Expressão de HMGA1 e HAND1 e sua importância nos tecidos do câncer de larina

Resumo

Essa pesquisa descobriu níveis aumentados de HMGA1 e diminuição da expressão de HAND1 no câncer de laringe, indicando uma relação inversa e associações significativas com metástase e estágio clínico, sugerindo que ambos contribuem para a progressão tumoral.

Resumo

Este estudo investigou os perfis de expressão dos genes HMGA1 e HAND1 no carcinoma escamoso laríngeo (LSCC), bem como em tecidos mucosos laríngeos normais adjacentes, por meio da aplicação de imunohistoquímica e metodologias RT-PCR. O objetivo era investigar seus possíveis papéis na iniciação, avanço, invasão e metástase do LSCC. Tanto HMGA1 quanto HAND1 foram detectados em tecidos cancerosos e normais adjacentes. No entanto, HMGA1 demonstrou expressão significativamente elevada nos tecidos LSCC, enquanto HAND1 apresentou níveis de expressão consideravelmente reduzidos. A expressão elevada de HMGA1 esteve positivamente associada à metástase dos linfonodos (100,0% vs. 50,0%) e estágio clínico avançado (91,7% vs. 44,4%), mas não esteve associada ao grau histológico tumoral, tipo clínico ou idade do paciente. Em contraste, a redução da expressão da proteína HAND1 esteve associada à metástase dos linfonodos, estágio clínico e grau patológico, sugerindo um papel na progressão e metástase tumoral. Além disso, foi observada uma correlação linear negativa entre as expressões de HMGA1 e HAND1, sugerindo uma possível interação regulatória na qual HMGA1 pode suprimir a expressão de HAND1. Esses resultados indicam que HMGA1 e HAND1 possuem funções complementares na patogênese da LSCC, com HMGA1 potencialmente facilitando o desenvolvimento tumoral e HAND1 atuando como supressor. A interação entre esses dois genes pode oferecer novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares que impulsionam a progressão e a metástase dos LSCC.

Introdução

O câncer de laringe é o segundo tumor maligno primário mais comum na cabeça e pescoço, atrás apenas do câncer nasofaíngeo, representando de 26% a 30% de todos os tumores de cabeça e pescoço no^{mundo 1}. Mais de 90% dos cânceres de laringe são classificados como carcinoma de células escamosas laríngeas (LSCC⁾². Os principais tratamentos para o câncer de laringea são cirurgia e radioterapia. Recidiva local e metástase linfonodal são as principais causas de morte em pacientes com câncer de laringe. Portanto, o manejo eficaz da recidiva e metástase continua sendo um grande desafio clínico. Com o avanço da biologia molecular, vários genes com expressão anormal no câncer de laringe foram identificados. No entanto, os mecanismos subjacentes à invasão tumoral e à metástase no câncer de laringe permanecem incertos e continuam sendo uma área que necessita de investigação adicional.

Proteínas do grupo A de alta mobilidade (HMGA) são proteínas que se ligam à cromatina não histonas localizadas no núcleo celular. O HMGA1 se liga ao DNA e às proteínas associadas, induzindo alterações estruturais da cromatina que regulam a transcrição^{gênica 3}. Como regulador transcricional associado à cromatina, o HMGA1 modula a expressão de múltiplos genes relacionados ao tumor envolvidos na proliferação e metástase. Estudos anteriores demonstraram que o HMGA1 é superexpresso em uma ampla gama de cânceres humanos, incluindo tireoides, colorretal, pâncreas e malignidades de cabeça e^pescoço 4,5,6,7, assim como em outros tumores epiteliais e sólidos relatados na literatura. O HMGA1 regula a tumorigênese modulando a expressão de múltiplos genes-alvo a jusante envolvidos na proliferação e metástase⁸.

Os genes expressos por derivados cardíacos e cristais neurais (HAND) são membros da família bHLH (hélice–loop–hélice básica), incluindo HAND1 e HAND2. O HAND1, como fator de transcrição, desempenha um papel na diferenciação de trofoblastos e no desenvolvimento^{cardíaco 9}. No entanto, o mecanismo de expressão de HAND1 na camada celular extraembrionária permanece incerto. Foi confirmado que o HMGA1 se liga diretamente ao promotor do HAND1, inibindo a atividade do HAND1 tanto in vivo quanto in^{vitro 10}. A HAND1, como proteína repressora, tem sido implicada na regulação da diferenciação celular e da formação do câncer. Estudos mostraram que a expressão de HAND1 é silenciada e hipermetilada no câncer gástrico^{humano 11}, câncer de pâncreas¹², câncer de ovário¹³ e câncer de tireoide¹⁴. No entanto, até onde sabemos, poucos estudos investigaram a expressão da HAND1 em tecidos de câncer de laringe.

