Efeitos na qualidade do RNA dos PBMCs sob diferentes tempos de criopreservação e métodos de processamento em pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células

Resumo

Este estudo compara o Reagente de Isolamento Tríplice (TRIzol) e a solução clássica (FBS + DMSO) para criopreservação dos PBMCs de pacientes com NSCLC. O TRIzol mantém integridade satisfatória do RNA por até 6 meses, tornando-o recomendado para preservação de RNA de alta qualidade.

Resumo

Células mononucleares do sangue periférico criopreservado (PBMCs) são amplamente utilizadas no sequenciamento de RNA (RNA-seq), e a qualidade de seu RNA influencia diretamente os resultados dos testes. No entanto, a criopreservação pode facilmente levar à degradação do RNA em PBMCs, e a questão de como melhorar a qualidade do RNA durante a criopreservação de longo prazo permanece sem solução. PBMCS de amostras de sangue fresco coletadas de pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células (NSCLC) foram utilizados como controles. A eficácia da preservação de RNA das amostras de PBMC foi comparada entre a solução clássica de criopreservação celular (90% soro fetal bovino [FBS] + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) e o reagente comum de extração de RNA (TRIzol) a -80 °C por 1, 3 e 6 meses. A concentração, pureza e integridade do RNA (conforme medidas pelo número de integridade do RNA [RIN]) foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis micro-volume multi-amostra e um bioanalisador eletroforético microfluídico automatizado para fornecer uma base teórica para a preservação de amostras de RNA de alta qualidade. Este estudo demonstrou que a concentração, pureza e integridade do RNA nos PBMCs diminuíram com a duração estendida da criopreservação. Embora os dois métodos de processamento não tenham afetado a concentração de RNA, eles afetaram a pureza e integridade do RNA. A integridade do RNA dos PBMCs criopreservados com TRIzol por 6 meses permaneceu satisfatória. Nossos resultados indicam que o TRIzol contribui para a criopreservação eficaz e mantém RNA de alta qualidade.

Introdução

O RNA-seq da PBMC em pacientes com CPNPC desempenha um papel crítico na avaliação da eficácia da imunoterapia. O câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um tumor maligno comum no mundo, e cerca de 70% dos pacientes são diagnosticados em estágio avançado com prognóstico^{ruim 1,2}. A imunoterapia revolucionou o paradigma de tratamento para a CPNC, oferecendo estratégias terapêuticas^{inovadoras 3,4}. No tratamento de inibidores de checkpoint imunológico (ICI), o sequenciamento de RNA (RNA-seq) das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtido de pacientes com CPNPC pode monitorar as mudanças dinâmicas nos benefícios clínicos da^{imunoterapia 5}. As fontes de amostra para RNA-seq incluem tecido tumoral e PBMCs ^6,7, sendo PBMCs servindo como uma amostra biológica vital tanto em ensaios clínicos quanto em pesquisas científicas^{básicas 8}. A criopreservação representa o principal método para armazenamento de amostras a longo prazo, mantendo células e tecidos em estado de repaciência enquanto preserva seu potencial e características biológicas. Consequentemente, a criopreservação dos PBMCs emergiu como uma abordagem viável e amplamente adotada. O PBMC criopreservado facilita a análise em lotes de amostras, minimiza a variabilidade intralaboratorial e interlaboratorial e otimiza a utilização dos^{recursos 8,9}. Por exemplo, estudos mostraram que o uso de um meio RPMI-1640 congelado, suplementado com 40% de soro fetal de bezerro (FCS) e 20% de dimetil sulfóxido (DMSO) para criopreservação de PBMC demonstra que as proporções de células T e B expressando a combinação CD39 e CD73 permaneceram relativamente estáveis dentro de seis meses após o armazenamento¹⁰. Um estudo comparou três kits comerciais de criopreservação e dois agentes crioprotetores (90% RPMI-10% DMSO, 90% plasma-10% DMSO), revelando viabilidade celular semelhante (81,0%) e taxas de recuperação (73,7%) entre os métodos. No entanto, todos os PBMCs criopreservados apresentaram viabilidade significativamente reduzida em comparação com amostras^{frescas 5}. Pesquisas posteriores demonstraram que PBMC resuspenso precipita no reagente TRIzol e imediatamente os congela a -80 °C. Após 1–2 dias, observaram que o valor de RIN das PBMCs era maior do que o das amostras de sangue^{total 11}.

