Artigo de método

Mapeamento da Imunidade Infantil com Entrada Mínima: Perfil Integrativo de Célula Única e Multiômico

DOI:

10.3791/70279

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3 de abril de 2026

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1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a coleta e preservação de amostras de sangue de pacientes neonatais e pediátricos e a aplicação de scRNA-seq, proteômica e citometria de fluxo espectral para caracterizar as populações de células imunes dessas amostras.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao nascer, o sistema imunológico neonatal é abruptamente confrontado com um ambiente radicalmente diferente, rico em estímulos microbianos e ambientais. Evidências crescentes sugerem que a imunidade na infância não é apenas imatura, mas sim adaptada de forma única para atender às demandas distintas dessa janela de desenvolvimento. Durante esse período, o sistema imunológico é altamente dinâmico, passando por rápidas mudanças para acomodar a paisagem externa em constante mudança. Compreender esse cenário imunológico complexo e em evolução requer estudo direto em recém-nascidos. No entanto, uma limitação importante nessas investigações é o baixo volume sanguíneo total em recém-nascidos (~100 mL/kg), que restringe a quantidade que pode ser coletada com segurança para pesquisas, especialmente em peso extremamente baixo ao nascer (ELBW) ou em bebês extremamente prematuros. Em nosso trabalho recente, abordamos essa limitação demonstrando como o perfil imunológico de alta dimensão pode ser realizado usando volumes minúsculos de sangue neonatal. Introduzimos um conjunto de protocolos otimizados para amostragem longitudinal ao longo da vida inicial e aplicamos técnicas avançadas, incluindo citometria de fluxo, proteômica e sequenciamento de RNA de célula única, para maximizar a informação obtida a partir de entrada mínima. Juntos, esses métodos possibilitam uma visão abrangente das assinaturas transcriptômicas e proteômicas das células imunes circulantes em neonatos, oferecendo novos insights sobre a trajetória única da imunidade na vida inicial.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo é otimizado para amostras de sangue de 100 a 250 μL processadas dentro de 12 horas após a coleta, seja criopreservadas ou usadas imediatamente. Ao nascer, o sistema imunológico neonatal é lançado para um ambiente radicalmente diferente, enriquecido com estímulos microbianos e ambientais que antes estavam ausentes no ambiente intrauterinoprotegido 1,2. Essa mudança exige que o sistema imunológico se adapte e responda a uma vasta gama de novos antígenos, um processo essencial para a sobrevivência, mas que também apresenta desafiossignificativos 1,2. Evidências crescentes sugerem que a imunidade na infância não é simplesmente imatura ou uma versão miniatura do sistema imunológico adulto. Em vez disso, é especialmente adaptado para atender às necessidades específicas deste período crítico de desenvolvimento 3,4. Durante essa janela neonatal, os componentes celulares do sistema imunológico, incluindo vários tipos de células T, células B e células mieloides, amadurecem e desenvolvem características e funções únicas específicas da vidainicial 5,6,7,8. Apesar de sua importância, a imunidade neonatal continua difícil de estudar diretamente devido a restrições éticas e práticas. Uma limitação importante é o baixo volume sanguíneo em recém-nascidos, com média de ~100 mL/kg 9,10. Esse desafio se torna ainda mais evidente ao coletar sangue de bebês extremamente prematuros (nascidos antes das 30 semanas de gestação) e bebês ELBW, que podem pesar apenas 400 g com apenas 40 mL de sangue circulante. Isso restringe a quantidade de sangue que pode ser coletada com segurança, ressaltando a necessidade de abordagens que maximizem a produção de dados a partir de amostras mínimas. Para enfrentar esse desafio, nosso trabalho demonstra protocolos otimizados para o perfilamento imunológico de alta dimensão usando volumes sanguíneos mínimos (100-250 μL), como os obtidos de bebês ELBW.