No presente estudo, imunohistoquímica (método de detecção em duas etapas) e reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR) foram usadas para detectar a expressão das proteínas HMGA1 e HAND1 e mRNA em LSCC e tecidos mucosos normais adjacentes. A imunohistoquímica possibilita a visualização da localização de proteínas dentro da arquitetura tecidual, enquanto a RT-PCR permite a detecção sensível da expressão gênica no nível transcricional, fornecendo insights complementares sobre padrões de expressão de proteínas e mRNAs. Comparado à PCR quantitativa (qPCR), que oferece maior sensibilidade e quantificação precisa, Western bloting, que permite validação em nível de proteína, mas carece de contexto espacial, e sequenciamento de RNA (RNA-seq), que oferece perfil transcriptômico abrangente, mas requer análise computacional avançada, o uso combinado de imunohistoquímica e RT-PCR representa uma estratégia custo-efetiva e clinicamente aplicável para investigação de biomarcadores. O estudo teve como objetivo explorar o papel e a correlação desses dois fatores na ocorrência, desenvolvimento, progressão e metástase das LSCC. Além disso, avaliar a expressão de HMGA1 e HAND1 pode fornecer biomarcadores para diagnóstico e avaliação prognóstica no câncer de laringe, potencialmente melhorando a estratificação de risco e auxiliando na tomada de decisões clínicas.

Protocolo

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Popular Shijiazhuang (Aprovação nº YKLS 2026 Nº 041; 27 de março de 2026). O estudo foi conduzido de acordo com o Regulamento de Revisão Ética de Pesquisa Biomédica envolvendo Sujeitos Humanos, o Regulamento de Revisão Ética de Ciências da Vida e Pesquisa Médica envolvendo Sujeitos Humanos, a Declaração de Helsinque e as Diretrizes Éticas Internacionais para Pesquisa Relacionada à Saúde envolvendo Seres Humanos. Amostras de tecido humano foram obtidas de amostras cirúrgicas arquivadas, em conformidade com os requisitos éticos institucionais, garantindo anonimização e confidencialidade dos dados dos pacientes. O consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes, ou uma renúncia de consentimento foi concedida pelo comitê de ética para o uso de amostras arquivadas anonimizadas, conforme aplicável.

Materiais experimentais

Origem dos espécimes

Um total de 42 casos de tecidos de CCL e 25 casos de tecidos mucosos laríngeos normais adjacentes foram obtidos a partir de amostras de resseção cirúrgica de CCL no Departamento de Otorrinolaringologia-Cirurgia de Cabeça e Pescoço de Hebei entre fevereiro de 2011 e agosto de 2012. Desses, 25 casos de mucosa normal adjacente (coletados de um local > 1,0 cm da borda do câncer) foram patologicamente confirmados como inflamatórias ou mucosa normal. As 42 amostras do LSCC foram todas confirmadas patologicamente como carcinoma de células escamosas. Todos os tecidos eram armazenados a -80 °C. Os 42 pacientes eram do sexo masculino, sem pacientes do sexo feminino. Entre os casos de LSCC, 15 foram bem diferenciados, 18 moderadamente diferenciados e 9 pouco diferenciados. Dezoito casos apresentaram metástase linfática, enquanto 24 casos não. O estadiamento clínico foi baseado no sistema de classificação e estadiamento TNM (UICC, 2002), com 20 casos nos estágios I e II, e 22 casos nos estágios III e IV. Houve 30 casos de tipo supragótico, 11 casos de tipo glótico e 1 caso de tipo subgótico. A faixa etária dos pacientes era de 40 a 75 anos, com idade mediana de 60 anos. Nenhum dos pacientes recebeu radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia, e os dados clínicos estavam completos.