Outra investigação comparou amostras de leucócitos tratadas com TRIzol, RNAlater e outros reagentes, mostrando que todos os métodos alcançaram valores de número de integridade de RNA (RIN) >7. A integridade do RNA foi avaliada usando um bioanalisador eletroforético microfluídico automatizado, e o RIN foi calculado como uma medida quantitativa da qualidade do RNA. Amostras com RIN ≥7 foram consideradas adequadas para análise de^{RNA-seq 12}. Notavelmente, o grupo leucócitos + RNAlater apresentou rendimento significativamente menor de RNA em comparação com o grupo leucócitos +^{TRIzol 12}. No entanto, pesquisas atuais sobre criopreservação de PBMC focam predominantemente na viabilidade celular e na análise de fenótipos celulares imunes após o descongelamento; atenção limitada tem sido dedicada à avaliação sistemática e de longo prazo da qualidade do RNA sob diferentes condições de preservação. Além disso, protocolos padronizados para criopreservação de amostras de PBMC para preservar a integridade do RNA permanecem^{subdesenvolvidos} 13,14,15. Essa lacuna é particularmente relevante para a imunoterapia com CPNCs, onde RNA de alta qualidade proveniente de PBMCs coletados longitudinalmente é essencial para a descoberta confiável de biomarcadores e o monitoramento da resposta ao tratamento.

Neste estudo, hipotetizamos que a escolha do método de criopreservação influencia significativamente a integridade e qualidade a longo prazo do RNA derivado de PBMCs, e um protocolo otimizado pode manter a adequação do RNA para ensaios sensíveis como RNA-seq. Para resolver isso, PBMCs recém-isolados de amostras de sangue coletadas de pacientes avançados com CPNPC foram usados como controles. A eficácia da preservação de RNA das amostras de PBMC foi comparada entre dois métodos de tratamento (90% FBS + 10% DMSO e TRIzol) a -80 °C por 1, 3 e 6 meses (Figura 1). A concentração, pureza e integridade de RNA (conforme medidas pelo RIN) foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis micro-volume multi-amostra e um bioanalisador eletroforético microfluídico automatizado. Este estudo visa fornecer uma base teórica para a preservação de amostras de RNA de alta qualidade e avançar a pesquisa translacional e preservação de amostras na medicina de precisão tumoral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de tecido humano e amostras clínicas neste estudo foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Câncer de Jilin (Aprovação Ética nº 202507-002-01). Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes ou de seus tutores legais antes da coleta da amostra. Amostras de sangue periférico (10 mL por paciente) foram coletadas de 19 pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células (NSCLC) no Hospital de Câncer de Jilin, resultando em um total de 133 amostras de RNA. Para garantir a segurança do laboratório, todas as operações envolvendo produtos químicos perigosos eram realizadas em um gabinete de segurança biológica.

Informações detalhadas sobre os instrumentos, reagentes e consumíveis usados no experimento foram fornecidas na Tabela de Materiais.

Isolamento do PBMC
Amostras de sangue periférico foram processadas para isolamento com PBMC dentro de 2 horas após a coleta. PBMCs foram isolados e purificados por centrifugação do gradiente de densidade Ficoll-Paque a 400 × g por 25 minutos em temperatura ambiente, com o freio desativado. Após a centrifugação, a camada intermediária de linfócitos branco-leitoso (contendo PBMCs) foi cuidadosamente^{aspirada 16}. Importante, padronizamos estritamente a concentração de entrada da PBMC para cada amostra e cada grupo para garantir números de células consistentes em todas as condições experimentais, minimizando assim a variação causada pela entrada e processamento das células. Isso garante que as diferenças observadas reflitam efeitos genuínos de diferentes métodos de preservação, e não variabilidade técnica. Para cada paciente, os PBMCs isolados foram divididos em 7 tubos: um tubo foi usado para extração imediata de RNA, e a concentração, pureza e integridade foram avaliadas. Os seis tubos restantes foram crioppreservados a uma taxa de resfriamento de -1 °C/min: três foram tratados com 1 mL de 90% FBS + 10% DMSO, e os outros três com 1 mL de TRIzol, seguidos por armazenamento a -80 °C. A extração de RNA e a avaliação da qualidade foram realizadas após 1, 3 e 6 meses de armazenamento congelado.

