Efeitos da Insuficiência Renal Crônica Combinada com Fibrilação Auricular na Função Endotelial Auricular Esquerda em um modelo Beagle

Resumo

Este estudo estabeleceu um modelo inédito in vivo beagle de insuficiência renal crônica moderada combinada com fibrilação auricular via embolização da artéria renal transcateter e aceleração atrial, e demonstrou que essa combinação prejudicava severamente a função endotelial da atria esquerda, aumento da atividade procoagulante e risco elevado de trombose por meio de vias inflamatórias e mediadas por RAAS.

Resumo

A coocorrência de fibrilação auricular (FA) e insuficiência renal (IR) representa um fenômeno clinicamente complexo com alta prevalência. Este estudo investigou o impacto da RI crônica moderada combinada com FA na função endotelial da atria esquerda em beagles. A RI crônica foi induzida pela embolização por cateter do ramo principal da artéria renal esquerda usando grânulos de esponja de gelatina, com animais mantidos por 3 meses para permitir o desenvolvimento de danos parênquimatos renais crônicos. A FA foi posteriormente induzida por estimulação auricular rápida e contínua (duração básica do ciclo, 60 ms; voltagem, 4 vezes o limiar de estimulação diastólica; 180 min). As alterações histológicas foram avaliadas usando coloração de hematoxilina e eosina. Parâmetros associados à função endotelial, coagulação, fibrinólise, inflamação e atividade do sistema renina–angiotensina–aldosterona (RAAS) no plasma e tecidos cardíacos foram examinados por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzimas, reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real e Western bloting. Os resultados demonstraram o estabelecimento bem-sucedido de um modelo de dano renal crônico com RI moderado, confirmado por elevação significativa da creatinina plasmática, nitrogênio ureiano e redução da eliminação da creatinina. A função endotelial da atrial esquerda foi significativamente prejudicada em beagles com IR e FA, acompanhada de efeitos procoagulantes aprimorados e diminuição da fibrinólise. Os marcadores inflamatórios foram elevados após o procedimento de IR ou indução de FA e foram ainda mais intensificados no grupo combinado IR+FA. Além disso, a atividade do RAAS, evidenciada pelo aumento dos níveis de renina e aldosterona, foi elevada após a IR e ainda mais aumentada após a combinação com FA. Em resumo, este estudo estabeleceu com sucesso um modelo animal in vivo de RI crônica moderada combinada com FA em beagles, demonstrando que essa combinação perturbou significativamente a função endotelial do atrio esquerdo e aumentou o risco trombótico.

Introdução

A fibrilação auricular (FA), a forma mais prevalente de arritmia cardíaca sustentada, está intimamente ligada a desfechos clínicos desfavoráveis. Devido às características fisiopatológicas sistêmicas da FA, essa arritmia frequentemente se envolve em interferências fisiopatológicas complexas com uma série de comorbidades concomitantes, incluindo declínio cognitivo, depressão e embolia^{sistêmica 1}. A doença renal crônica (DRC) foi identificada como um fator de risco independente tanto para o desenvolvimento da FA quanto para a ocorrência de eventos tromboembólicos. Aproximadamente 15% a 20% dos pacientes diagnosticados com DRC são afetados por FA, enquanto a proporção de pacientes que recebem terapia de substituição renal que desenvolvem FA varia de 15% a 40^%. Enquanto isso, aproximadamente 30% a 60% dos pacientes diagnosticados com FA apresentam insuficiência renal (IR) leve a ^moderada3. Portanto, a coocorrência de FA e IR tornou-se um fenômeno clínico complexo com alta prevalência entre as populações de pacientes. A relação bidirecional entre FA e IR aumenta severamente o risco de incidência de FA e também agrava a progressão da insuficiência renal, contribuindo eventualmente para desfechos clínicos^{piores 4}.