Métodos experimentais e etapas

Procedimento de coloração com HE

Preparação de lâminas e coloração por hematoxilina–eosina

As lâminas de vidro para imunohistoquímica foram inicialmente deixadas de molho em ácido concentrado por 24 horas, seguidas por lavagem cuidadosa sob água da torneira corrente por pelo menos 10 minutos para remover o ácido residual, e imersão em água destilada por 30 minutos duas vezes com agitação suave para garantir um enxágue completo. Após deixar de molho em etanol 95% por 2 horas, as lâminas foram secas em um forno a 60 °C, depois imersas em uma mistura de APES: acetona (1:49, v/v) por 1 minuto, com uma sacudida suave para garantir uma cobertura uniforme, seguida de enxágue com acetona pura. Por fim, eram secas ao ar em temperatura ambiente (20–25 °C) para garantir a adesão adequada dos tecidos durante os procedimentos subsequentes de coloração.

As seções de tecido embutidas em parafina foram imersas sequencialmente no xileno I e xileno II por 10 minutos cada para remover a parafina, seguidas por reidratação por etanol graduado (100%, 95%, 80%) por 5–10 minutos cada, e então enxaguadas em água destilada por 2 minutos. As seções foram então submetidas à coloração por hematoxilina–eosina (HE) da seguinte forma: coloração por hematoxilina por 4 minutos, enxaguamento sob água da torneira corrente por 3 minutos com fluxo contínuo para remover o excesso de manche, diferenciação usando ácido clorídrico a 1% em etanol por 30 segundos, lavagem três vezes com água da torneira para terminar a diferenciação e coloração com eosina por 10 segundos. A desidratação graduada rotineira foi realizada sequencialmente, utilizando sucessivamente 70% de etanol, 80% de etanol, 95% de etanol, etanol anidro I e etanol anidro II por 5 minutos cada. Após a secagem, o ferrolho era montado usando bálsamo neutro.

Procedimento imunohistoquímico

Seções de parafina de 4 μm de espessura foram cortadas, colocadas planas sobre lâminas revestidas com APES e colocadas em um forno a 67 °C durante a noite, seguidas pela desparafinização com Xylene I e II por 10 minutos cada. A desidratação gradual foi realizada com álcool de 100%, 90% e 70% por 5 minutos cada, seguida de lavagem com água da torneira e água destilada por 3 minutos. Para bloquear a atividade endógena da peroxidase, as lâminas foram incubadas com solução recém-preparada de metanol-peróxido de hidrogênio a 3%, garantindo cobertura completa da seção de tecido à temperatura ambiente (20–25 °C) por 20 minutos, seguidas por três lavagens com água destilada por 5 minutos em 0,01 M PBS.

A recuperação do antígeno foi realizada imergindo lâminas em tampão de citrato (pH 6,0) e aquecendo em panela de pressão a ~ 95–100 °C por 8 minutos para HMGA1 e 10 minutos para HAND1 com tampas firmemente fechadas para manter condições de pressão consistentes. As seções foram então resfriadas à temperatura ambiente (20–25 °C) e lavadas três vezes em 0,01 M PBS por 3 minutos cada sob agitação suave. Os anticorpos primários contra HMGA1 e HAND1 foram diluídos em diluente de anticorpos (1:150 e 1:100, respectivamente) e misturados suavemente por pipeteamento antes de serem aplicados uniformemente para cobrir completamente cada seção de tecido. Os lâminas foram incubados durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada. Após incubação durante a noite, as lâminas foram removidas da câmara umidificada e deixadas para se equilibrar à temperatura ambiente por 10 minutos. As lâminas foram lavadas três vezes com 0,01 M PBS (5 min por lavagem) sob agitação suave para remover os anticorpos não ligados. O excesso de líquido foi removido e um anticorpo secundário (polímero anti-coelho/camundongo marcado com HRP) foi adicionado para cobrir completamente as superfícies das seções do tecido. A incubação adicional foi realizada a 37 °C por 35 minutos.

A solução de substrato DAB foi aplicada em gota para cobrir o tecido, e o desenvolvimento da cor foi monitorado ao microscópio por 1–3 minutos até que a mancha marrom aparecesse e cessasse imediatamente com enxágue com água destilada assim que a intensidade ideal da coloração fosse alcançada. Foram realizadas re-colorações com hematoxilina, diferenciação de álcool com ácido clorídrico e solução de amônia para reversão do azul. Isso foi seguido por desidratação graduada de rotina com álcool, transparência de xileno e montagem com bálsamo neutro para observação ao microscópio. O PBS foi usado como controle em branco no lugar do anticorpo primário. Além disso, seções previamente confirmadas para HMGA1 do carcinoma escamoso da cabeça e pescoço e seções de tecido placentário HAND1-positivas foram usadas como controles positivos para garantir a qualidade e consistência da coloração.

