Um Estudo de Randomização Mendeliano de Características das Células Imunológicas e Metabólitos Plasmáticos na Tireoidite de Hashimoto

Resumo

Utilizando análises de randomização e mediação mendelianas com duas amostras, este estudo identifica 32 fenótipos de células imunológicas e 9 metabólitos plasmaticamente associados causalmente à tireoidite de Hashimoto e apoia um eixo imunometabólico parcial CD39+Treg-isovalerilcarnitina (C5)-HT. Citometria de fluxo preliminar e dados metabolômicos fornecem plausibilidade biológica inicial consistente com essa via.

Resumo

A tireoidite de Hashimoto (TH) é um distúrbio autoimune da tireoide. Embora as células imunes estejam implicadas em sua patogênese, seus papéis específicos ainda não foram totalmente esclarecidos. Foi realizada uma análise de randomização mendeliana (RM) em duas amostras, integrando estatísticas resumidas do estudo de associação genômica ampla (GWAS) de grandes conjuntos de dados públicos para características das células imunológicas (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121), metabólitos plasmaticos (GCST90199621-9020102) e HT (ebi-a-GCST90018855). Os efeitos causais foram estimados usando métodos ponderados pela inversa da variância (IVW), com análises MR-Egger, mediana ponderada e leave-one-out para avaliar pleiotropia e robustez. Análises bidirecionais e de mediação por RM foram aplicadas para testar a direcionalidade e identificar possíveis vias mediadas por metabólitos. Células de Treg CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ foram quantificadas em amostras de sangue periférico usando citometria de fluxo. A isovalerilcarnitina (C5) foi medida por cromatografia líquida espectrometria de massa em tandem. A análise de IVW identificou 32 fenótipos de células imunes significativamente associados ao risco de TH (P < 0,05 após a correção de FDR). A análise reversa por ressonância magnética demonstrou que a TH estava positivamente associada causalmente a 2 características imunes, enquanto 4 características imunes (todas P < 0,05) estavam inversamente associadas à TH. As análises de sensibilidade não revelaram pleiotropia horizontal ou heterogeneidade. Além disso, o método de VV identificou preliminarmente 9 metabólitos plasmáticos como causalmente relacionados à TH, incluindo C5 que aumenta o risco (OR = 1,120, IC 95%: 1,032-1,215, P = 0,006) e ergotioneína protetora (OR = 0,958, IC 95%: 0,927-0,990, P = 0,010). A mediação por ressonância magnética em duas etapas identificou C5 como um candidato a mediador conectando CD3⁺ CD39⁺ Treg a HT (proporção de mediação 8,89%, IC 95%: 2,34%-15,4%, P = 0,008). Citometria de fluxo elevou níveis de CD39⁺Treg e C5 plasmático em pacientes com TH, com C5 positivamente correlacionado com a proporção de células CD39⁺Treg. Este estudo estabelece novas ligações causais entre fenótipos das células imunes e a HT, e destaca metabólitos plasáticos, especialmente o C5, como potenciais mediadores na patogênese da HT. Esses achados aprofundam a compreensão mecanicista da doença autoimune da tireoide e podem orientar a descoberta futura de biomarcadores e alvos terapêuticos.

Introdução

A tireoidite de Hashimoto (TH) é uma doença autoimune comum na qual o sistema imunológico ataca a glândula tireoide, resultando em hipotireoidismo ^1,2. Estudos recentes relataram um aumento anual constante na incidência de TH. Na China, estima-se que sua prevalência varie de 0,2% a 1,3^%. A causa exata da TH é desconhecida, embora se acredite que sua patogênese inclua uma complexa interação de componentes genéticos, ambientais e do sistema^{imunológico 4,5}.

O desenvolvimento da TH é fortemente influenciado pelo sistema^{imunológico 6,7,8}. Respostas imunes aberrantes visam o tecido tireoidiano, desencadeando a produção de autoanticorpos, incluindo peroxidase antitireoidiana (anti-TPO) e anti-tireoglobulina (anti-Tg⁾⁹. Esses autoanticorpos interagem com as células tireoidianas, induzindo morte celular imunomediada e reações inflamatórias, resultando em função tireoidial^{comprometida 10}. As vias patogênicas específicas, especialmente os sinais metabólicos que impulsionam a disfunção das células imunológicas, ainda não são totalmente compreendidas. As células T regulatórias (Tregs), especialmente aquelas que expressam CD39, desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância imunológica ao hidrolisar ATP extracelular em adenosina imunossupressora. Perturbações na função do Treg ou em seu ambiente metabólico podem levar à quebra da autotolerância, mas a relação causal entre subconjuntos específicos de Treg e o HT ainda precisa ser^esclarecida 11,12,13,14,15,16.