Em estudos anteriores, ratos foram frequentemente usados para estabelecer modelos de RI; no entanto, seu pequeno tamanho cardíaco os torna inadequados para experimentos eletrofisiológicos cardíacos. Cães, por outro lado, são frequentemente empregados em modelos animais de médio e grande porte de insuficiência renal, sendo a nefrectomia o principal método^{de modelagem 5}. No entanto, essa abordagem está associada a uma taxa limitada de sucesso na modelagem. Mais importante ainda, como a nefrectomia não induz diretamente danos parênquimatoses renais, ela não simula efetivamente os processos patológicos da insuficiência renal. Portanto, estabelecer um modelo animal adequado com RI e FA é essencial. Vale destacar que Liang Z et al. estabeleceram com sucesso um modelo de IR leve em beagles por embolização de pequenos ramos da artéria renal no rim esquerdo por duas semanas usando grânulos de esponja de gelatina, o que esteve associado à AF⁶; no entanto, um período de observação de duas semanas é geralmente considerado insuficiente para simular a DRC clínica, pois as características marcantes da nefropatia crônica, incluindo glomerulosclerose e fibrose tubulointersticial, requerem períodos prolongados de dano parênquimata renal sustentado para se desenvolverem plenamente em modelos^{animais 7,8}. Isso destaca a necessidade de um modelo crônico com um período de observação mais longo que recapitule de forma mais fiel a natureza progressiva da DRC clínica.

O presente estudo, portanto, visou estabelecer um modelo animal de RI crônica moderada combinada com FA, realizando embolização transcateter do tronco principal da artéria renal esquerda em beagles e mantendo os animais por 3 meses para permitir o desenvolvimento de patologia renal crônica estabelecida. Além disso, exploramos a patogênese da disfunção endotelial do atrio esquerdo nessas condições patológicas, testando a hipótese de que a combinação de IR moderada crônica e FA prejudicaria sinergicamente a função endotelial do atrio esquerdo por meio de inflamação aumentada e ativação do RAAS, aumentando assim o risco de trombose além de qualquer uma das condições. Esses achados podem fornecer uma compreensão mais profunda da IR crônica combinada com FA e servir de base para investigações adicionais sobre os benefícios da terapia anticoagulante em pacientes com FA e IR.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (Publicação nº 85-23, revisada em 1996). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais do Hospital Anzhen de Pequim (Aprovação nº 81700293). O protocolo do estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da nossa instituição. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais usados no estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Modelo animal e desenho experimental

1. Preparação e hospedagem de animais
   Vinte e quatro beagles machos saudáveis, com idades entre 4 e 5 anos e pesando entre 10 e 12 kg, foram obtidos da Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd. (veja Tabela de Materiais). Apenas beagles machos foram usados para minimizar os potenciais efeitos de confusão das flutuações hormonais associadas ao ciclo estro na coagulação, função endotelial e respostas inflamatórias. Todos os beagles eram alojados individualmente em gaiolas padrão mantidas a uma temperatura de 22–25 °C, com umidade de 40% a 60% e um ciclo claro e escuro de 12 h:12 h. Os animais receberam uma dieta canina de laboratório padrão e água ad libitum. Antes do início dos procedimentos experimentais, todos os beagles passavam por um período de aclimatação de 1 semana. A ecocardiografia transtorácica (ETT) foi realizada em todos os animais utilizando um sistema de ultrassom equipado com um transdutor de matriz em fase de 3,5 MHz para excluir patologias valvulares, miocardiopatia e outras doenças estruturais cardíacas.
2. Anestesia e acesso vascular
   Todos os beagles estavam em jejum por 12 horas antes do procedimento. A anestesia foi induzida pela administração intravenosa de pentobarbital de sódio em uma dosagem de 20 mg/kg via veia cefálica, administrada lentamente por aproximadamente 3–5 minutos até a confirmação da perda do reflexo palpebral. Uma vez obtida a anestesia adequada, a intubação endotraqueal foi realizada usando um tubo endotraqueal manguiçado de tamanho adequado (diâmetro interno 7,0–8,0 mm), e a ventilação mecânica foi iniciada em volume de maré de 15 mL/kg e frequência respiratória de 12–15 respirações/minuto. O monitoramento hemodinâmico contínuo foi mantido durante todo o procedimento. Um eletrocardiograma de superfície (ECG) com 3 derivações foi aplicado para monitorar a frequência cardíaca e o ritmo cardíaco, e oximetria de pulso foi usada para monitorar a saturação de oxigênio. Uma linha intravenosa periférica foi mantida para administração de fluidos (solução de Ringer lactada, infundida a uma taxa de 5–10 mL/kg/h) e doses suplementares de anestesia, se necessário.
   Posteriormente, foi feita uma incisão cutânea de aproximadamente 3–4 cm na região inguinal direita sob condições assépticas para expor a artéria femoral comum por meio de dissecação roma. O acesso arterial bem-sucedido foi confirmado por retorno sanguíneo pulsátil. Uma bainha vascular 6F foi colocada na artéria femoral direita usando a técnica modificada de Seldinger. Heparina sódica (4000 UI, diluída em 10 mL de soro fisiológico) foi administrada através da bainha para prevenir tromboembolismo.

