Artigo de método

Uma técnica para estabilizar proteínas de membrana em nanodiscos

DOI:

10.3791/70283

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30 de abril de 2026

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1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo descreve o procedimento para reconstituir o canal K+ sensível à ácido-sensitivo relacionado à proteína de membrana TWIK (Task2) em nanodiscos. A montagem bem-sucedida foi confirmada por microscopia crio-eletrônica de partícula única, que forneceu médias de classe bidimensionais bem definidas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muitas proteínas de membrana apresentam baixa estabilidade, perda de atividade e heterogeneidade da amostra quando extraídas em ambientes baseados em detergente, apresentando desafios substanciais para a análise de crioscopia eletrônica de alta resolução. A tecnologia de nanodiscos aborda essas limitações empregando proteínas de andaime de membrana (MSPs) e fosfolipídios para reconstituir as proteínas-alvo em uma bicamada lipídica semelhante à nativa. Neste estudo, o canal de potássio humano Task2 foi expresso, solubilizado e purificado na presença de detergentes apropriados antes da montagem do nanodisco. O protocolo resultante estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para a reconstituição de nanodiscos da Task2, como demonstrado por etapas chave de validação: uma clara mudança nos perfis de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) confirmando o aumento das partículas, co-migração da Task2 e MSP no SDS-PAGE, e médias bem definidas de classes 2D com características estruturais secundárias visíveis. Uma reconstrução inicial em 3D confirma ainda mais a integridade da proteína embutida no nanodisco. Ao melhorar a pureza, homogeneidade e qualidade das partículas, essa abordagem fornece uma plataforma robusta para estudos estruturais de alta resolução do Task2 e oferece uma estrutura metodológica aplicável a outras proteínas de membrana.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As proteínas de membrana desempenham um papel crucial na transdução de sinais celulares, transporte de metabólitos, manutenção da integridade estrutural celular e respostas imunológicas. A desregulação das proteínas de membrana está implicada em várias doenças, tornando-as alvos proeminentes para o desenvolvimento de medicamentos1. O advento da criomicroscopia eletrônica (crio-EM) possibilitou estudos estruturais de proteínas de membrana grandes edinâmicas 2. Um dos principais desafios para obter estruturas de alta resolução está em extrair essas proteínas de suas bicamadas lipídicas nativas, preservando suas conformações nativas e funções bioquímicas. Além disso, a conformação altamente dinâmica das proteínas de membrana e a complexidade da triagem de anticorpos representam obstáculos adicionais à descoberta de fármacosdirecionados 3,4. Métodos tradicionais para extração de proteínas de membrana frequentemente utilizam detergentes para imitar as propriedades da bicamada lipídica hidrofóbica. No entanto, essa abordagem frequentemente prejudica a estabilidade das proteínas de membrana, levando à agregação ou desdobramentoparcial 5. Além disso, detergentes podem remover moléculas lipídicas essenciais que são críticas para estabilizar a conformação proteica, podendo alterar a conformação proteica ou até mesmo prejudicar a função, limitando assim sua aplicação em triagem de anticorpos e outras aplicaçõesposteriores.

A tecnologia de nanodiscos foi introduzida pela primeira vez por Sligar ecolegas 7. Essa estrutura auto-assemblante é tipicamente formada por derivados da apolipoproteína A1 (ApoA1), nomeadamente MSPs, juntamente com lipídios sintéticos ou naturais, proporcionando um ambiente estável para proteínas de membrana 7,8,9. O MSP forma uma estrutura em formato de disco ao envolver as bordas hidrofóbicas da bicamada lipídica. Essa estrutura possui uma superfície hidrofóbica que interage com as caudas dos lipídios acila, estabilizando a proteína de membrana, e uma superfície hidrofila voltada para fora, permitindo que a proteína de membrana permaneça solúvel em soluçõesaquosas 10. Nanodiscos servem como uma plataforma versátil para estudos de proteínas de membrana. Ao preservar proteínas de membrana purificadas em um ambiente lipídico próximo ao nativo, elas superam as limitações dos métodos tradicionais baseados em detergente e mantêm a conformação e a função biológica das proteínas in vitro. Consequentemente, esse método tornou-se uma ferramenta poderosa para estudos estruturais de proteínas de membrana. Comparado aos ambientes tradicionais de detergente, a bicamada lipídica nos nanodiscos fornece suporte estrutural para proteínas de membrana, estabilizando sua conformação nativa — uma característica crucial para proteínas propensas à inativação, como receptores acoplados à proteína G e canaisiônicos 11. Além disso, a natureza altamente uniforme das partículas de nanodisco após a montagem oferece um suporte mais forte para obtenção de dados crio-EM de alta qualidade e dados cinéticos confiáveis de ressonância de plasmon/interferometria de biocamadana superfície 12.