Estudos observacionais tradicionais são frequentemente limitados por variáveis de confusão e pelo potencial de causalidade reversa, o que complica a capacidade de determinar relações causais definitivas entre fenótipos de células imunes e HT¹⁷. Além disso, como a TH é uma doença sistêmica influenciada por vários subconjuntos imunes e intermediários metabólicos, um foco restrito em candidatos individuais pode deixar de lado novos fatores^{patogênicos 18}. Portanto, é necessário um método de triagem em larga escala para fornecer um panorama imparcial e abrangente dos fatores imunometabólicos que contribuem para a TH. Avanços recentes em estudos de associação genômica ampla (GWAS) forneceram dados abrangentes sobre fenótipos de células imunológicas e metabólitos plasmáticos, abrindo novas vias para explorar os mecanismos subjacentes da HT¹⁹. A randomização mendeliana (RM) segue os princípios da atribuição aleatória de gametas mendelianos e combinações livres¹⁶ e o uso de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) como variáveis instrumentais (IVs) para inferir potenciais efeitos causais das exposições nos^{desfechos 20,21}. Esse método ajuda a mitigar a influência dos fatores de confusão e a causalidade reversa, que frequentemente complicam os estudos observacionais^{tradicionais 16,22}.

À luz desses desenvolvimentos, o objetivo deste estudo é duplo. Primeiro, foi realizada uma análise exploratória geradora de hipóteses utilizando uma estrutura de ressonância magnética com duas amostras para triar sistematicamente 731 fenótipos de células imunológicas e 1.400 metabólitos plasmaticais, identificando novos fatores de risco candidatos para a TH. Segundo, foi feita uma transição para uma investigação baseada em hipóteses para avaliar o papel mediador específico dos metabólitos identificados, como a isovalerilcarnitina, na via que liga as células T reguladoras ao risco de HT. Portanto, este estudo integra triagem de RM em larga escala com análise de mediação e validação clínica preliminar para fornecer evidências geneticamente sustentadas consistentes com um suposto arcabouço imunometabólico (Treg–metabólito–HT), ao mesmo tempo em que enfatiza a natureza exploratória desses achados. Ao identificar essas cadeias causais precisas, novas perspectivas sobre a regulação metabólica da autoimunidade tireoidiana são fornecidas, juntamente com candidatos robustos para futuras alvos terapêuticos.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Afiliado da Universidade Médica da Mongólia Interior. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e as diretrizes éticas relevantes. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes do início de qualquer procedimento relacionado ao estudo. Este estudo incluiu dois grupos de participantes: o grupo da tireoidite de Hashimoto (HT, n = 10) e o grupo controle saudável (Saudável, n = 10). Os dois grupos foram pareados por idade e sexo. Todas as amostras de sangue periférico foram coletadas de ambulatoriais ou de indivíduos que passaram por exames de saúde de rotina, com coleta de sangue pela manhã após um jejum noturno.

Desenho do estudo

Neste estudo, foram empregadas uma análise de ressonância magnética com duas amostras e uma análise de mediação para avaliar a relação causal entre 731 fenótipos de células imunes (7 grupos) e a TH, e exploraram o papel modulador potencial dos metabólitos plasmáticos nessa relação. O fluxo de trabalho analítico consistiu em 5 etapas sequenciais: (1) seleção de conjuntos de dados GWAS de exposição para fenótipos imunológicos; (2) seleção do conjunto de dados GWAS para a HT; (3) identificação e harmonização de variáveis instrumentais; (4) análise primária de ressonância magnética com duas amostras e validação bidirecional; e (5) análise de ressonância magnética em duas etapas de mediação. Uma visão geral esquemática do desenho do estudo é apresentada na Figura Suplementar 1. Na análise por RM, variantes genéticas servem como proxies para exposições modificáveis. Para uma inferência causal válida, as variáveis instrumentais (IVs) devem satisfazer três critérios fundamentais: (1) elas estão fortemente associadas à exposição de interesse; (2) eles são independentes de quaisquer fatores de confusão que possam influenciar tanto a exposição quanto o resultado; e (3) eles afetam o resultado unicamente por meio da exposição, sem vias causais alternativas.

GWAS da fonte de dados HT

Para garantir compatibilidade de conjuntos de dados e minimizar a estratificação populacional, todas as estatísticas resumidas GWAS foram derivadas principalmente de indivíduos de ascendência europeia. O banco de dados GWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/) fornecia os dados de resultados do HT, e o conjunto de dados ebi-a-GCST90018855 era utilizado. O estudo realizou GWAS em 395.640 europeus (_caso N = 15.654,_controle N = 379.986), após controle de qualidade e interpolação, 24.146.037 SNPs foram analisados. Para confundidores específicos de HT (por exemplo, gênero, idade), o GWAS original (ebi-a-GCST90018855) incluía essas covariáveis em seus modelos, como padrão nos pipelines do GSAS.

Fontes de dados GWAS para células imunes

Estatísticas resumidas para GWAS relacionadas a características das células imunes foram obtidas do Catálogo GWAS, abrangendo conjuntos de dados com números de acesso de ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121 (disponíveis em https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Um total de 731 fenótipos imunológicos foram incluídos na análise, incluindo a contagem relativa de células (n = 192), parâmetro morfológico (MP) (n = 389), coeficientes de ativação (AC, n = 118) e intensidade média de fluorescência (MFI, n = 389) representando o grau de antígeno^{de superfície 23}. O impacto de quase 22 milhões de polimorfismos em 731 fenótipos de células imunes em 3757 sardos foi documentado pelo GWAS inicial nas células imunes.