Determinação do resultado

O cromógeno utilizado neste experimento é o sistema DAB-H2O2. Após a recoloração por hematoxilina, a coloração positiva por HMGA1 e HAND1 é observada principalmente no núcleo celular, com alguma coloração citoplasmática. Para avaliação, a região com maior densidade de células coloridas positivamente foi identificada sob baixa ampliação (×40). Sob ampliação ×100, cinco campos com a maior densidade celular positiva foram selecionados, e 100 células foram contadas em cada campo. A porcentagem média de células positivas dos cinco campos é usada como resultado para cada slide. Os critérios de classificação foram os seguintes: sem células coradas (-), células positivas < 25% (+), células positivas 25%–50% (++) e células positivas > 50% (+++), baseadas em um método de pontuação percentual semi-quantitativo comumente usado em análises imunohistoquímicas. A avaliação foi realizada de forma independente por dois patologistas qualificados, de forma duplamente^{cega 15, 16, 17}. Se as opiniões divergem, devem discutir e chegar a uma conclusão¹⁸.

Método RT-PCR

Primers

Os primers foram projetados usando software de design de primers baseado em sequências de genes alvo, com atenção à especificidade do primer, compatibilidade com temperatura de fusão e tamanho esperado do produto. As sequências detalhadas dos primers, tamanhos dos produtos e temperaturas de recozimento estão resumidos na Tabela 1. Os primers foram sintetizados a uma concentração de 2 OD, divididos em dois tubos e diluídos a 10 pmol/μL com água tratada com DEPC para armazenamento a -20 °C. A temperatura de recozimento foi calculada usando a fórmula: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)

Tratamento RNase de materiais e equipamentos experimentais:

Itens de plástico (por exemplo, pontas de pipeta, tubos EP): Os itens plásticos eram colocados em um frasco de reagente esterilizado de boca larga, água preparada tratada com DEPC era adicionada até que os itens estivessem totalmente submersos, e os materiais eram incubados durante a noite em uma exaustão à temperatura ambiente (20–25 °C). Depois, eram esterilizados sob pressão por 120 minutos e secados a 65 °C.

Itens de vidro: Os vidros foram deixados de molho durante a noite em ácido, bem enxaguados, secos, embrulhados em papel alumínio e assados em forno a 200 °C por 6 horas e armazenados em um local limpo para uso futuro.

Itens de metal (por exemplo, tesouras, pinças): Os itens de metal foram limpos, assados em um forno a 200 °C por 6 horas e armazenados em um local limpo para uso futuro.

Preparação de soluções

0,1% (v/v) Solução DEPC: 1 mL de DEPC foi adicionado a 1000 mL de água destilada para alcançar uma concentração final de 0,1% (v/v), agitado bem, incubado a 4 °C durante a noite, esterilizado por autoclav e armazenado a 4 °C.

75% (v/v) Solução de etanol: 75 mL de etanol absoluto foram misturados com 25 mL de água tratada com DEPC para alcançar uma concentração final de 75% (v/v), e armazenados a 4 °C.

Extração total de RNA do tecido

Após a extração do RNA, a integridade do RNA foi avaliada antes da transcrição reversa e análise a jusante. 80 mg de tecido foram pesados usando uma balança eletrônica, cortados em pequenos pedaços e colocados em um homogeneizador de vidro pré-tratado. 1 mL de reagente de extração de RNA pré-resfriado foi adicionado a 4 °C, e a amostra foi homogeneizada no gelo usando moagem repetida até que um lisado uniforme sem fragmentos visíveis de tecido fosse obtido, evitando a formação de bolhas. A mistura homogeneizada foi transferida para um tubo EP livre de RNase de 1,5 mL e incubada no gelo por 5 min. 400 μL de clorofórmio foi adicionado a cada tubo, vórtice vigorosamente por 10–15 s para garantir a mistura completa de fase, seguido de incubação no gelo por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 4 °C, 12.000 x g por 15 minutos. Após a centrifugação, a fase aquosa superior foi cuidadosamente aspirada usando uma pipeta sem RNase, sem perturbar a camada de interfase em um novo tubo. Um volume igual de isopropanol foi adicionado, misturado invertendo suavemente o tubo de 8 a 10 vezes até que as camadas desaparecessem, e incubado a -20 °C por pelo menos 10 minutos. A mistura foi centrifugada a 4 °C, 12.000 x g por 10 minutos. A camada sobrenadante foi descartada, 400 μL de etanol gelado a 75% foram adicionados para suspender o pellet de RNA. A mistura foi novamente centrifugada a 4 °C, 12.000 x g por 5 minutos. A camada sobrenadante foi descartada, e o pellet de RNA ficou levemente seco. O pellet de RNA foi dissolvido em água sem RNase e armazenado a -80 °C para uso futuro.