Na última década, a tecnologia de nanodiscos tornou-se uma ferramenta poderosa para estudar proteínas de membrana em ambientes lipídicos naturais. Por exemplo, Vilela e colegas13 estabeleceram uma estrutura sistemática para a montagem de nanodiscos, otimizando as condições de reconstituição e verificando a qualidade dos componentes finais. Especificamente, eles combinaram cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com indicadores quantitativos (incluindo eficiência de montagem e simetria de pico) para avaliar objetivamente a homogeneidade dasamostras 13. Atualmente, os nanodiscos se tornaram uma plataforma versátil. Ao usar crio-EM de partícula única para detectar as proteínas reconstituídas em nanodiscos montadas, é possível obter estruturas de alta resolução de proteínas de membrana, e sua aplicabilidade foi firmemente estabelecida. A característica de densidade de anel duplo da banda MSP é a evidência estrutural decisiva para a ligaçãobem-sucedida 10,14,15. Além disso, os nanodiscos servem como uma ferramenta valiosa tanto para a análise funcional de proteínas de membrana em ambientes de bicamada lipídica quanto para sua aplicação em estudos de ressonância magnética nuclearem solução 16,17.

Este protocolo descreve um método para montar a proteína de membrana humana Task2 em nanodiscos. A Human Task2 é um membro dependente de pH da família de canais K+ (K2P) de domínio de dois poros18,19. Como outros canais K2P, Task2 é um homodímero trocado de domínio, com cada cadeia de protómero contendo quatro hélices transmembranas (TM1–TM4), dois helices de poros reentrantes (PH1 e PH2), dois filtros de seletividade (SF1 e SF2) e dois hélices extracelulares formadores de capas (CH1 e CH2). A proteína-alvo era uma forma truncada da Task2, sem os aminoácidos C-terminais 166 — uma região prevista como em grande parte não estruturada — que foi descoberto melhorar a expressão proteica e a estabilidade bioquímica. O peso molecular da Task2 recombinada é aproximadamente 72 kDa com uma etiqueta GFP. Ele havia sido solubilizado e purificado com detergente antes. Foi combinado com lipídios e MSP em uma razão estequiométrica precisamente calculada. Após a remoção do detergente usando Bio-Beads, a amostra foi ainda mais purificada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para obter uma preparação adequada para crio-EM. Médias de classe bidimensionais (2D) foram então geradas a partir de dados crio-EM de partícula única para validar a integridade da amostra.

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Protocolo

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1. Preparação do caldo lipídico