Avanços recentes na coleta e processamento de sangue permitiram o estudo das respostas imunes em populações onde a aquisição de amostras é tradicionalmente difícil. Dispositivos de microagulha, como os sistemas Tasso e Touch Activated Phleboty, foram inicialmente desenvolvidos para coleta de sangue conveniente em casa em adultos. Desde então, eles foram adaptados para uso em bebês, permitindo que cuidadores primários e equipes clínicas coletem amostras com desconforto mínimo. Além disso, podem ser usados em casa sem o estresse de visitas clínicasrepetidas, facilitando a adesão e a acessibilidade. Um microtubo de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) deve ser usado com o dispositivo e enviado durante a noite ao laboratório, seguindo os protocolos adequados de risco biológico. Na manhã seguinte, quando as amostras chegarem, elas devem ser processadas usando métodos de lise de glóbulos vermelhos (RBC) para capturar células imunescirculantes 6. Vale notar que os tubos EDTA permitem o isolamento de células vivas, mas considerações de tempo são importantes. Para ensaios funcionais com estimulação, as amostras devem ser processadas em menos de 4 horas e, idealmente, em menos de 2 horas após a coleta. Para os ensaios fenotípicos não funcionais apresentados abaixo, as amostras devem ser processadas em até 12 horas para permitir o envio durante a noite, garantindo a recuperação, à medida que a viabilidade celular diminui ao longo dotempo 12. Comparada à separação tradicional por gradiente de densidade com Ficoll, a lise é mais rápida, menos intensiva em mão de obra e proporciona maior recuperação13. No entanto, o isolamento celular mononuclear do sangue periférico por lise pode deixar granulócitos contaminantes, reduzindo a pureza, mas pode ser vantajoso para estudos interessados nesses tiposcelulares 14. Esses trade-offs destacam como adaptações metodológicas equilibram viabilidade e precisão ao estudar amostras clínicas raras ou sensíveis, como as de neonatos. O manuseio a jusante de células isoladas também se beneficiou de refinamentos metodológicos. A criopreservação com soro fetal bovino (FBS) e dimetil sulfóxido (DMSO) continua sendo uma abordagem robusta para células imunes, especialmente no sangue fetal e neonatal, onde a viabilidade e recuperação celular são críticas. Além de otimizar o processo de coleta de sangue, também adotamos técnicas posteriores que permitem a extração máxima de informações de pequenos volumes de amostras. Introduzimos um conjunto de protocolos otimizados que facilitam a amostragem ao longo da vida inicial, possibilitando um exame detalhado da dinâmica imunológica ao longo do tempo. Nossa abordagem utiliza técnicas avançadas como citometria de fluxo espectral, proteômica e sequenciamento de RNA de célula única, que juntos oferecem uma visão incomparável das assinaturas proteômicas e transcricionais das células imunes circulantes na infância. Além disso, a citometria de fluxo espectral oferece oportunidades para obter insights funcionais com entrada celular mínima.

Ao longo dos anos, várias técnicas, como hemogramas completos (hemogramas), foram usadas para analisar células imunes derivadas dosangue 15, enquanto outras analisaram razões de células imunes em amostras neonatais de sangue total usando metilaçãode DNA 16,17. Embora essas técnicas tenham sido úteis para aprender as proporções das células imunes conhecidas, ainda existem limitações em nossa capacidade de obter insights aprofundados sobre células sem um sistema multi-ômico. Os hemogramas fornecem apenas medidas amplas dos principais tipos de células sanguíneas, tornando-as úteis para estabelecer o status imunológico geral em um ambiente clínico, mas limitadas em sua capacidade de resolver subtipos ou estados funcionais. Mais recentemente, estudos começaram a abordar essa limitação empregando mudanças transcriptômicas e metabolômicas derivadas do plasma em bebês já na primeira semana devida 18. A proteômica baseada em espectrometria de massa foi adaptada para estudar perfis imunes em amostrasneonatais 19. Essa abordagem é poderosa para medir uma ampla gama de proteínas de forma imparcial e para identificar potenciais biomarcadores. No entanto, limitações importantes incluem a necessidade de uma entrada relativamente grande de proteínas e a falta de informações diretas sobre a identidade celular, apesar de capturar proteínas solúveis e insolúveis. O ensaio de proteômica multiplex direcionada (TMPA) oferece alternativas para amostras de baixa entrada. Esses métodos utilizam detecção direcionada baseada em anticorpos, proporcionando perfil de alta sensibilidade para amostras com material limitado. Um deles, em particular, tem sido usado para acompanhar longitudinalmente trajetórias de desenvolvimento imunológico na infânciainicial 20.