Fontes de dados GWAS para metabólitos plasmáticos

Os dados resumidos do GWAS para um total de 1.400 metabólitos plasmáticos foram retirados do Catálogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020), que compreende 1.091 concentrações individuais de metabólitos e 309 características da razão metabólica. Os conjuntos de dados GWAS utilizados para análise de ressonância magnética no presente estudo foram derivados de indivíduos de ascendência europeia. Características detalhadas dos dados GWAS do metabólito plasmático utilizados são fornecidas na Tabela Suplementar 1.

Os conjuntos de dados GWAS para fenótipos de células imunológicas (coorte sarda), HT (FinnGen/EBI-a-GCST90018855) e metabólitos plasmáticos (coortes europeias) são independentes, sem sobreposição amostrável, conforme confirmado pelas respectivas publicações do consórcio. Isso satisfaz a suposição de independência para a RM com duas amostras.

Seleção de variáveis instrumentais (IVs)

Assumiu-se que os IVs estavam fortemente associados à exposição, permanecendo independentes das variáveis de desfecho. Além disso, apenas o fator de exposição foi hipotetizado como tendo efeito direto no resultado. Para identificar IVs apropriados, SNPs associados aos fatores de exposição foram selecionados com um nível de significância definido em 5 × ^10-8. Para considerar o desequilíbrio de ligação (LD), os SNPs foram agrupados usando um limiar de R² de 0,001 dentro de uma janela de 10.000 kilobases (kb). Variantes que apresentavam R² > 0,001 em pares dentro dessa distância foram excluídas para garantir a independência das variáveis instrumentais selecionadas e eliminar possíveis correlações de LD. Testes de heterogeneidade excluíram SNPs significativamente heterogêneos com estatística F < 10. Por fim, para controlar o efeito dos fatores de confusão sobre os IVs, P < 1×^10-5 foi tomado para eliminar SNPs palindrômicos e SNPs incompatíveis, e SNPs válidos foram mantidos como variáveis instrumentais.

Análise de randomização mendeliana em duas amostras

Para avaliar a relação causal bidirecional entre fenótipos das células imunológicas e a TH, foram realizadas análises de randomização mendeliana (RM) com duas amostras e análises de RM de mediação. Especificamente, a RM com duas amostras foi aplicada para avaliar múltiplas características relacionadas às células imunológicas. Para essas análises, foram empregados vários métodos complementares de RM, incluindo ponderação inversa de variância (IVW⁾²⁴, regressão^{MR-Egger 25}, estimador mediano ponderado (WME⁾²⁶, estimação simples^{baseada em modos 27} e estimativa baseada em modos ponderados. Entre essas, a VV foi designada como a principal abordagem analítica, com significância estatística definida como P < 0,05. O método IVW foi selecionado como o principal estimador de RM devido ao seu equilíbrio ótimo entre precisão e suposição de pleiotropia balanceada. O método IVW aprimora a precisão ao atribuir maior peso a SNPs com variâncias menores, produzindo assim estimativas causais mais confiáveis. A regressão de MR-Egger foi usada para avaliação de pleiotropia, um processo no qual os genes influenciam múltiplos fenótipos. Se o intercepto indicou que não houve pleiotropia horizontal significativa (P > 0,05), essa abordagem combinou a avaliação do intercepto para determinar a pleiotropia. A heterogeneidade foi avaliada usando a estatística Q dos métodos MR-Egger e IVW, que mede até que ponto a variação genética afeta o fenótipo, caso P > 0,05 indique que não há heterogeneidade significativa nos efeitos da variação genética. Limiares ajustados por Bonferroni foram aplicados para considerar 731 fenótipos imunes (P < 6,84 × 10⁻⁵) e 1.400 metabólitos (P < 3,57 × 10⁻⁵). Resultados significativos sobreviveram à correção, salvo indicação em contrário. Além disso, a causalidade reversa foi avaliada usando o mesmo método de RM para investigar se as características das células imunes eram afetadas pela TH. No estudo de ressonância magnética reversa, a TH foi considerada o fator de exposição e diferentes características das células imunológicas foram consideradas como resultado.

Neste estudo, a análise de mediação foi realizada utilizando uma estrutura de ressonância magnética em duas etapas para explorar se os metabólitos plasmáticos atuam como intermediários na via causal que liga os fenótipos das células imunes à HT. Essa abordagem permite que o efeito causal total dos fenótipos das células imunológicas sobre a TH seja dividido em um efeito direto e um efeito indireto transmitido através dos intermediários metabólicos identificados. O efeito total das células imunes sobre a TH foi inicialmente estimado, seguido pelo efeito das células imunes sobre metabólitos (β1), o efeito dos metabólitos sobre a TH (β2) e o efeito mediador (β1*β2), com o efeito direto calculado como o efeito total menos o efeito mediador. Efeito total (_{β total}) = Efeito direto (β_direto) + Efeito indireto (β_indireto); Efeito indireto = β1 × β2; Proporção mediada (%) = (β1 × β2)/β total × 100%, onde β1 é o efeito causal do fenótipo da célula imune sobre o metabólito plasmático, e β2 é o efeito causal do metabólito plasmático sobre a TH. O método delta foi usado para estimar intervalos de confiança de 95% para o efeito indireto. Além disso, foi realizada uma análise de RM intermediária reversa para investigar os efeitos causais da TH sobre metabólitos e metabólitos nas células imunes, a fim de complementar os resultados da RM direta e aumentar a confiabilidade da inferência causal. Todas as análises foram realizadas por um ambiente de computação estatística e pacotes de software relacionados a RM, que estão listados na Tabela de Materiais.