  1. Preparação de Lípidos
    1. Prepare misturas lipídicas usando três fosfolipídios: 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 2-oleoil-1-palmitoilglicero-3-fosfocolina (POPC) e 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilserina (POPS).
    2. Use soluções pré-preparadas desses lipídios em clorofórmio, cada uma com concentração de 25 mg/mL.
      NOTA: Equipamentos de proteção individual são necessários ao manusear clorofórmio, e todos os procedimentos devem ser realizados em uma exaustão de fumo. Armazene o clorofórmio em um armário químico dedicado.
    3. Devido à volatilidade do clorofórmio, ao medir com uma microseringa, verifique se o volume da solução de lipídios corresponde ao volume inicialmente registrado antes de cada uso. Se ocorrer evaporação, reabasteça a solução com clorofórmio puro até o volume original e misture bem.
      NOTA: Antes de cada medição, enxágue a microseringa duas vezes com clorofórmio.
    4. Prepare uma mistura lipídica de 100 μL com uma razão de massa de DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. Com base nessa proporção, combine 50 μL deV DOPE, 25 μL de VPOPC e 25 μL deV POPS. Meça o volume correspondente de acordo com o número calculado. Adicione ao tubo de ensaio de vidro e misture bem.
    5. Coloque o tubo de ensaio de vidro em um banho-maria para reduzir a volatilização do clorofórmio e manter a temperatura ambiente estável.
  2. Preparação de filmes lipídicos
    1. Evapore o clorofórmio sob um fluxo suave de gás nitrogênio até que todo o líquido seja removido e forme-se um filme transparente homogêneo semelhante a gel na base do tubo de ensaio.
      NOTA: Certifique-se de que um filme lipídico uniforme e seco seja visível no fundo do tubo de vidro, sem gotículas residuais de líquido. Evite fluxo excessivo de nitrogênio, pois pode causar bolhas e impedir a secagem completa do clorofórmio.)
    2. Adicione aproximadamente 2 mL de n-pentano em um tubo de ensaio de vidro. Em seguida, evapore o solvente usando o método de secagem com nitrogênio descrito na 1.2.1 para obter um filme lipídico seco e transparente. O n-Pentano é evaporado em um tubo de ensaio de vidro devido à sua inércia química e compatibilidade com solventes orgânicos. O vidro evita o risco de lixiviação ou degradação do plástico associado a muitos materiais plásticos de laboratório, preservando assim a pureza lipidária durante a formação do filme.
      NOTA: o n-Pentano deve ser armazenado em um gabinete dedicado para reagentes e, quando utilizado, manuseado com cuidado em uma exaustão de fumaça enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado.
    3. Afrouxe a tampa do tubo de ensaio e coloque-o em um dessecador a vácuo. Evacue o dessecador e mantenha sob vácuo para remover quaisquer solventes residuais. Coloque gel de sílica autoindicativo na base do dessecador para absorver a umidade.
      NOTA: Evapore o clorofórmio residual e o n-pentano até a secura em uma exaustão de fumo.
  3. Hidratação lipídica e preparação da solução de caldo
    1. Remova o filme lipídico do dessecador a vácuo e hidrate-o adicionando 250 μL de tampão com baixo teor de sal (LSB) sem detergente (Tabela Suplementar 1). Isso resulta em uma concentração final de lipídios de 10 mg/mL.
      NOTA: Um tampão à base de íons potássio foi selecionado porque o Task2 é um canal de íons potássio
    2. Após ressuspender os lipídios, divida-se uniformemente em quatro tubos de vidro e sonice as suspensões até que fiquem claras e transparentes, indicando formação bem-sucedida de lipossomos (aproximadamente 1,5 h). Realize a sonicação a 60% de amplitude usando um ciclo de 4 s ligado e 6 segundos desligado.
    3. Agrupe a solução lipídica clarificada e a alíquota de 1,5 mL em tubos individuais de microcentrífuga. Lave imediatamente o espaço de carga de cada tubo com gás nitrogênio e armazene a -80 °C até o uso.

