a processos metabólicos e função mitocondrial. A regulação para cima coordenada desses quatro genes no Cluster 1 sugere um estado de atividade metabólica mitocondrial elevada e sinalização apoptótica nesse subgrupo da DA.

Este estudo apresenta várias limitações. Embora este estudo tenha identificado dois subgrupos moleculares com expressão gênica distinta em genes mitocondriais e infiltração de células imunes separadas, carecemos de dados clínicos detalhados de fenótipos que nos permitam correlacionar a estratificação com a gravidade da doença e respostas longitudinais ao tratamento. Para compreender completamente o que significa a alta expressão desses quatro genes hub no Cluster 1, estudos futuros devem integrar metadados clínicos abrangentes e, idealmente, realizar validação funcional em modelos de queratinócitos ou camundongos. Além disso, este estudo depende de dados públicos disponíveis em RNA-seq em massa; Embora seja poderosa em análises em larga escala, carece de resolução em tipos celulares específicos. Essa limitação dificulta determinar se a expressão diferencial observada de genes mitocondriais se origina de queratinócitos, células imunes infiltradas ou outras populações celulares residentes na pele. Com o amplo uso de abordagens transcriptômicas unicelulares e espaciais, pesquisas futuras se beneficiariam muito do poder de desconvolução dos sinais de expressão e fornecer uma visão mais precisa do perfil transcriptômico no nível celular. Além disso, todos os dados foram obtidos a partir de amostras de biópsia por punção, que amostram pele de espessura total. Estudos futuros que incorporem RNA-seq em tiras de fita podem oferecer uma abordagem complementar não invasiva para perfilar o transcriptoma epidérmico superficial e poderiam validar as assinaturas de subgrupos identificadas em um ambiente minimamente invasivo. A futura integração de RNA-seq de célula única e dados transcriptômicos espaciais avançaria ainda mais a resolução das assinaturas mitocondriais específicas do tipo celular na pele de DA.

Em conclusão, este estudo examinou a heterogeneidade transcriptômica da Alzheimer em 266 amostras, identificou genes mitocondriais-chave e infiltração única de células imunológicas, diferenciando os subgrupos. Esses achados melhoram a compreensão da heterogeneidade molecular da Alzheimer e destacam o potencial para o desenvolvimento de abordagens de tratamento de precisão baseadas em perfis moleculares específicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIBERSORT	Universidade de Stanford	v0.1.0; deconvolução de células imunológicas; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Biocondutor	v4.12.6; análise de enriquecimento GSEA e GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Biocondutor	v1.64.0; agrupamento consensual não supervisionado; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Biocondutor	v1.46.0; análise diferencial de expressão gênica; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Omnibus de Expressão Gênica (GEO)	NCBI	repositório público de dados transcritômicos; conjuntos de dados GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	visualização de dados; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Visualização de grafos e redes; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; visualização GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Universidade de Ciência e Tecnologia Huazhong	banco de dados alvo de fatores de transcrição humanos; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	construção e visualização de rede; https://igraph.org
limma	Biocondutor	removeBatchEffect funcionando; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Instituto Broad	Banco de dados curado de proteínas mitocondriais; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (Conjuntos de genes Hallmark)	Instituto Broad	Banco de dados de conjuntos gênicos para GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Biocondutor	banco de dados de anotação do genoma humano; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	Equipe Principal R	Ambiente de computação estatística; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; banco de dados de interação proteína-proteína; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Biocondutor	v3.44.0; correção de efeitos em lote; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; análise ponderada de redes de co-expressão gênica; https://cran.r-project.org/package=WGCNA