Detecção de Treg 3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺

50 μL de sangue total anticoagulado foram cuidadosamente misturados em um tubo de ensaio com 10 μL de anticorpos monoclonais CD3, CD4, CD25 e CD39 direcionados. A mistura foi protegida da luz e mantida em temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente, foram adicionados 2 mL de uma solução FACS Lysing diluída 1:10. O tubo foi incubado por mais 10 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz durante a lise. O tubo foi centrifugado a ~300 x g por 5 minutos, e o sobrenadante foi removido. Após adicionar 2 mL de solução tampão de fosfato (PBS), o tubo foi novamente centrifugado a ~300 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e 500 μL de PBS foram adicionados para detecção. A detecção foi realizada usando um citômetro de fluxo multi-laser e analisada pelo software de aquisição e análise correspondente para obter a proporção de CD3⁺CD4⁺CD25⁺Tregs e o subconjunto que expressa CD39 (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Tregs).

Medição dos níveis de Isovalerilcarnitina (C5)

Os dados sobre os níveis de C5 dos pacientes foram obtidos no Departamento de Laboratório Clínico do Hospital da Universidade Médica da Mongólia Interior. Especificamente, o C5 foi medido como parte da cromatografia líquida–espectrometria de massa em tandem rotineira (LC–MS/MS), seguindo procedimentos laboratoriais padronizados e protocolos de controle de qualidade.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando um ambiente de software estatístico. Variáveis contínuas foram comparadas usando o teste t de Student para dados normalmente distribuídos ou o teste de soma de ranks de Wilcoxon para dados não distribuídos normalmente. Variáveis categóricas foram analisadas usando o teste do qui-quadrado. A análise de correlação de Pearson foi usada para conduzir uma análise de correlação. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Efeitos causais genéticos dos fenótipos das células imunológicas na TH

Após a exclusão de possíveis fatores de confusão e a ausência de pleiotropia horizontal (P > 0,05), foi realizada uma análise de ressonância magnética com duas amostras para avaliar os efeitos causais dos fenótipos das células imunes sobre o risco de TH. Para cada fenótipo de célula imunológica usado como exposição, a estatística F foi calculada para avaliar a força das variáveis instrumentais. Todos os instrumentos ultrapassaram o limiar convencional de F > 10, indicando um viés mínimo fraco do instrumento. Estatísticas detalhadas para os principais traços imunes discutidos no texto principal são fornecidas na Tabela Suplementar 2. No total, 32 fenótipos relacionados ao sistema imunológico demonstraram associações significativas com risco de TH (P < 0,05) (Figura 1). A robustez desses achados foi apoiada por análises de diagramas de dispersão (Figura Suplementar 2A,B) e análises de sensibilidade usando a abordagem leave-one-out (Figura Suplementar 3A,B).

Entre os achados primários, o fenótipo de Treg apresentou o envolvimento mais extenso, com CD3 no CD39+ secretando Treg (OR = 1,063; IC 95%: 1,023–1,105; P = 0,002) e CD39+ ativado Treg %ativado (OR = 1,081; IC 95%: 1,008–1,161; P = 0,030) emergindo como características-chave associadas ao risco que foram posteriormente priorizadas para análise de mediação. Nos estágios de maturação das células T, CD3 em CD8br de CM mostrou o maior tamanho de efeito entre as características associadas ao risco (OR = 1,094; IC 95%: 1,040–1,150; P < 0,001), enquanto TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC mostrou uma associação protetora notável (OR = 0,930; IC 95%: 0,881–0,982; P = 0,009). Entre os fenótipos das células B, subconjuntos de células mieloides expressas de HLA-DR apresentaram consistentemente efeitos de elevação de risco, com HLA DR em CD33dim HLA DR+ CD11b⁻ atingindo OR = 1,095 (IC 95%: 1,032–1,162; P = 0,003). Os resultados completos em todas as seis categorias de células imunes: cDC, Treg, estágios de maturação das células T, TBNK, fenótipos de monócitos, células B e células mieloides estão resumidos na Figura 1.

Análises de sensibilidade validaram ainda mais os resultados. Não foi detectada evidência significativa de heterogeneidade e pleiotropia horizontal com base em avaliações estatísticas relevantes (Tabela Suplementar 3 e Tabela Suplementar 4). Esses resultados foram corroborados pela análise "deixa um de fora".