2. Embolização da artéria renal para indução de IR crônica moderada

Um cateter multiuso 5F foi introduzido através da bainha arterial e avançado sob orientação fluoroscópica do braço C para a aorta abdominal. Foi realizada canulação seletiva da artéria renal esquerda, e a angiografia inicial da artéria renal foi realizada injetando 5–8 mL de meio de contraste iodado não iônico a uma taxa de 3 mL/s para visualizar a árvore arterial renal completa. O posicionamento bem-sucedido do cateter foi verificado pela demonstração de toda a artéria renal esquerda e seus ramos nas imagens angiográficas.

Posteriormente, a RI foi induzida por embolização transcateter do ramo principal da artéria renal esquerda usando grânulos de esponja de gelatina absorvíveis (diâmetro de 50 mg). Os grânulos de esponja de gelatina foram preparados como uma suspensão misturando aproximadamente 50 mg de grânulos com uma mistura 1:1 de meio contraste e soro fisiológico normal, para um volume total de aproximadamente 2–3 mL. A polpa de embolização foi injetada lentamente por injeção manual através do cateter durante aproximadamente 2–3 minutos sob monitoramento fluoroscópico contínuo. A embolização bem-sucedida foi confirmada por repetição da angiografia da artéria renal esquerda, que demonstrou ausência de opacificação arterial distal nos ramos embolizados. Após a confirmação angiográfica, o cateter e a bainha foram removidos, e a artéria femoral foi reparada com uma sutura de polipropileno 6-0. A ferida cirúrgica foi fechada em camadas, e os animais foram autorizados a se recuperar sob monitoramento rigoroso.

Para o grupo controle e o grupo FA (procedimento simulado), foi realizado o mesmo processo de cateterismo, e um volume igual (2–3 mL) de soro fisiológico normal foi injetado na artéria renal esquerda através do cateter multipropósito após a angiografia da artéria renal.

3. Indução AF por estimulação rápida atrial

Três meses após o procedimento de IR (ou procedimento simulado), a FA foi induzida no grupo FA e no grupo RI+FA. A FA foi induzida em um total de 12 beagles (n = 6 no grupo FA e n = 6 no grupo RI+FA). Após a reanestesiação e o acesso vascular conforme descrito acima, a veia femoral direita foi canulada para inserção do cateter. Um cateter quadripolar 6F (ver Tabela de Materiais) foi avançado sob orientação fluoroscópica e posicionado na parede lateral do átrio direito. A correta posição do cateter foi confirmada pelo registro de eletrogramas atrial característicos no canal intracardíaco, mostrando deflexões atrial claras e agudas. O limiar de estimulação diastólica foi determinado pela diminuição progressiva da tensão de saída do estimulador em decrementos de 0,1 V, de 5 V até que a perda de captura auricular fosse observada; A menor tensão, alcançando captura atrial consistente 1:1, foi registrada como o limiar de estimulação diastólica. O estimulamento auricular rápido (duração básica do ciclo, 60 ms, correspondendo a uma taxa de estimulação de 1000 batimentos por minuto; largura do pulso de saída, 2 ms; tensão, 4 vezes o limiar de estimulação diastólica, tipicamente correspondente a 2–4 V) foi aplicado continuamente por 180 minutos usando um Estimulador Cardíaco para induzir FA, conforme descrito^{anteriormente 9}. A indução bem-sucedida da FA foi confirmada pelo aparecimento de intervalos irregulares R-R sustentados no ECG superficial e potenciais atrial rápidos e desorganizados no eletrograma intracardíaco, persistindo por pelo menos 1 minuto após breve interrupção do estimulante. Todos os 12 beagles (100%) alcançaram FA sustentada ao completar o protocolo de estimulação. A duração média da FA sustentada após a interrupção do ritmo foi de 3 a 8 minutos antes da cardioversão espontânea até o ritmo sinusal.