Extração de RNA
As amostras eram retiradas do armazenamento a -80 °C e descongeladas a 4 °C até serem totalmente^{descongeladas em 17}. Amostras preservadas com solução de criopreservação de 90% FBS + 10% de DMSO ou TRIzol foram lavadas uma vez com PBS, centrifugadas a 200 × g por 5 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi descartado para reter a pastilha celular. O RNA total foi extraído usando TRIzol. Especificamente, o reagente de TRIzol foi adicionado ao tubo da microcentrífuga contendo a amostra processada, misturado por inversão e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos para garantir a lise completa. Subsequentemente, 200 μL de clorofórmio foram adicionados, misturados cuidadosamente por agitação, e incubados em temperatura ambiente por 15 minutos. Após centrifugação a 2400 × g por 15 minutos a 4 °C, a fase aquosa superior foi cuidadosamente aspirada e transferida para um novo tubo Eppendorf. Isopropanol (0,5 mL) foi então adicionado, bem misturado e incubado em temperatura ambiente por 5–10 minutos. Após centrifugação a 2400 × g por 10 minutos a 4 °C, o sobrenadante foi descartado, deixando o RNA precipitado no fundo do tubo.

O precipitado foi ressuspenso em 75% de etanol (1 mL) com agitação suave, seguida de centrifugação a 1600 × g por 5 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado, e o pellet de RNA foi deixado secar ao ar em temperatura ambiente por 5 a 10 minutos. Por fim, as amostras de RNA foram dissolvidas em água tratada com DEPC de 50 μL e incubadas em um banho-maria a 55–60 °C por 5–10 minutos^{e 18} minutos. Detecção da concentração e pureza de RNA. A concentração e pureza de RNA foram medidas usando o método de absorção ultravioleta com um espectrofotômetro UV-Vis microvolume de múltiplas amostras (faixa de medição: 2,5–3000 ng/μL). A concentração de RNA foi determinada com base no valor de absorção em 260 nm, enquanto a pureza do RNA foi avaliada usando a razão A260/A280. O software de medição foi lançado; "Ácido Nucleico" foi clicado na interface principal. A plataforma de detecção foi enxaguada duas vezes com água duplamente destilada, depois 1,5 μL da amostra de RNA foi pipetado sobre ela. O RNA-40 foi selecionado para o tipo de amostra, "Medir" foi clicado e a concentração e os valores de pureza de A260/280 foram registrados. Uma razão A260/A280 entre 1,9 e 2,1 indicou alta pureza de RNA, enquanto valores abaixo de 1,8 sugeriram contaminação proteica, e valores maiores que 2,2 indicaram potencial degradação do RNA ou isotiocianato^{residual 19}.

Detecção de integridade de RNA
A integridade do RNA (RIN) foi avaliada usando um bioanalisador eletroforético microfluídico automatizado e kit de detecção. O RIN varia de 1 a 10, sendo 1 indicando RNA altamente degradado e 10 RNA intacto. Para análise, 1,2 μL de RNA foi colocado em um tubo de PCR, desnaturado termicamente a 70 °C por 2 minutos usando um ciclador térmico, e imediatamente colocado sobre gelo. Subsequentemente, 1 μL de RNA desnaturado foi adicionado aos poços de detecção do chip para análise²⁰. O software foi lançado, "Astakes" foi selecionado e "RNA" foi escolhido no menu suspenso. O programa "Eucariota Total RNA Nano Série II.xsy" foi selecionado de acordo com o reagente utilizado. "Iniciar" foi clicado para iniciar a detecção. Após aproximadamente 10 minutos, o número e a altura máxima da escada foram verificados quanto à normalidade.