A citometria de fluxo permite a análise quantitativa das proteínas das células imunes no nível de célula única, passando células marcadas fluorescentemente por um feixe de laser focado e medindo a dispersão da luz e os sinais de fluorescência resultantes. Nessa técnica, anticorpos marcados com fluorescência se ligam a proteínas específicas de superfície ou intracelulares. Isso permite a detecção e quantificação simultâneas de múltiplos subtipos de células imunes e suas características definidoras com base em seus perfis de fluorescência. A citometria de fluxo espectral amplia essa abordagem ao capturar todo o espectro de emissão de cada fluorocromo, permitindo a desmistura espectral precisa e a detecção simultânea de mais de 35 marcadores em um únicoensaio 21,22,23. Isso permite a análise de muito mais marcadores do que os painéis convencionais de citometria de fluxo, que são limitados a ~8-12 marcadores. Complementando essas técnicas citométricas, o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) transformou os estudos imunológicos ao permitir um perfil transcriptômico de alta resolução e imparcial a partir de material de entradamínimo 24. Apesar dos custos maiores e da dependência da viabilidade celular, o scRNA-seq oferece insights incomparáveis sobre a heterogeneidade imune na infância em comparação com o sequenciamento em massa. Coletivamente, esses avanços demonstram como inovações em coleta, preservação e análise estão sendo adaptadas para superar os desafios únicos do estudo da imunidade fetal e neonatal.

Esse protocolo foi otimizado para a análise de células imunes periféricas criopreservadas isoladas por lise serial de glóbulos vermelhos. Pesquisadores devem considerar esse protocolo se seus estudos exigirem perfilamento imunológico de alta resolução a partir de pequenos volumes de sangue (100-500 μL), especialmente quando a análise longitudinal é crítica. O método é amplamente aplicável tanto a neonatos a termo quanto a prematuros e é compatível com uma ampla gama de análises posteriores, tornando-o adequado para diversas questões de pesquisa em imunologia neonatal e pediátrica.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O consentimento informado dos pais e o total cumprimento das regulamentações éticas nacionais relevantes foram garantidos de acordo com o Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Yale. Conforme especificado no protocolo aprovado do IRB, os pais foram contatados pela equipe de pesquisa durante a primeira semana após o nascimento do bebê para obter consentimento antes do alastro. Nenhum procedimento de estudo envolvendo materiais derivados do ser humano começou antes da aprovação ética documentada.