É importante notar que, ao contrário dos protocolos de estimulação em rajadas (tipicamente rajadas de 3 a 10 s) usados para avaliar a suscetibilidade à FA, a abordagem contínua de estimulação rápida auricular de 180 minutos empregada neste estudo foi especificamente projetada para modelar a FA sustentada e provocar remodelação molecular precoce. Esse protocolo já foi bem estabelecido e amplamente validado em pesquisas sobre FA^{canina 9,10}.

4. Projeto experimental e atribuição em grupo

Animais experimentais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos (n = 6 por grupo): grupo controle, grupo RI, grupo FA e grupo RI combinado com FA (RI+FA). Beagles do grupo RI e do grupo RI+FA passaram pelo procedimento de embolização de IR no começo, e beagles do grupo Controle e Grupo FA receberam a injeção simulada de soro fisiológico normal na artéria renal. Três meses depois, a FA foi induzida nos grupos FA e RI+FA, conforme descrito acima. Uma visão geral esquemática de todo o desenho experimental e da linha do tempo é apresentada na Figura 1.

5. Determinação da eliminação da creatinina

A depuração da creatinina (CCr) foi determinada usando o método de eliminação endógena de 30 minutos¹¹. Brevemente, após anestesia, um cateter de Foley foi inserido na bexiga urinária em condições assépticas, e a bexiga foi completamente esvaziada. O período de coleta de urina de 30 minutos foi então iniciado, durante o qual toda a produção de urina foi coletada pelo cateter em um recipiente calibrado. Ao final do período de coleta de 30 minutos, a bexiga foi novamente esvaziada para garantir a recuperação completa da urina. Simultaneamente, uma amostra de sangue no ponto médio foi retirada da veia jugular para determinação da creatinina plasmática. A CCr foi calculada usando a fórmula padrão: CCr (mL/min/kg) = (concentração de creatinina na urina × volume urinal) / (concentração plasmática de creatinina × tempo de coleta), normalizada ao peso corporal.

6. Coleta de tecidos e amostras de sangue

Amostras de sangue foram coletadas da veia jugular no início da linha e antes do sacrifício nos tubos separadores de soro^{simples com EDTA 11}. Eventualmente, todos os beagles foram eutanasiados com injeção intravenosa de uma dose letal de pentobarbital sódico na dosagem de 150 mg/kg antes da recuperação da anestesia. Rins foram colhidos para exame histológico. Corações foram colhidos, e o apêndice auricular esquerdo (LAA) foi cuidadosamente dissecado, congelado rapidamente em nitrogênio líquido dentro de 5 minutos após a excisão e armazenado a −80 °C até a análise molecular. A LAA foi selecionada para análise de tecidos porque é o local mais comum de formação de trombo em pacientes com FA e, portanto, representa o local anatômico clinicamente mais relevante para avaliar a função endotelial e o risco de trombose.