Detecção de integridade de RNA

Para a detecção da integridade do RNA, 5 μL da amostra de RNA foram misturados com 5 μL de tampão de carga azul de bromofenol, e a eletroforese foi realizada em um gel de agarose a 2%. A integridade do RNA foi considerada aceitável quando as bandas 28S, 18S e 5S claras eram visíveis, sem borrões evidentes.

Transcrição reversa (RT) para sintetizar cDNA

6 μL de RNA foram pré-aquecidos a 70 °C por 10 minutos, depois 25 mM de_MgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV Buffer (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) e água desionizada foram adicionados sequencialmente sobre gelo para alcançar um volume final de reação de 20 μL, seguido por mistura suave e breve centrifugação. As condições de reação foram 25 °C por 1 min, 42 °C por 60 min, 98 °C por 5 min, e depois armazenadas a 4 °C indefinidamente. Uma vez que a reação atingia 4 °C, o produto era retirado da máquina de PCR, usado como molde de cDNA para a próxima reação de PCR e armazenado a -20 °C para uso posterior.

Amplificação por PCR

Para cada reação de PCR, a mistura continha molde de cDNA (1 μL), primer direto específico para HMGA1, HAND1 ou GAPDH (1 μL), primer reverso específico para o gene alvo ou GAPDH (1 μL), mistura mestre de PCR (10 μL) e água tratada com DEPC (7 μL), para um volume total de 20 μL. Reações separadas foram preparadas para cada gene-alvo (HMGA1, HAND1) e o gene de controle interno (GAPDH), com cada reação contendo seu respectivo par de estronçadores diretos e reversos específicos do gene.

O volume total da reação foi de 20 μL. Após misturar suavemente os componentes da reação e centrifugar brevemente por 5–10 s em baixa velocidade, o tubo foi colocado em uma máquina de PCR pré-aquecida e amplificado de acordo com as condições da reação na Tabela 2.

Confirmação e análise de produtos amplificados por PCR

Preparação do gel

2 g de agarose foram pesados e colocados em um frasco triangular. 2 mL de tampão de eletroforese TAE 50× e 100 mL de água destilada (preparar um gel de agarose a 2%) foram adicionados, depois aquecidos em um micro-ondas com redemoinho intermitente (intervalos de 15–20 s) até que a agarose estivesse completamente dissolvida. Após o resfriamento a aproximadamente 55 °C, 10 μL de solução EB foram adicionados e misturados completamente. O gel era então despejado em uma bandeja de gel limpa em temperatura ambiente (20–25 °C), lavado com água destilada e um pente era inserido para criar poços de amostras. A espessura do gel era de 0,4 cm. A bandeja foi colocada sobre uma superfície plana em temperatura ambiente (20–25 °C) por 30 minutos até que o gel solidificasse completamente. O pente foi cuidadosamente removido.

Carregamento de amostras

4 μL de cada amostra de DNA foram adicionados aos poços do gel, e o Marcador de DNA foi adicionado ao poço mais à esquerda.

Eletroforese

A bandeja de gel carregada foi colocada em um tanque de eletroforese preenchido com tampão de eletroforese TAE, garantindo que o nível do tampão permanecesse cerca de 1 mm acima da superfície do gel. Uma das extremidades dos poços ficava no cátodo (para permitir que o DNA migre em direção ao ânodo). O sistema de eletroforese era conectado a uma fonte de alimentação e funcionava em 120 V e 60 mA por aproximadamente 45 minutos, até que o buffer de carga migrava além da linha média do gel, após o que a energia era desligada.

Observação e imagem de resultados

Após a eletroforese, o gel foi cuidadosamente removido, e os resultados foram observados sob um transiluminador UV e comparados com o Marcador de DNA para determinar se o peso molecular dos fragmentos amplificados aparecia nas posições esperadas. O sistema de imagem em gel era usado para capturar imagens e salvar os resultados no computador.