1. Coleta, processamento e armazenamento de amostras (Figura 1)

  1. Coleta de sangue em regime de internação
    1. Colete e processe amostras de bebês após recebê-las, armazene a 4 °C e processe dentro de 12 horas após a coleta.
    2. Colete ~250 μL de sangue total e armazene em um tubo de coleta de sangue anticoagulante com EDTA. Inverta o tubo de coleta de sangue 8 vezes para misturar o anticoagulante.
    3. Proceda ao processamento do sangue total por lise do sangue vermelho, conforme descrito na Seção 1.3 (processamento da amostra de sangue total).
    4. Para coletar manchas de sangue seco, use a lanceta estéril para fazer uma perfuração no dedo do pé/calcanhar limpos.
      1. Alternativamente, pipete ~25-30 μL de sangue do tubo EDTA sobre o papel filtrante. Toque levemente o papel filtro na gota de sangue.
    5. Preencha pelo menos um círculo com sangue fluindo livremente, uma gota por círculo. Deixe a mancha de sangue secar. Mantenha o papel de filtro aberto até que as manchas de sangue estejam bem secas.
    6. Rotule adequadamente com o horário da coleta, data de processamento, cronograma e identificação do estécime.
    7. Coloque em um saco plástico transparente com zíper. Armazene cartões de manchas de sangue a −20 °C ou −80 °C para maior estabilidade até estar pronto para análise proteômica.
  2. Coleta ambulatorial de sangue
    NOTA: Com aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Yale, os pais dos participantes ambulatoriais tiveram a opção de coletar amostras de sangue em casa usando um dispositivo de autocoleta por microagulha. Este dispositivo obtém sangue capilar por meio de um lanceta aplicado na pele. Pais que escolheram esse método receberam treinamento em clínica usando kits de demonstração e, posteriormente, receberam instruções escritas detalhadas e kits de coleta para uso doméstico.
    1. Lave as mãos e use luvas antes de usar. Colete todos os itens necessários, incluindo um espelho se apenas um dos pais estiver fazendo a coleta de sangue.
    2. Remova o dispositivo do kit de ferramentas e desfaça a tampa de um tubo compatível.
    3. Pressione o tubo no aparelho até ficar firme com as linhas de preenchimento voltadas para fora.
    4. Remova a fralda do bebê e segure-o em pé.
    5. Siga as instruções da bolsa térmica para ativar.
      NOTA: Se não houver um pacote disponível, use algum outro método de aquecimento, como uma mão.
    6. Segure a bolsa térmica no local (nádega) por 2-4 minutos para aquecer e aumentar o fluxo sanguíneo.
    7. Limpe a área com um absorvente de álcool e deixe secar.
    8. Remova a tampa transparente do botão vermelho. Descolhe a aba do aparelho e prenda firmemente a parte mais completa das nádegas do bebê, mantendo-as eretas.
      NOTA: Ajuste a postura deles conforme necessário para manter o tubo completamente vertical para a coleta adequada de sangue.
    9. Pressione o botão até o fundo uma vez e solte. Configure o timer para 5 minutos. Observe o tubo encher usando o espelho conforme necessário.
    10. O sangue pode não aparecer nos primeiros 1-2 minutos. Remova o dispositivo após um máximo de 5 minutos no total ou antes se o sangue chegar até a linha indicadora superior antes de 5 minutos.
    11. Remova o tubo do dispositivo com uma leve torção e puxe para baixo. Rapidamente encaixe a tampa completamente no tubo. Inverta o tubo pelo menos 10 vezes, garantindo que o sangue toque a tampa a cada inversão para evitar a coagulação.
    12. Envie as amostras durante a noite após a coleta.
  3. Processamento de amostra de sangue total
    1. Processe amostras de sangue em um armário de segurança biológica.
    2. Transfira cuidadosamente os 250 μL de sangue para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos. Enxágue o tubo de coleta de sangue com 10 mL de tampão de lise para glóbulos vermelhos até esvaziar. Deixe as células lisarem em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos.
    3. Quando a lise estiver concluída, adicione ~30 mL de PBS no RT para lavar e centrifugar a 430 × g por 5 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante usando vácuo, sem perturbar o pellet.
    4. Continue transferindo e enxaguando a amostra conforme descrito no passo 1.3.2 até que o pellet celular apareça livre de glóbulos vermelhos visíveis. Centrifuge a 430 × g por 5 minutos, depois remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer no pellet.
    5. Para cada 250 μL de sangue coletado, resuspenda a pelota celular resultante em 2 mL de meio congelante (10% de DMSO em FBS) e divida em dois cryovials para preservação.
    6. Verifique a viabilidade celular contando células ressussestas em meio feezing com um hemocitômetro usando exclusão de azul de tripano.
    7. Transfira 1 mL do passo 1.3.5 para cada criovial. Rotule adequadamente com o horário da coleta, data de processamento, hora e identificação do espécime.
    8. Armazene(s) criovial(es) intermediário(s) a -80 °C em um recipiente congelante com isopropanol. Após 24 horas, transfira o(s) criovial(es) para nitrogênio líquido até estar pronto para análise.