7. Observação histológica

Os tecidos renais foram fixados com paraformaldeído neutro tamponado a 10% por 24 horas, desidratados por uma série graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95% e 100% etanol, 1 hora cada), limpos com xileno (duas variações, 30 min cada), incorporados em parafina e cortados em fatias de 5 μm de espessura usando um micrótomo rotativo. Posteriormente, as fatias foram coradas com HE para observar alterações histopatológicas. Especificamente, as seções foram desparafinizadas em xileno (duas variações, 10 min cada), reidratadas por uma série descendente de etanol, coradas com solução de hematoxilina por 5 min, diferenciadas em 1% de ácido clorídrico–etanol por 30 s, enxaguadas em água da torneira corrente por 10 min, contra-coloridas com solução de eosína por 2 min, desidratadas, limpas e montadas com bálsamo neutro. As seções foram examinadas sob um microscópio óptico com ampliações de 100× e 400×.

8. Ensaio de Imunossorção Ligada a Enzimas (ELISA)

As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 × g a 4 °C por 20 minutos, e então o sobrenadante (plasma) foi coletado e armazenado a −80 °C até a análise. Os níveis plasmáticos de creatinina, nitrogênio ureiano, fator de Von Willebrand (vWF), trombomodulina (TM), dimetilarginina assimétrica (ADMA), óxido nítrico (NO), inibidor do ativador de plasminogênio-1 (PAI-1), ativador de plasminogênio tecidular (t-PA), fator de necrose tumoral α (TNF-α), proteína C-reativa de alta sensibilidade (hs-CRP), interleucina-6 (IL-6), renina e aldosterona (ALD) foram examinados usando kits ELISA comerciais, conforme as instruções do fabricante. Brevemente, 100 μL de amostra ou padrão de plasma foram adicionados a microplacas de 96 poços revestidas com anticorpos, incubados a 37 °C por 2 horas, lavados quatro vezes com tampão de lavagem, incubados com anticorpo de detecção biotinilado por 1 hora a 37 °C, lavados novamente, incubados com estreptavidina-HRP conjugado por 30 minutos a 37 °C, seguidos pelo desenvolvimento do substrato TMB por 15–20 minutos no escuro. A reação foi interrompida com 50 μL de solução de parada, e a absorção foi medida a 450 nm usando um leitor de microplaca. Todas as amostras foram testadas em duplicado.

9. PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)

A extração do RNA total dos tecidos LAA foi realizada usando reagente TRIzol, seguida pela detecção da pureza e concentração de RNA usando um espectrofotômetro em razões de absorção de 260/280 nm (faixa aceitável 1,8–2,0). Um total de 1 μg de RNA foi transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA) usando um kit de reagentes RT PrimeScript. A reação de transcrição reversa foi realizada a 37 °C por 15 minutos, seguida pela inativação a 85 °C por 5 segundos. A PCR quantitativa em tempo real foi então realizada no sistema de PCR usando o SYBR Green Master Mix. O programa de ciclos térmicos consistia em desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s. O sinal de fluorescência era detectado ao final de cada etapa de extensão usando o canal SYBR Green. Os valores do ciclo de limiar (Ct) eram determinados automaticamente pelo software do instrumento. As alterações de dobra dos níveis de mRNA foram determinadas usando o método 2^−ΔΔCt . β-actina servia como controle interno. Todas as amostras foram processadas em triplicado.

10. Western blotting

Proteína total foi extraída dos tecidos LAA usando tampão de lise por radioimunoprecipitação (RIPA) (composto por 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, suplementado com coquetel de protease e inibidor de fosfatase; veja Tabela de Materiais). Os tecidos foram homogeneizados no gelo e centrifugados a 12.000 × g a 4 °C por 15 minutos, e o sobrenadante foi coletado. A concentração de proteína foi quantificada usando um kit de ensaio de proteínas BCA. Posteriormente, quantidades iguais de proteína (30 μg por pista) foram submetidas a 12% de SDS-PAGE para separação a 80 V por 30 minutos (gel de empilhamento), seguido por 120 V por aproximadamente 60 minutos (gel de resolução) e então transferido para membranas de polivinilideno fluoreto (PVDF) a 300 mA por 90 min em tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado dissolvido em TBST (soro sorológico tampado com 0,1% Tween-20) em temperatura ambiente por 2 horas, e então sondadas com anticorpos primários (veja Tabela de Materiais para fontes de anticorpos, números de catálogo e diluições) a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, as membranas foram lavadas três vezes com TBST (10 min cada) e incubadas com o correspondente anticorpo secundário conjugado com HRP (ver Tabela de Materiais) por 2 horas em temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais de TBST (10 min cada), os blots foram visualizados com um kit de quimioluminescência (ECL) aprimorado usando um sistema de imagem por quimioluminescência. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) atuou como controle interno. A análise densitométrica foi realizada usando o software ImageJ, e os níveis relativos de expressão proteica foram normalizados para GAPDH. Os pesos moleculares aproximados das proteínas detectadas eram os seguintes: vWF (~260 kDa), TM (~60 kDa), sintase endotelial de óxido nítrico (eNOS, ~130 kDa), sintase induzível de óxido nítrico (iNOS, ~130 kDa), PAI-1 (~45 kDa), t-PA (~70 kDa) e GAPDH (~36 kDa). Imagens de Western blot em corpo inteiro, sem recorte, são fornecidas na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2.