Os efeitos causais da TH nas células imunes

Os resultados revelaram que a TH estava positivamente associada causalmente a 2 características imunológicas: a célula T reguladora secretadora CD4 (1.143: 1.023-1.277; P = 0,018) e células supressoras derivadas de mieloides monocíticas (1,373: 1,058-1,782; P = 0,017). Em contraste, a TH esteve causalmente associada negativamente a 4 características imunológicas: célula T regulatória CD4 ativada (0,818: 0,679-0,987; P = 0,036), ativada célula T regulatória CD4+ (0,790: 0,676-0,924; P = 0,003), célula T reguladora CD4 ativada e em repouso (0,871: 0,780-0,974; P = 0,015) e CD25++ CD4+ célula T (0,855: 0,747-0,980; P = 0,017) (Figura 2). Esses achados sugerem uma relação recíproca entre os estados de ativação da HT e do Treg, que pode refletir a remodelação imune impulsionada pela doença. Gráficos de dispersão (Figura Suplementar 4) e o método "deixar um fora" (Figura Suplementar 5) verificaram a estabilidade dos resultados. Análises de sensibilidade também validaram os resultados. A força desses resultados foi confirmada por avaliações de heterogeneidade e multiplicidade horizontal (Tabela Suplementar 5 e Tabela Suplementar 6). Essas conclusões são apoiadas pela análise "deixar um de fora".

Efeitos causais genéticos dos metabólitos plasmáticos na TH

Após selecionar variáveis instrumentais adequadas e excluir desequilíbrios de cadeia e instrumentos fracos, um total de 34.843 SNPs associados a metabólitos plasmáticos foram identificados, com o F-statistic mínimo chegando a 19,50 (Tabela Suplementar 7). Usando o método de VITRO, 9 metabólitos plasmáticos foram preliminarmente identificados como causalmente associados à HT. Entre esses, 4 metabólitos foram positivamente associados ao aumento do risco de TH: Razão glicose-maltose (1,195: 1,082-1,319; P < 0,001), ácido taurocólico (1,190: 1,073-1,321; P = 0,001), 5-hidroximetil-2-furoilcarnitina (1,127: 1,046-1,215; P = 0,002), e C5 (1,120: 1,032-1,215; P = 0,006) (Tabela 1).

Por outro lado, 5 metabólitos podem estar negativamente associados ao risco de TH, incluindo a Ergotioneína (0,958: 0,927-0,990; P = 0,010), razão Carnitina para propionilcarnitina (C3) (0,895: 0,825-0,970; P = 0,007), razão de adenosina 5'-difosfato (ADP) para N-acetilneuraminato (0,890: 0,823-0,963; P = 0,004), razão arginina/glutamato (0,882: 0,802-0,968; P = 0,009), e 1-(1-enil-palmitoil)-2-linoleoil-GPE (p-16:0/18:2) (0,873: 0,798-0,955; P = 0,003).

Análises de sensibilidade também validaram os resultados. A força desses resultados foi confirmada por avaliações de heterogeneidade e multiplicidade horizontal (Tabela Suplementar 8 e Tabela Suplementar 9). Essas conclusões são apoiadas pela análise "deixar um de fora".

Mediação do risco de HT por metabólitos plasmáticos

Com base nos fenótipos de células imunes e metabólitos plasmáticos previamente identificados, uma estratégia de ressonância magnética com duas amostras foi aplicada para estimar os potenciais efeitos mediadores. Na primeira etapa, análises de RM foram realizadas utilizando 32 fenótipos de células imunes como exposições e 9 metabólitos plasmáticos como desfechos, revelando 12 associações causais significativas envolvendo 10 fenótipos de células imunológicas e 8 metabólitos plasáticos, com estimativas correspondentes de efeito β1 das células imunes para os metabólitos. Entre essas, a associação mais significativa foi identificada entre CD3 em células Treg secretoras CD39+ e os níveis de C5 (1,050: 1,016-1,085; P = 0,004). Na segunda etapa, o C5 foi tratado como a exposição e o HT como o resultado. Foram realizadas análises por ressonância magnética, incluindo detecção de valores atípicos do MR-PRESSO e avaliações de heterogeneidade e pleiotropia horizontal. Nenhum SNP atípico ou evidência de heterogeneidade ou pleiotropia foram detectados (Tabela 2), permitindo estimar o efeito causal do metabólito plasmático até a HT (β2) (Figura Suplementar 6).

Na etapa final da análise de RM, análises de mediação foram realizadas para esclarecer se o efeito causal dos fenótipos das células imunes sobre a TH foi mediado por metabólitos plasmáticos. Os resultados indicaram que níveis aumentados de C5 atuaram como mediador na via que liga CD3 em células Treg secretoras CD39+ a um risco maior de desenvolvimento de TH (Figura 7 e Figura 3 suplementares). Os testes de detecção de valores atípicos MR-PRESSO, heterogeneidade e pleiotropia não revelaram SNPs enviesados nem sinais de heterogeneidade ou pleiotropia horizontal (Tabela 3, Tabela Suplementar 10 e Tabela Suplementar 11). Entre eles, a proporção mediadora dos níveis de C5 foi de 8,89% (2,34% a 15,4%) (P = 0,008). Por fim, análises de RM por mediação reversa foram realizadas para testar rigorosamente as suposições de direcionalidade. Para metabólitos das células imunes, a RM reversa (níveis de C5 até CD3 no Treg secretor de CD39+) não mostrou efeitos causais significativos (P de > de VV 0,05 após correção de Bonferroni), apoiando a unidirecionalidade (Tabela 4). Para a TH para metabólitos, a RM reversa (níveis de TH a C5) não revelou associações causais (IVW P > 0,05 após a correção de Bonferroni), apoiando a direcionalidade assumida (Tabela 5). Dado o efeito total modesto e a falta de evidência recíproca na ressonância magnética bidirecional, esses resultados da mediação devem ser considerados exploratórios.