2. TMPA a partir de manchas de sangue seco (DBS) (Figura 2)

  1. No dia do processamento, leve o papel filtro para a RT. Usando um perfurador de metal de 3 mm, perfure 2-3 círculos no papel filtrante por onde o sangue passou, o mais centralizado possível no ponto de sangue.
  2. Pegue cada punção de 3 mm com uma pinça e adicione a um poço de uma placa de 96 poços ou um tubo de PCR de baixa ligação contendo 20 μL de tampão de elução (1x PBS, 1x Inibidor de Protease, 0,05% Tween 20). Certifique-se de que o punção esteja coberto por um buffer de elução.
  3. Feche os tubos ou cubra a placa com uma saia plástica e coloque-os em um Vórtice Digital girando a 600 rpm por 60 minutos no RT.
  4. Ao final da incubação, transfira cuidadosamente o eluado para um novo tubo de baixa ligação ou para uma placa de 96 poços. Descarte os tubos ou a placa com os perfuradores do filtro.
  5. Quantifique o conteúdo proteico usando o ensaio BCA.
    1. Retire 2 μL de cada amostra ou padrão BSA para fazer diluições seriadas de 1:10 e 1:100 em água. Prepare amostras e padrões em duplicado, adicionando 15 μL de amostras diluídas ou padrão a 200 μL de solução de trabalho 1x. Incube amostras por 30 minutos a 37 °C.
    2. Leia o sinal a 562 nm em um leitor de placa. Calcule a concentração final de proteína com base no padrão da inclinação da BSA e no fundo do tampão de elução.
  6. Faça aliquotas de 30 μL para amostras de 0,5-1 mg/mL em microtubos de tampa roscada de 1,5 mL com baixa ligação e ligação. Congele as amostras a -80 °C para posterior submissão a serem processadas usando o serviço TMPA.