11. Análise estatística

Todos os valores foram analisados usando um software estatístico e gráfico, apresentados como média ± desvio padrão (DS). A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk antes da análise paramétrica. A homogeneidade da variância foi avaliada usando o teste de Levene. Para dados que atendem às suposições de normalidade e homogeneidade da variância, a comparação de diferenças foi realizada utilizando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste post hoc de Dunnett para comparações múltiplas contra o grupo controle. Para dados que não atendem à suposição de normalidade, foi aplicado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post hoc de Dunn. Neste estudo, todas as variáveis satisfizeram as suposições de normalidade e variância igual; portanto, análises paramétricas foram aplicadas em todo o processo. No software de análise, os dados foram inseridos em tabelas de dados agrupadas, o ANOVA unidirecional foi selecionado no menu Column Analysis, o teste de Dunnett foi escolhido para comparações post hoc, e o limiar de significância foi definido em p < 0,05.

Resultados

Modelo animal de RI e FA crônicas moderadas

Uma visão geral esquemática do desenho experimental e do cronograma é apresentada na Figura 1. As imagens representativas da angiografia da artéria renal esquerda antes e após a embolização por cateter, mostradas na Figura 2A,B, revelaram que os pequenos ramos da artéria renal foram obstruídos com sucesso após a embolização por cateter, como evidenciado ...