2. Superexpressão e purificação do MSP

  1. Expressão procariótica do MSP
    1. Transformação do plasmídeo: Use o plasmídeo MSP1D1 que carrega uma etiqueta 7×His para transformar as células competentes em E. coli BL21 (DE3). Placar a mistura de transformação em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo kanamicina (50 μg/mL) e incubar durante a noite a 37 °C para obter colônias individuais.
    2. Amplificação da cultura: Escolha um único clone e inocule-o em 5 mL de meio contendo canamicina e incube durante a noite a 37 °C com agitação. Inocule a cultura durante a noite em meio LB líquido na proporção 1:100, depois cresça a 37 °C com agitação até que a densidade óptica em 600 nm (OD600) atinja 2,0–3,0.
    3. Indução de expressão proteica: Induza a expressão de MSP adicionando isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a uma concentração final de 0,5–1 mM. Continue cultivando as células a 16 °C por 16–20 horas com agitação.
  2. Perturbação celular
    1. Coleta de pellets: Centrifuge a cultura bacteriana a 4 °C por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e retenha a bola celular.
    2. Lisis bacteriana: Resuspenda o pellet derivado de 1 L de cultura em 100–150 mL de tampão de lise (Tabela Suplementar 1). Homogeneize completamente até alcançar uma suspensão uniforme, sem aglomerados visíveis. Adicione PMSF à suspensão para inibir proteases e reduzir a espuma.
    3. Sonicação: Use um disruptor de células ultrassônicas refrigeradas para quebrar as bactérias. Ajuste a potência para 35% e aplique ciclos de pulsos de 3 s seguidos de pausas de 6 s. Para evitar superaquecimento, permita um intervalo de descanso de 2 minutos a cada 15 minutos de tempo acumulado de sonicação. Continue até que o lisado fique claro e marrom claro.
    4. Esclarecimento: Centrifuge o lisado a 30.000 g por 45 minutos a 4 °C e colete o sobrenadante para as etapas seguintes.
  3. Purificação de MSP
    1. Preparação da Resina Ni-NTA: Pegue 3–5 mL de resina Ni-NTA e compacte-a em uma coluna de gravidade (tamanho: 26,4×134,8 mm). Lave a resina com 3 volumes de coluna (CV) de água destilada e equilibre-a com 3 CV de Wash Buffer 1 (Tabela Suplementar 1).
    2. Ligação do MSP à Resina: Após a centrifugação do lisado celular, misture o sobrenadante com a resina Ni-NTA equilibrada. Adicione imidazol a uma concentração final de 5 mM e incube a mistura a 4 °C por 2 horas com uma rotação suave no escuro.
    3. Lavar para remover impurezas: Lavar sequencialmente com gradientes do Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Tabela Suplementar 1) e Wash Buffer 3 (Tabela Suplementar 1), usando pelo menos 50 mL de cada buffer. Monitore a absorção UV a 280 nm (A280) do fluxo e continue lavando até que o valor de A280 caia abaixo de 0,01.
    4. Elução: Elute a proteína alvo com o Elution Buffer (Tabela Suplementar 1) e colete as frações de eluato. Continue o processo de elução, coletando frações até que o A₂₈₀ do eluato caia abaixo de 0,01.
    5. Monitoramento e Análise de Processos: Colete amostras dos estágios chave de purificação — incluindo o sobrenadante, precipitado, fluxo, frações de lavagem e frações de elução. Analise-as por SDS-PAGE para avaliar a eficiência da purificação (Figura Suplementar 1).
    6. Diálise para Troca de Tampon: Transfira o eluato acumulado para o tubo de diálise e dialise-o contra o Tampão de Diálise (Tabela Suplementar 1) a 4 °C com uma leve agitação durante a noite.
    7. Ultrafiltração e concentração: Concentre a solução dialisada usando um dispositivo de ultrafiltração até uma concentração final de MSP de 2–5 mg/mL. O MSP purificado e concentrado agora está pronto para uso na montagem de nanodiscos de proteínas de membrana.

3. Ativação de Bio-Esferas

  1. Pesagem
    1. Pese aproximadamente 250 mg de Bio-Esferas em um tubo centrífugo de 50 mL usando uma balança analítica.
  2. Lavagens com metanol
    1. Adicione 25–30 mL de metanol ao tubo. Gire ou faça um vórtice completo na mistura no escuro, depois incube por 20 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante após a incubação.
    2. Repita essa etapa de lavagem com metanol três vezes no total.
      NOTA: Devido à volatilidade do metanol, esse procedimento deve ser realizado em uma exaustão com equipamentos de proteção individual apropriados. Colete metanol usado e trate-o como líquido de resíduos biológicos.
  3. Lavagens aquáticas
    1. Adicione 25–30 mL ddH2O às contas. Sacode ou gire o tubo para misturar e incubar por 20 minutos.
    2. Descarte o supernadante. Repita essa etapa de lavagem aquosa três vezes.
  4. Equilíbrio com LSB
    1. Adicione 25–30 mL de LSB sem detergente às esferas. Sacode ou gire o tubo em uma mesa giratória para misturar e incubar por 20 minutos.
    2. Descarte o supernadante. Repita essa etapa de equilíbrio do LSB três vezes para condicionar completamente as contas.
  5. Aliquotação e armazenamento
    1. Divida igualmente as Bio-Esferas ativadas em três tubos microcentrífugas de 1,5 mL. Certifique-se de que as contas permaneçam umedecidas com uma pequena quantidade de LSB.
    2. Envolva os tubos em papel alumínio para proteger da luz e armazene-os no gelo para uso imediato.