3. Citometria de fluxo espectral do sangue lisado por glóbulos vermelhos (Figura 3)

  1. No dia do experimento, descongele rapidamente um frasco de células lisadas por glóbulos vermelhos em um banho-maria a 37 °C até que reste uma pequena gota de gelo.
  2. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPMI completo pré-aquecido (37 °C) (preparado usando 500 mL de RPMI 1640, 50 mL de FBS, 5,6 mL de penicilina-estreptomicina e 5,6 mL de suplemento de glutamina). Centrifuge a 400 × g por 5 minutos em temperatura ambiente. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  3. Suspenda suavemente o pellet em 3 mL de RPMI completo e determine a contagem celular usando um método apropriado.
  4. Gire as células ressuspensas a 400 × g por 5 minutos em temperatura ambiente. Aspire e descarte o sobrenadante.
  5. Ajuste a concentração da célula para 1 × 106 células/mL em RPMI completo. Dispense 100 μL por poço (0,1 × 10⁶ células) em uma placa de fundo em V de 96 poços. Centrifuge a 764 × g por 2 minutos a 4 °C e remova o sobrenadante.
  6. Adicione 100 μL de corante vivo/morto em PBS em diluição 1:2.000 com bloco Fc e bloco de monócitos (diluição 1:100) a todas as amostras, exceto no controle não corado. Incube por 15 minutos a 4 °C.
  7. Lave com 100 μL de PBS e centrifuge a 764 × g por 2 minutos a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: É fundamental usar o bloco Fc e o bloco de monócitos para evitar qualquer ligação não específica dos anticorpos.
  8. Adicione 100 μL do coquetel superficial diluído (diluição 1:200) em tampão FACS (500 mL de PBS, 2,5 g de albumina sérica bovina (BSA), 2 mM de EDTA, pH 8,5) a todas as amostras, exceto no controle não corado. Incube por 30 minutos a 4 °C.
  9. Lave com 100 μL de tampão FACS e centrifuge a 764 × g por 2 minutos a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  10. Fixe as células adicionando 100 μL de paraformaldeído a 4% em cada amostra. Incubar por 15 minutos no RT no escuro.
  11. Lave com 100 μL de tampão FACS, centrifuge a 764 × g por 2 minutos a 4°C e resuspenda em 200 μL de tampão FACS.
  12. Prepare as contas ultra-comp como controles de cor única. Tinga as esferas de controle de cor única usando o mesmo protocolo das amostras, incluindo fixação caso as amostras fossem fixas.
  13. Prepare controles Fluorescentes Menos Um (FMO) usando o mesmo procedimento das amostras.
    NOTA: É importante tratar os controles de cor única e os FMOs da mesma forma que as amostras. Por exemplo, se as amostras forem fixas após a coloração, os FMOs e os controles de cor única também devem ser corrigidos.
  14. Execute as amostras, controles de cor única, controles não corados e controles FMO em um citômetro de fluxo convencional/espectral. Analise os dados usando software.
  15. Defina portas com base nos controles apropriados de isotipo e FMO. Primeiro, as células de porta selecionam a população de leucócitos usando o gráfico de dispersão frontal (FSC) versus dispersão lateral (SSC), que ajuda a excluir detritos e selecionar células com base no tamanho e granularidade.
  16. Após a seleção dos leucócitos, as células de porta para excluir doublets usando um gráfico da área de dispersão frontal (FSC-A) versus altura de dispersão direta (FSC-H).
    NOTA: Isso garante a seleção de células individuais (singletes), com as células que caem na diagonal consideradas singletas, enquanto doublets e aglomerados são excluídos.
  17. Células de gate para viabilidade usando um corante de viabilidade para excluir células mortas, garantindo que a análise subsequente inclua apenas células vivas.
  18. Após essas etapas iniciais de gateing, bloqueie ainda mais as células vivas individuais para marcadores específicos de linhagem para subcategorizar diferentes populações de células imunológicas. Divida as células vivas individuais em células mieloides CD33+ e linfócitos CD33 com base na expressão de CD33.
  19. Dentro da população CD33+ , diferencie monócitos CD14+ e identifique células dendríticas CD11c+ (DCs) como células que expressam CD11c, mas não CD14.
  20. Dentro da população de linfócitos CD33, as células T CD3+ e sub-porta para identificar subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ .
  21. Além disso, identifique células natural killer CD56+ (NK) pela expressão do CD56 e células B CD19+ gate pela expressão do CD19.

4. scRNA-seq de sangue lisado por glóbulos vermelhos (Figura 4)