Discussão

O presente estudo estabeleceu um modelo animal in vivo de RI moderada combinada com FA e explorou a patogênese da disfunção endotelial do atrio esquerdo sob essas condições patológicas. Os principais achados deste estudo são os seguintes: primeiro, a embolização da artéria renal principal esquerda por 3 meses em beagles induziu com sucesso uma infecção renal moderada. Em segundo lugar, um modelo AF foi efetivamente estabelecido nos beagles. Em terceiro lugar, a função endotelial...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
6-0 Polypropylene suture	Ethicon (Johnson & Johnson)	8706H	Para reparo da artéria femoral
5F Multipurpose catheter	Cordis (Cardinal Health)	521-550S	Para canulação e embolização da artéria renal
6F Quadripolar electrode catheter	St. Jude Medical	401443	Para estimulação atrial direita
6F Vascular introducer sheath	Terumo	RS*A60K10SQ	Para acesso à artéria femoral
ABI 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)	4351105	Para ciclo térmico de qRT-PCR e detecção de fluorescência
Absorbable gelatin sponge granules (50 mg diameter)	Jinling Pharmaceutical	—	Para embolização transcateter da artéria renal; preparada como slurry com meio de contraste e solução salina (1:1)
ADMA ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E09297c	Para medição de arginina dimetilassimétrica assimétrica no plasma
Aldosterone ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E08014c	Para medição de aldosterona no plasma
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Para quantificação da concentração de proteína
Beagles (male, 4–5 years, 10–12 kg)	Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd.	—	Beagles machos saudáveis; alojados individualmente sob condições padrão
C-arm Fluoroscopy System	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	Para orientação fluoroscópica durante cateterização e angiografia
Chemiluminescence Imaging System	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Para visualização de bandas de Western blot
Creatinine ELISA Kit (canine)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C011-2-1	Para medição de creatinina no plasma
Cuffed endotracheal tube (ID 7.0–8.0 mm)	Covidien (Medtronic)	86449	Para intubação endotraqueal e ventilação mecânica
DF-5A Cardiac Stimulator	Suzhou Dongfang Electronic Technology Research Institute	DF-5A	Para estimulação atrial rápida; configurações: BCL 60 ms, largura de pulso 2 ms, voltagem 4× limiar
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106	Kit de quimioluminescência aprimorado para visualização de blot
EDTA Anticoagulant Tubes	BD Vacutainer	367835	Para coleta de sangue (separação de plasma)
eNOS Primary Antibody (rabbit)	Cell Signaling Technology	32027	Diluição 1:1000; para Western blotting (~130 kDa)
Eosin Y Solution (aqueous)	Solarbio	G1100	Para contra-coloração de H&E (2 min)
Foley Urinary Catheter (8 Fr)	C.R. Bard	0165SI08	Para coleta de urina temporizada durante a determinação do CCr
GAPDH Primary Antibody (rabbit)	Cell Signaling Technology	5174	Diluição 1:1000; controle interno para Western blotting (~36 kDa)
GraphPad Prism (version 8.0)	GraphPad Software	—	https://www.graphpad.com; para análise estatística (ANOVA de uma via, teste de Dunnett)
Hematoxylin Solution (Harris)	Solarbio	G1140	Para coloração nuclear de H&E (5 min)
Heparin Sodium Injection (unfractionated)	Changzhou Qianhong Biopharma	H32022088	4000 UI diluídas em 10 mL de solução salina normal; para anticoagulação durante a cateterização
HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	7076	Diluição 1:5000; para Western blotting
HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	7074	Diluição 1:5000; para Western blotting
hs-CRP ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E08557c	Para medição de proteína C-reativa de alta sensibilidade no plasma
IL-6 ELISA Kit (canine)	R&D Systems	CA6000	Para medição de interleucina-6 no plasma
ImageJ Software (version 1.53)	National Institutes of Health	—	https://imagej.nih.gov/ij/; para análise densitométrica de Western blot
iNOS Primary Antibody (rabbit)	Abcam	ab178945	Diluição 1:1000; para Western blotting (~130 kDa)
Lactated Ringer's Solution	Baxter	2B2324	Fluido intravenoso; infundido a 5–10 mL/kg/h durante os procedimentos
Light Microscope	Olympus	BX53	Para exame histológico de seções renais coradas por HE
Mechanical Ventilator (veterinary)	Midmark	Matrx Model 3000	Volume corrente 15 mL/kg; frequência respiratória 12–15 respirações/min
Microplate Reader	BioTek	Synergy HTX	Para medição de absorbância de ELISA a 450 nm
Neutral Buffered Paraformaldehyde (10%)	Solarbio	P1110	Para fixação de tecido renal (24 h)
NO ELISA Kit (canine)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A012-1-2	Para medição de óxido nítrico no plasma
Non-ionic Iodinated Contrast Medium (Iohexol)	GE Healthcare	Omnipaque 350	5–8 mL por injeção a 3 mL/s para angiografia da artéria renal
PAI-1 ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E13043c	Para medição do inibidor de ativador de plasminogênio no plasma
PAI-1 Primary Antibody (rabbit)	Abcam	ab66705	Diluição 1:1000; para Western blotting (~45 kDa)
Paraffin Wax	Leica Biosystems	39601006	Para incorporação de tecido
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara Bio	RR037A	Para transcrição reversa de RNA para cDNA
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78440	Adicionado ao tampão RIPA para extração de proteína
Pulse Oximeter (veterinary)	Nonin Medical	9847V	Para monitoramento contínuo de SpO2 durante os procedimentos
PVDF Membranes (0.45 μm)	Millipore	IPVH00010	Para transferência de proteína em Western blotting
Renin ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E08700c	Para medição de renina no plasma