Ensaio de citometria de fluxo CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Detecção de Treg

Para validar os achados da análise metabolômica, foi realizada validação experimental in vitro para avaliar as características de expressão do CD39⁺ Treg e do plasma C5. A citometria de fluxo foi usada para quantificar células Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) e seus subconjuntos CD39⁺ (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) no sangue periférico de pacientes com TH e controles saudáveis. Como mostrado na Figura 4A–C, tanto as células de Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) quanto as CD39⁺ Treg subconjuntos estavam significativamente elevadas em pacientes com TH em comparação com indivíduos saudáveis (P < 0,001). O perfil metabolômico direcionado do plasma usando espectrometria de massa tandem mostrou ainda que os níveis de C5 eram marcadamente mais altos no grupo HT (P < 0,001, Figura 4D). Além disso, a análise de correlação de Pearson revelou uma associação positiva entre os níveis plasmáticos de C5 e a frequência do subconjunto CD39⁺Treg (Figura 4E), consistente com a suposta via CD39⁺Treg-C5-HT identificada pela ressonância magnética. No entanto, o desenho transversal e o tamanho reduzido da amostra impedem a inferência causal apenas a partir desses dados.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

As estatísticas resumidas do estudo de associação genômica ampla (GWAS) para tireoidite de Hashimoto foram obtidas do Catálogo GWAS (ebi-a-GCST90018855; https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Estatísticas resumidas para características das células imunológicas foram retiradas do Catálogo GWAS (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121; https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Os dados do GWAS do metabólito plasmático foram obtidos do Catálogo GWAS (GCST90199621-GCST90201020; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Os dados que apoiam as conclusões deste estudo são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: Gráfico florestal mostrando os efeitos causais das características das células imunes na tireoidite de Hashimoto. Gráfico florestal resumindo os efeitos causais de todas as características das células imunes avaliadas neste estudo sobre tireoidite (HT) de Hashimoto. Abreviações: nsnp, número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs); pval, valor P; OR, razão de chances; IC, intervalo de confiança. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Gráfico da floresta mostrando os efeitos causais da tireoidite de Hashimoto nos fenótipos das células imunes. Gráfico florestal resumindo os efeitos causais da TH em vários fenótipos das células imunológicas. Abreviações: nsnp, número de SNPs; pval, valor P; OR, razão de chances; IC, intervalo de confiança. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Gráfico florestal mostrando o efeito de mediação do plasma isovalerilcarnitina (C5) entre CD39+ e tireoidite de Hashimoto. Gráfico florestal resumindo os efeitos causais do plasma C5 que mediam a associação entre CD39+ e HT. Abreviações: OR, razão de probabilidades; IC, intervalo de confiança. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Expressão de células T reguladoras CD39+ e níveis plasmáticos de isovalerilicarnitina (C5) em pacientes com tireoidite de Hashimoto. (A) Estratégia de portamento de citometria de fluxo para regulador T (Treg; CD3+CD4+CD25+) e CD39+ células Treg. (B) Níveis totais de células Treg. (C) CD39+ níveis de células Treg. (D) Níveis plasmáticos de isovalerilcarnitina (C5) medidos por espectrometria de massa em tandem. (E) Análise de correlação de Pearson entre os níveis plasmáticos de isovalerilcarnitina (C5) e a proporção de células Treg CD39+. Abreviações: SSC-A, área de dispersão lateral; FSC-A, área de dispersão frontal; FSC-H, altura de dispersão para frente. P < 0,001 contra controles saudáveis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Efeitos causais de nove metabólitos plasmaticamente associados na tireoidite de Hashimoto.  Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 2: Efeito causal dos níveis de isovalerilicarnitina (C5) na tireoidite de Hashimoto (β₂). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 3: Efeito causal das células T regulatórias CD3+CD39+ na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 4: Efeito causal dos níveis de isovalerilcarnitina (C5) em células T regulatórias CD3+CD39+. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 5: Efeito causal da tireoidite de Hashimoto nos níveis de isovalerilcarnitina (C5). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Desenho do estudo e fluxo de trabalho analítico. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Gráficos de dispersão mostrando estimativas causais para as associações entre 32 características das células imunes e a tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Análises leave-one-out avaliando a robustez dos efeitos causais de 32 características das células imunes na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Gráficos de dispersão mostrando os efeitos causais da tireoidite de Hashimoto em seis fenótipos de células imunológicas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Análises leave-one-out avaliando a robustez dos efeitos causais da tireoidite de Hashimoto em seis fenótipos de células imunológicas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 6: Associação causal entre os níveis de isovalerilcarnitina (C5) e o risco de tireoidite de Hashimoto. (A) Gráfico florestal mostrando o efeito causal dos níveis de isovalerilicarnitina (C5) sobre o risco de TH (β₂). (B) Gráfico de dispersão mostrando a estimativa do efeito causal para cada SNP no risco de HT. (C) Gráfico de funil avaliando a heterogeneidade das estimativas de randomização mendeliana (RM) para o efeito dos níveis de C5 no risco de HT. (D) Análise de deixar um e fora demonstrando que a estimativa geral de risco não foi substancialmente influenciada por nenhum SNP individual. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 7: Associação causal entre células T reguladoras CD3+CD39+ e risco de tireoidite de Hashimoto. (A) Gráfico de floresta mostrando o efeito causal total das células T regulatórias CD3+CD39+ sobre o risco de TH. (B) Gráfico de dispersão mostrando a estimativa do efeito causal para cada SNP no risco de HT. (C) Gráfico de funil avaliando a heterogeneidade das estimativas de RM para o efeito das células T regulatórias CD3+CD39+ sobre o risco de HT. (D) Análise de deixar um e fora demonstrando que a estimativa geral de risco não foi substancialmente influenciada por nenhum SNP individual. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Características dos conjuntos de dados de estudos de associação genômica ampla para metabólitos plasmáticos usados na análise de randomização mendeliana.  Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Características das variáveis instrumentais (SNPs) e estatísticas F para fenótipos chave de células imunes usados como exposições na análise de randomização mendeliana. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 3: Avaliação de pleiotropia para análises de randomização mendelianas de fenótipos de células imunes na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Avaliação de heterogeneidade para análises de randomização mendeliana de fenótipos de células imunes na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 5: Avaliação de pleiotropia para análises de randomização mendelianas da tireoidite de Hashimoto em fenótipos de células imunes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 6: Avaliação de heterogeneidade para análises de randomização mendelianas da tireoidite de Hashimoto em fenótipos de células imunológicas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 7: Polimorfismos de nucleotídeo único associados a metabólitos plasáticos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 8: Avaliação de pleiotropia para análises de randomização mendeliana de metabólitos plasmáticos na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 9: Avaliação de heterogeneidade para análises de randomização mendelianas de metabólitos plasáticos na tireoidite de Hashimoto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 10: Avaliação de pleiotropia para análises de mediação das associações fenótipo de células imunológicas–tireoidite de Hashimoto por metabólitos plasáticos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 11: Avaliação de heterogeneidade para análises de mediação das associações fenótipo celular imunocelular–tireoidite de Hashimoto por metabólitos plasáticos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Dados que apoiam as conclusões deste estudo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, a randomização mendeliana foi aplicada para investigar o impacto causal dos fenótipos das células imunológicas na tireoidite de Hashimoto (TH) e para explorar o papel mediador potencial dos metabólitos plasmáticos. Trinta e dois fenótipos imunológicos foram associados ao risco de HT, abrangendo células dendríticas, células T reguladoras, estágios de maturação das células T, células B e células mieloides, com efeitos tanto de promoção de risco quanto protetores. Além disso, 9 metabólitos plasmáticos apresentaram ligações causais com a HT e observaram ainda que o C5 pode parcialmente mediar a associação entre a expressão do CD3 em células Treg secretadoras do CD39⁺ e a HT. Esses achados devem ser interpretados como evidência de efeitos causais supostos inferidos a partir de instrumentos genéticos, e não como confirmação mecanicista direta.