  1. Descongele um frasco de células lisadas de glóbulos vermelhos criopreservados em um banho-maria a 37 °C. Adicione a amostra a 10 mL de mídia de células T em um tubo cônico de 15 mL. Centrifuge a 430 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
  2. Adicione mais 10 mL de 1x PBS à amostra. Centrifuge a 430 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
  3. Conte as células e avalie a viabilidade com o azul de tripano. Se a viabilidade for inferior a 70%, proceda à remoção de células mortas com o Kit de Remoção de Células Mortas.
    1. Remoção de células mortas
      1. Dilua o Binding Buffer Stock 20x usando água estéril e dupla destilada para obter uma solução funcional 1x.
      2. Suspenda o pellet celular em 100 μL de microesferas de remoção de células mortas por 1 × 107 células totais. Misture bem e incube por 15 minutos em temperatura ambiente (RT).
      3. Insira a coluna de separação magnética no suporte magnético apropriado. Enxágue a coluna com 500 μL de 1x Binding Buffer para equilibrar antes do uso.
      4. Leve o volume da célula para 500 μL com um buffer de ligação 1x. Aplique a suspensão da célula à coluna e colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      5. Lave 2x com 500 μL de buffer de ligação. Colete o fluxo no mesmo tubo da microcentrífuga.
      6. Centrifuge o eluado a 300 × g por 10 minutos. Descarte o supernadante.
    2. Conte as células e avalie sua viabilidade com o azul de tripano.
    3. Resuspenda 20.000 células viáveis em 40 μL de PBS com 0,04% de BSA em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    4. Envie as células imediatamente para congelar para uma instalação de núcleo genômico para geração e sequenciamento de bibliotecas. Colete os resultados de sequenciamento no formato das saídas do Cell Ranger.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coletamos cartões DBS de 10 bebês extremamente prematuros em três momentos: 1 semana (n = 12), 1 mês (n = 7) e 2 meses (n = 3) para análise proteômicade TMPA 6 (Figura 2A). Essas amostras foram analisadas juntamente com sangue do cordão infantil a termo (TCB; n = 4) e sangue adulto saudável (AB; n = 5). A expressão proteica normalizada (NPX) de 92 proteínas relacionadas ao sistema imunocelular foi quantificada usando a plataforma TMPA...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obter dados imunológicos de alta qualidade a partir de volumes mínimos de sangue neonatal e infantil requer adaptações metodológicas ao longo de múltiplas etapas. Neste protocolo, descrevemos quatro estratégias complementares: (i) coleta de sangue otimizada e criopreservação para preservar células viáveis para uso posterior, (ii) aplicação da citometria de fluxo espectral para imunofenotipagem multiparamétrica, (iii) scRNA-seq para resolver heterogeneidade imune em alta resolução, e (iv)...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos às seguintes instalações centrais em Yale: núcleo de Citometria de Fluxo de Yale; Centro de Análise Genomática de Yale. Agradecemos ao Centro de Investigação Clínica de Yale, ao Escritório de Desenvolvimento de Médicos-Cientistas e Cientistas de Yale, e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas de Cuidados Críticos e Trauma Pediátricos/NICHD. Estudos de respirometria foram realizados pelo Chemical Metabolism Core da Universidade de Yale. Este trabalho foi financiado por bolsas para: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Fibrosis Foundation (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Prêmio Hartwell (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Faculdade de Medicina de Yale, Departamento de Pediatria (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. A Figura 1 foi criada no BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x Buffer de Lise de Glóbulos vermelhos  Invitrogen 3177165 
Kit de Ensaio de Proteína BCA & nbsp;Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific & nbsp;22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1° C Controlador de Congelamento Millipore Sigma 41122800 
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Humano CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anti-humano CD11c BD BioCiências  612968 
Brilliant Vil750 Anti-Humano CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Humano CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Humano CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, Coquetel Inibidor de Protease Livre de EDTAMillipore Sigma 11836170001 
Kit de Remoção de Células Mortas Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetil Sulfóxido (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco' s Soro salino tamponado com fosfato (DPBS), sem cálcio, sem magnésio  Thermo Fisher Scientific 14190144 
Soro Fetal Bovino (FBS) Gibco A5256801 
Misturador Digital de Vórtices Fisherbrand & nbsp;Thermo Fisher Scientific 02215418 
Buffer de Fixação BioLegend 420801 
Suplemento GlutaMAXGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
Colunas MS Miltenyi Biotec 130-042-201 
NomeEmpresaNúmero do Catálogo
Separador OctoMACS  Miltenyi Biotec 130-042-109 
Azul do Pacífico Anti-Humano CD4 & nbsp;BioLegend 344619 
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-Humano CD33 BD em Biociências 755606 
Rierdge 3mm Metal Puncher  Rierdge SDD231031pc-01 
RPMI 1640 MédioGibco 11875-093 
Spark UV 387 Anti-Human CD19 BioLegend 302289 
Kits da Coleção TassoTasso N/A
Microtubos de Tampa de Rosca Thermo ScientificThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteínaCytiva & nbsp;41111700 
Kit de Viabilidade Corrigível do Zombie NIR  BioLegend 423105 
Software e pacotes
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prisma9.4.0
NomeVersão
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
ensaios comerciais
Célula Única de Crômio 5' UniformeGenômica 10XPN-1000263
Olink  Painel inflamatório Reveal ou Target 96Olinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Referências

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