Configuração de controle

Água destilada foi usada em vez de cDNA como controle negativo.

Análise semi-quantitativa

Os resultados da eletroforese em gel de agarose foram analisados e capturados usando o sistema de imagem em gel. Software de análise de imagem era usado para analisar o brilho das faixas. Foram medidos os valores absolutos integrados de OD da banda de amplificação do gene alvo e da correspondente banda de amplificação do gene de controle interno. Os resultados foram expressos como a razão entre o valor absoluto integrado de OD da banda alvo e o valor absoluto integrado de OD da correspondente banda interna de controle.

Ou seja, expressão relativa = valor OD do gene alvo / valor OD do gene de controle interno.

Análise estatística

Todos os dados foram organizados usando Excel e analisados com software estatístico. As variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio padrão (DS) e comparadas entre dois grupos usando o teste t de amostras independentes. Variáveis categóricas nominais, incluindo taxas de expressão positiva imuno-histoquímica, foram analisadas usando o teste χ² . Variáveis ordinais categóricas, incluindo grau patológico e estágio clínico, foram analisadas usando o teste de soma de postos (teste U de Mann-Whitney para comparações em dois grupos, quando aplicável). A correlação entre a expressão de HMGA1 e HAND1 foi avaliada por meio de análise linear. Todos os testes foram de duas caudas; P < 0,05 foi considerada estatisticamente significativa, e P. < 0,01 foi considerada altamente significativa.

Resultados

Resultados da detecção imuno-histoquímica

Imagens representativas de coloração de hematoxilina–eosina (HE) ilustrando a morfologia histológica da mucosa laríngea normal adjacente e do LSCC com diferentes graus de diferenciação (bem, moderado e pobre) são apresentadas. Especificamente, a Figura 1A mostra a mucosa laríngea normal adjacente, a Figura 1B mostra CCL bem diferenciada,