Entre os fenótipos cDC, CD62L- plasmacitoide DC %DC e HLA DR no plasmacitoide DC estiveram associados a um risco aumentado de TH, enquanto CCR2 em CD62L+ mieloide DC, CD39+ Treg %ativado e CD62L no monócito. As associações identificadas entre fenótipos específicos de células imunológicas e a TH oferecem novos insights sobre a patogênese da doença. Por exemplo, o risco de TH foi encontrado correlacionado com características como HLA DR em DC plasmacitoide e CD62L-plasmacitoide DC, indicando que esses tipos celulares podem ser essenciais para iniciar ou manter reações autoimunes contra a glândula ^{tireoide 28}. Diversas pesquisas demonstraram que as células epiteliais da tireoide HLA DR+ estimulam ativamente respostas imunes na glândula tireoide de pacientes com HT 28,29,30,31. Este estudo revelou uma correlação entre HLA DR no plasmacitoide e um risco elevado de TH, indicando que HLA DR no plasmacitoide pode ser um fator causal na TH. Estudos anteriores identificaram genes fundamentais com alta precisão diagnóstica para a TH por métodos bioinformáticos, e imunoensaios mostraram que a infiltração de monócitos está negativamente correlacionada com a expressão gênica pivot. Xu et ^al.32 relataram que níveis mais altos de expressão de CD62L em monócitos estavam associados a um risco reduzido de TH, consistente com os achados atuais. Especificamente, fenótipos como CCR2 em células dendríticas mieloides CD62L+ e CD62L em monócitos foram associados a um efeito protetor, indicando possíveis papéis regulatórios ou supressores que poderiam mitigar a autoimunidade tireoidiana.

Diversas evidências apontam para o papel fundamental que o equilíbrio das células Th17 e Treg desempenha no avanço do HT^33,34. Esta investigação identificou uma ligação causal entre a TH e várias características de Treg. Especificamente, o risco de desenvolver TH esteve inversamente associado à expressão de CD25 em células T regulatórias CD39+ em repouso, enquanto a razão Th17/Treg foi observada aumentando com a progressão da HT³⁵. A função complexa das células T reguladoras na preservação da tolerância imunológica e na prevenção de doenças autoimunes é destacada pelas fortes correlações de diferentes fenótipos de Treg, com risco elevado e reduzido de TH. As células Treg são duplas, com alguns subconjuntos potencialmente agravando respostas autoimunes enquanto outros as suprimem. Isso ressalta a necessidade de pesquisas adicionais para definir com precisão seus papéis na TH.