Métodos estatísticos
Testes de normalidade foram realizados para todos os dados. Dados normalmente distribuídos foram expressos como média ± desvio padrão (DS), enquanto dados não distribuídos normalmente foram expressos como mediana (intervalo interquartil, IQR). Comparações entre dois grupos foram analisadas usando o teste t pareado para dados normalmente distribuídos e o teste não paramétrico de amostras relacionadas para dados distribuídos de forma não normal. Para comparações entre três ou mais grupos, foi usada análise de variância por medidas repetidas para dados normalmente distribuídos, e o teste não paramétrico de amostras relacionadas foi usado para dados distribuídos de forma não normal. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 19.0 e GraphPad Prism 9.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Resultados

Efeitos de diferentes tempos de criopreservação e métodos de processamento na concentração de RNA em amostras de PBMC
O efeito dos diferentes tempos de criopreservação: As amostras frescas de PBMC de pacientes avançados com NSCLC serviram como grupo controle. As amostras foram tratadas com TRIzol ou 90% FBS + 10% DMSO e armazenadas a -80 °C por 1, 3 e 6 meses; RNA total foi extraído para medir a concentração de RNA. Para amostras tratadas com TRIzol, as concentrações ...

Discussão

Muitos fatores influenciam a qualidade do RNA em amostras biológicas, incluindo variáveis pré-analíticas, condições de transporte, duração do processamento à temperatura ambiente, necrose tecidual, temperatura e congelamento dos produtos, tamanho e número de aliquotas, bem como a duração de armazenamento, têm um impacto significativo na qualidade do^{RNA 21}. Para amostras idênticas, variações no tempo de criopreservação e nos métodos de processamento podem afetar si...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioanalisador Agilent 2100	Agilent	G2939B	Detecção da integridade do RNA, avaliação da qualidade do RNA gerando o Número de Integridade do RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 Nanokit	Agilent	5067-1511	Em conjunto com o Bioanalisador Agilent 2100, fornecendo reagentes e chips dedicados para a integridade do RNA
Centrífuga	Eppendorf	5424R	Para extração de RNA
Centrífuga	Eppendorf	5810R	Para extração de PBMC
Clorofórmio	China National Pharmaceutical Group Corporation	20191031	Para extração de RNA pelo método Trizol, usado para separar a fase aquosa contendo RNA da fase orgânica contendo impurezas
Dimetil sulfóxido	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Como solução de criopreservação para PBMCs, permitindo o armazenamento prolongado de amostras em -80 °C; C
Tubo	Corning	MCT-150-C	Para armazenamento de amostras, mistura de reagentes, centrifugação e outras operações experimentais
Etanol	Shandong Lierkang	25071901A	Extração de RNA IIn pelo método Trizol, usada para lavar precipitados de RNA para remover resíduos
Soro fetal bovino	Xpbiomed	C04001-500	Como solução de criopreservação para PBMCs, permitindo armazenamento de longo prazo de
Solução de separação de Ficoll	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Para isolamento e purificação de PBMC via centrifugação por gradiente de densidade
GeneTouch(Plus) Ciclador térmico	Bioer	TC-EA-48DA	Para desnaturação térmica do RNA (70 e graus; C por 2 min), seguido pela detecção com o bioanalisador
Isopropanol	China National Pharmaceutical Group Corporation	20210929	Na extração de RNA pelo método Trizol, usado para precipitação de RNA
Espectrofotômetro Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Para concentração de RNA (baseada na absorvância a 260 nm) e pureza (baseada na razão A260/A280) usando o método de absorção ultravioleta
Tubos de PCR	Corning	PCR-02-C	Para desnaturação térmica do RNA (70 e graus; C por 2 min), seguido pela detecção com o bioanalisador
Soro tamponado com fosfato & nbsp;	Sistema Procell	PB180327	Para lise direta e preservação de PBMCs, ou RNA total subsequente
Reagente de Isolamento Triplo	Adsin	ADS60154	Para lise direta e preservação de PBMCs, ou RNA total subsequente