Efeitos na qualidade do RNA dos PBMCs sob diferentes tempos de criopreservação e métodos de processamento em pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células

Resumo

Este estudo compara o Reagente de Isolamento Tríplice (TRIzol) e a solução clássica (FBS + DMSO) para criopreservação dos PBMCs de pacientes com NSCLC. O TRIzol mantém integridade satisfatória do RNA por até 6 meses, tornando-o recomendado para preservação de RNA de alta qualidade.

Resumo

Células mononucleares do sangue periférico criopreservado (PBMCs) são amplamente utilizadas no sequenciamento de RNA (RNA-seq), e a qualidade de seu RNA influencia diretamente os resultados dos testes. No entanto, a criopreservação pode facilmente levar à degradação do RNA em PBMCs, e a questão de como melhorar a qualidade do RNA durante a criopreservação de longo prazo permanece sem solução. PBMCS de amostras de sangue fresco coletadas de pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células (NSCLC) foram utilizados como controles. A eficácia da preservação de RNA das amostras de PBMC foi comparada entre a solução clássica de criopreservação celular (90% soro fetal bovino [FBS] + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) e o reagente comum de extração de RNA (TRIzol) a -80 °C por 1, 3 e 6 meses. A concentração, pureza e integridade do RNA (conforme medidas pelo número de integridade do RNA [RIN]) foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis micro-volume multi-amostra e um bioanalisador eletroforético microfluídico automatizado para fornecer uma base teórica para a preservação de amostras de RNA de alta qualidade. Este estudo demonstrou que a concentração, pureza e integridade do RNA nos PBMCs diminuíram com a duração estendida da criopreservação. Embora os dois métodos de processamento não tenham afetado a concentração de RNA, eles afetaram a pureza e integridade do RNA. A integridade do RNA dos PBMCs criopreservados com TRIzol por 6 meses permaneceu satisfatória. Nossos resultados indicam que o TRIzol contribui para a criopreservação eficaz e mantém RNA de alta qualidade.

Introdução

O RNA-seq da PBMC em pacientes com CPNPC desempenha um papel crítico na avaliação da eficácia da imunoterapia. O câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um tumor maligno comum no mundo, e cerca de 70% dos pacientes são diagnosticados em estágio avançado com prognóstico^{ruim 1,2}. A imunoterapia revolucionou o paradigma de tratamento para a CPNC, oferecendo estratégias terapêuticas^{inovadoras 3,4}. No tratamento de inibidores de checkpoint imunológico (ICI), o sequenciamento de RNA (RNA-seq) das células mononucle....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de tecido humano e amostras clínicas neste estudo foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Câncer de Jilin (Aprovação Ética nº 202507-002-01). Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes ou de seus tutores legais antes da coleta da amostra. Amostras de sangue periférico (10 mL por paciente) foram coletadas de 19 pacientes com câncer avançado de pulmão não de pequenas células (NSCLC) no Hospital de Câncer de Jilin, resultando em um total de 133 amostras de RNA. Para garantir a segurança do lab....

Resultados

Efeitos de diferentes tempos de criopreservação e métodos de processamento na concentração de RNA em amostras de PBMC
O efeito dos diferentes tempos de criopreservação: As amostras frescas de PBMC de pacientes avançados com NSCLC serviram como grupo controle. As amostras foram tratadas com TRIzol ou 90% FBS + 10% DMSO e armazenadas a -80 °C por 1, 3 e 6 meses; RNA total foi extraído para medir a concentração de RNA. Para amostras tratadas com TRIzol, as concentrações .......

Discussão

Muitos fatores influenciam a qualidade do RNA em amostras biológicas, incluindo variáveis pré-analíticas, condições de transporte, duração do processamento à temperatura ambiente, necrose tecidual, temperatura e congelamento dos produtos, tamanho e número de aliquotas, bem como a duração de armazenamento, têm um impacto significativo na qualidade do^{RNA 21}. Para amostras idênticas, variações no tempo de criopreservação e nos métodos de processamento podem afetar si.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioanalisador Agilent 2100	Agilent	G2939B	Detecção da integridade do RNA, avaliação da qualidade do RNA gerando o Número de Integridade do RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 Nanokit	Agilent	5067-1511	Em conjunto com o Bioanalisador Agilent 2100, fornecendo reagentes e chips dedicados para a integridade do RNA
Centrífuga	Eppendorf	5424R	Para extração de RNA
Centrífuga	Eppendorf	5810R	Para extração de PBMC
Clorofórmio	China National Pharmaceutical Group Corporation	20191031	Para extração de RNA pelo método Trizol, usado para separar a fase aquosa contendo RNA da fase orgânica contendo impurezas
Dimetil sulfóxido	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Como solução de criopreservação para PBMCs, permitindo o armazenamento prolongado de amostras em -80 °C; C
Tubo	Corning	MCT-150-C	Para armazenamento de amostras, mistura de reagentes, centrifugação e outras operações experimentais
Etanol	Shandong Lierkang	25071901A	Extração de RNA IIn pelo método Trizol, usada para lavar precipitados de RNA para remover resíduos
Soro fetal bovino	Xpbiomed	C04001-500	Como solução de criopreservação para PBMCs, permitindo armazenamento de longo prazo de
Solução de separação de Ficoll	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Para isolamento e purificação de PBMC via centrifugação por gradiente de densidade
GeneTouch(Plus) Ciclador térmico	Bioer	TC-EA-48DA	Para desnaturação térmica do RNA (70 e graus; C por 2 min), seguido pela detecção com o bioanalisador
Isopropanol	China National Pharmaceutical Group Corporation	20210929	Na extração de RNA pelo método Trizol, usado para precipitação de RNA
Espectrofotômetro Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Para concentração de RNA (baseada na absorvância a 260 nm) e pureza (baseada na razão A260/A280) usando o método de absorção ultravioleta
Tubos de PCR	Corning	PCR-02-C	Para desnaturação térmica do RNA (70 e graus; C por 2 min), seguido pela detecção com o bioanalisador
Soro tamponado com fosfato & nbsp;	Sistema Procell	PB180327	Para lise direta e preservação de PBMCs, ou RNA total subsequente
Reagente de Isolamento Triplo	Adsin	ADS60154	Para lise direta e preservação de PBMCs, ou RNA total subsequente