Além disso, nos estágios de maturação das células T, nos grupos TBNK, monócitos e células B, foi observado um padrão consistente em que alguns fenótipos imunes estavam ligados a um risco maior de TH, enquanto outros pareceram conferir um efeito^protetor 32,36,37,38. Isso ressalta o envolvimento complexo das células imunes no desenvolvimento da HT. A análise inversa de RM também foi realizada para examinar o efeito da TH nas características das células imunes. A análise revelou que a TH estava associada a níveis aumentados de certos fenótipos de células imunológicas, como a secretação de células T reguladoras CD4 e MDSC monocíticos, e níveis reduzidos de outros, notadamente células T reguladoras CD4 ativadas e células T CD25+ CD4+.

Notavelmente, a análise de mediação destaca o papel causal dos níveis de C5 na progressão dos fenótipos das células imunes para o desenvolvimento da TH. Estudos anteriores mostraram que os níveis plasmáticos de C5 contribuem para o desenvolvimento da neuropatia periférica^{diabética 39} e estão correlacionados tanto com sarcopenia quanto com a redução do índice muscular^{esquelético 40}. Além disso, em termos de metabolismo lipídico, concentrações menores de isovalerilcarnitina foram observadas em indivíduos com fenótipo de^{fragilidade 41}. A proporção de mediação de 8,89% observada neste estudo sugere que o C5 pode representar um elo mecanicista suposto na via Treg–HT CD39⁺ , e justifica investigações adicionais como biomarcador candidato e alvo terapêutico em estudos experimentais e clínicos prospectivos.

Embora este estudo forneça insights valiosos, algumas limitações merecem consideração. Primeiro, a abordagem de RM baseia-se na suposição de que as variáveis instrumentais usadas são válidas e não influenciadas por fatores de confusão ou pleiotropia 42,43,44. Segundo, as análises primárias de RM foram baseadas em dados GWAS de ascendência europeia, e o GWAS de células imunológicas foi derivado de uma população fundadora sarda cuja estrutura distinta de desequilíbrio de ligação pode limitar a generalizabilidade; estudos futuros em coortes diversas e não europeias são necessários para confirmar a aplicabilidade específica da população. Terceiro, a análise de mediação identificou o C5 como um fator que pode representar uma ligação exploratória. Estudos futuros que incorporem coortes mais diversas são necessários para confirmar essas associações e explorar possíveis efeitos específicos da população. Por fim, experimentos de citometria de fluxo e validação plasmática forneceram evidências de apoio para os achados da RM; no entanto, o tamanho da amostra era relativamente limitado. Estudos experimentais e clínicos maiores são necessários para validar essas interações metabólicas imunológicas e para explorar se direcionar células CD39⁺Treg ou vias metabólicas relacionadas pode oferecer novas oportunidades terapêuticas para a TH.

Conclusão

Em conclusão, este estudo fornece novos insights sobre as relações causais entre fenótipos de células imunológicas, particularmente os Tregs CD39⁺ e a HT, com o C5 identificado como candidato a mediador nessa via com base em análise exploratória de mediação. Esses achados revelam um novo eixo imunometabólico, oferecendo insights mecanicistas e potenciais alvos para o desenvolvimento de biomarcadores e intervenção terapêutica em doenças autoimunes da tireoide. Estudos futuros com coortes prospectivas maiores podem validar ainda mais esses achados e explorar o valor potencial de aplicação da imunomodulação no tratamento da TH.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo monoclonal CD25-PE	BD Biosciences	340938	Anticorpo para citometria de fluxo para detecção humana de CD25
Anticorpo monoclonal CD39-PE-Cy7	BD Biosciences	567526	Anticorpo para citometria de fluxo para detecção humana de CD39
Anticorpo monoclonal CD4-FITC	BD Biosciences	340133	Anticorpo para citometria de fluxo para detecção humana de CD4
Anticorpo monoclonal D3-APC	BD Biosciences	555333	Anticorpo para citometria de fluxo para detecção humana de CD3
Solução FACS Lysing	BD Biosciences	349202	Buffer de lise de glóbulos vermelhos para preparação de amostras de citometria de fluxo
Citômetro de fluxo	BD Biosciences	FACSCanto II	Instrumento de citometria de fluxo multicolorida para imunofenotipagem
Software de análise de citometria de fluxo (FACSDiva)	BD Biosciences	—	Software para aquisição e análise de dados de citometria de fluxo
Pacote gwasglue	Pacote R	—	Harmonização de conjuntos de dados GWAS
Pacote ieugwasr	Pacote R	—	Interface para o banco de dados IEU GWAS
Sistema de cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	Usado para quantificação de isovalerilcarnitina (C5) no plasma
Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	PBS estéril, pH 7,4, usado para lavagem e ressuspensão
Software R	Software de código aberto	Versão 4.4.1	Ambiente de análise estatística
Pacote TwoSampleMR	Pacote R	—	Pacote de análise de randomização mendeliana
Pacote VariantAnnotation	Bioconductor	—	Anotação de dados de variantes