Discussão

O câncer de laringe, um dos tumores mais comuns na cabeça e no pescoço, tem apresentado uma incidência crescente nos últimos anos, provavelmente associada a fatores ambientais e relacionados ao estilo de vida. Como outros tumores malignos, sua recidiva e metástase continuam sendo as principais causas de morte. Com os avanços na biologia molecular, muitos fatores associados ao desenvolvimento do câncer de laringe foram identificados, mas os mecanismos de início e metástase ainda não são t...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máquina Automática de Incorporação de Tecidos	Sakura Finetek, Tóquio, Japão	Tissue-Tek TEC 5	Imersão de parafina
Microtome	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha	RM2135	Separação (4 & mu; m)
Secador de Deslizantes	Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., China	CS-VI	Secagem por lâmina
Incubadora de Aquecimento	Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., China	303-4A	Incubação controlada por temperatura
Microscópio Óptico	Olympus Corporation, Tóquio, Japão	BX41	Observação histológica
Sistema de Captura de Imagem	QImaging, Canadá	QCapture Pro 7	Imagem por microscopia
Supino limpo	Fábrica de Equipamentos de Semicondutores Pequim Xicheng, China	SW-CJ-1FD	Espaço de trabalho estéril
Centrífuga refrigerada	Fábrica de Reparo de Instrumentos Médicos de Pequim, China	LXJ-64-01	Separação de RNA
Centrífuga de Mesa	Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., China	PQ-1600A	Processamento de RNA/DNA
Agitador magnético	Fábrica de Instrumentos Médicos Jintan de Jiangsu, China	HJ-3	Preparação da solução
Mini Mixer	Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., China	H-1	Mistura de samples
Balanço Eletrônico	METTLER Toledo, Suíça	PB3002-S	Pesagem de amostras
Amplificador de PCR	Eppendorf AG, Alemanha	Mastercycler 5333	Amplificação por PCR
Fonte de Alimentação por Eletroforese	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pequim, China	DYY-6C	Controle de tensão
Tanque de eletroforese	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pequim, China	DYCZ-24DN	Eletroforese em gel
Micro-ondas	Instituto de Pesquisa em Aplicações Médicas Zhongda de Xangai, China	WD800SL23	Preparação de agarose
Transiluminador UV	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pequim, China	WD-9403B	Visualização de DNA
Sistema de Imagem em Gel	Anlai Co., Ltd., China	AlphaImager HP	Documentação do gel
Geladeira (4 & deg; C)	Haier Biomedical, China	BC-165D	Armazenamento de amostras
Freezer de Ultrabaixa Temperatura	Haier Biomedical, China	DW-86L388	Armazenamento (-80 ° C)
Caixa de gelo	Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., China	FZ-IB-20L	Transporte de amostras
Sacos de Armazenamento Criogênico	Shanghai Yili Technology Co., Ltd., China	YL-ULT-50	Preservação de amostras
Pipetas de Pesquisa	Eppendorf AG, Alemanha	Research Plus	Manuseio de líquidos
Reagente de Extração de RNA (TRIzol)	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), EUA	15596026	Extração de RNA
Kit de Transcrição Reversa	Takara Bio Inc., Japão	RR037A	Síntese de cDNA
Mistura Master-Mestre de PCR	Takara Bio Inc., Japão	RR820A	Amplificação por PCR
dNTP Mix	Takara Bio Inc., Japão	4030 (típico)	Componente de PCR
Inibidor de RNase (RNasin)	Promega, EUA	N2111	Proteção de RNA
Oligo(dT) Primer	Takara Bio Inc., Japão	3806 (típico)	Primer de síntese de cDNA
Agarose	Sigma-Aldrich, EUA	A9539	Preparação do gel
TAE Buffer (50 vezes)	Sigma-Aldrich, EUA	TAE50X-1L (típico)	Buffer de eletroforese
Marcador de DNA (Escada)	Takara Bio Inc., Japão	DL2000 (3421A)	Referência de tamanho
Brometo de etídio (EtBr)	Bio-Rad, EUA	1610433	Visualização de DNA
PBS Buffer	Gibco (Thermo Fisher Scientific), EUA	10010023	Amortecedor de lavagem
Água tratada com DEPC	Invitrogen, EUA	AM9916	Proteção de RNA
Clorofórmio	Sigma-Aldrich, EUA	C2432	Extração de RNA
Isopropanol	Merck, Alemanha	109634	Precipitação de RNA
Etanol (absoluto)	Merck, Alemanha	100983	Desidratação
Metanol	Merck, Alemanha	106009	Bloqueio da peroxidase
Peróxido de hidrogênio (H2O2)	Sigma-Aldrich, EUA	H1009	Bloqueio endógeno da peroxidase
Xylene	Sigma-Aldrich, EUA	534056	Deparafinização
Buffer de Recuperação de Antígeno de Citrato	Abcam, Reino Unido	ab93678	Recuperação de antígeno
Diluente de Anticorpos	Dako, Dinamarca	S3022	Diluição de anticorpos
Anticorpo primário HMGA1	Abcam, Reino Unido	ab129153	Diluição 1:150
Anticorpo primário HAND1	Abcam, Reino Unido	ab200040	Diluição 1:100
Anticorpo secundário (conjugado com HRP)	Dako, Dinamarca	K5007	Sistema de detecção
Kit de Substrato DAB	Dako, Dinamarca	K3468	Detecção cromogênica
Mancha de Hematoxilina	Sigma-Aldrich, EUA	H9627	Coloração nuclear
Mancha de Eosina	Sigma-Aldrich, EUA	E4009	Coloração citoplasmática
Meio de montagem de bálsamo neutro	Sinopharm Chemical Reagent Co., China	10004160	Montagem do ferrolho
HMGA1 Primers	Sintetizado personalizado (por exemplo, IDT/Sangon)	N/A	Amplificação gênica
HAND1 Primers	Sintetizado personalizado (por exemplo, IDT/Sangon)	N/A	Amplificação gênica
Primers GAPDH (controle interno)	Sintetizado personalizado	N/A	Gene de limpeza
APES (Aminopropiltrietoxisilano)	Sigma-Aldrich	N/A	Revestimento deslizante
Tubos Microcentrífugas sem RNase	Eppendorf	N/A	Manuseio de RNA
Ponteiras de pipeta sem RNase	Eppendorf	N/A	Manuseio de líquidos
Bandeja de Fundição e Pente de Gel de Agarose	Genérico	N/A	Preparação do gel
Software de Design de Primers	Integrated DNA Technologies, EUA	Ferramenta PrimerQuest	Design do primer
Software de Análise de Imagens	Media Cybernetics, EUA	Image-Pro Plus 6.0	Quantificação de bandas
Software de Análise Estatística	IBM Corp., EUA	SPSS Versão 13.0	Análise estatística