4. Montar o nanodisco

  1. Preparação de lipídios e MSP
    1. Esclarecimento sobre o Estoque Lipídico: Pegue uma alíquota do caldo lipídico pré-preparado e descongele-o. Centrifuge imediatamente o tubo a 7.000 x g por 5 s a 4 °C para coletar o conteúdo no fundo.
    2. Ultrassone em banho-maria e monitore a clareza e temperatura a cada 5–10 minutos para evitar superaquecimento. Realize a sonicação a 60% de amplitude. Ultrassone o material lipídico até que ele fique claro e transparente.
    3. Descongelação do MSP: Descongelar 1 aliquota da solução preparada de MSP em banho de água gelada.
  2. Prepare o tampão de acordo com a razão estequiométrica.
    1. Quantificar a Proteína de Membrana: Isolar a proteína de membrana purificada (Task2), solubilizada em 0,025% DDM/0,005% CHS, por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Injete um volume de amostra de 500 μL a uma vazão de 0,5 mL/min em uma coluna Superose 6 Increase (Cytiva). Colete o pico de elução a 14,8 mL e concentre-o (Figura 1). Determine a concentração de proteína usando um NanoDrop.
    2. Calcule a Quantidade Molar da Proteína: Calcule a quantidade molar (n) da proteína membrana alvo usando a fórmula: n = C × V, onde C é a concentração molar e V é o volume.
    3. Determine o MSP e os volumes lipídicos: Calcule os volumes necessários de soluções de MSP e estoque lipídico com base na razão estequiométrica molar da proteína alvo: MSP : lipídio = 1 : 5 : 250.
    4. Prepare a mistura mestre: Com base nos resultados do cálculo, combine os volumes correspondentes de lipídios e MSP para preparar uma mistura master de 300 μL.
      NOTA: Certifique-se de incluir detergente nesta mistura para manter uma concentração consistente com a da solução proteica, evitando assim agregação prematura.
  3. Remoção de detergente e montagem de nanodiscos
    1. Incubação inicial com mistura de reconstituição: Incube o buffer preparado (Tabela Suplementar 1) no gelo por 10 minutos. Depois, adicione lentamente 50 μL da mistura à solução proteica concentrada, misturando suavemente por pipeteamento para garantir homogeneidade.
    2. Equilíbrio da Mistura Proteína-Lipídico: Coloque a mistura combinada no gelo por 1 hora. Inverta suavemente o tubo a cada 15 minutos para misturar bem.
    3. Primeira incubação com Bio-Esferas: Centrifuge brevemente a mistura a 7.000 x g por 5 s a 4 °C para coletar a solução proteica no fundo do tubo. Retire uma aliquota das Bio-Esferas pré-ativadas, aspire o LSB residual, adicione a solução proteica às esferas e incube com rotação no escuro por 1 hora para evitar a degradação da proteína alvo induzida pela luz.
    4. Segunda incubação com Bio-Esferas: Centrifuge a mistura a 7.000 x g por 5 s a 4 °C e transfira cuidadosamente o sobrenadante para uma segunda aliquota de Bio-Esferas (da qual o LSB também foi aspirado) e misture bem por inversão suave no escuro por 4–8 horas ou durante a noite.
    5. Incubação Final com Bio-Contas: Recupere a solução proteica após a incubação durante a noite, centrifuge-a brevemente e transfira o sobrenadante para a terceira e última porção das Bio-Esferas pré-ativadas. Incube com rotação a 4 °C no escuro por 1 hora.
    6. Após uma breve centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e centrifuge a 17.000 x g a 4 °C por 10 minutos para remover quaisquer agregados.
      NOTA: Descarte as Bio-Contas usadas como resíduos biológicos.
    7. Purificação de Nanodiscos: Purificar os complexos nanodisco-Task2 por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC): Injetar um volume amostral de 500 μL a uma vazão de 0,5 mL/min em uma coluna de aumento Superose 6 e coletar o pico eluído a 15 mL (Figura 2).
    8. Concentração do Produto Final: Agrupe as frações de pico da elução SEC e concentre-as até uma concentração final de nanodisco-Task2 de 1,2–1,5 mg/mL, adequada para preparação de amostras crio-EM.

5. Verificar se a montagem do nanodisco foi bem-sucedida

  1. Análise SDS-PAGE: Amostras de alíquotas das frações purificadas pela SEC.
    1. Analise as amostras usando SDS-PAGE de 12% para confirmar a presença de componentes-chave (por exemplo, MSP e proteína membrana alvo), o que indica a montagem bem-sucedida do nanodisco (Figura 3).
  2. Preparação e Análise de Amostras Crio-EM.
    1. Concentre a amostra montada com sucesso em uma concentração final de 1,2–1,5 mg/mL para preparação crio-EM.
    2. Comece centrifugando a amostra a 17.000 x g e 4 °C por 10 minutos. Deposite uma gota de 3 μL em grades de ouro recém-descarregadas por glow Quantifoil R1.2/1.3 (malha 300, carbono com buracos).
    3. Incube a 4 °C com 100% de umidade por 5 segundos. Enrole a grade por 4 s em um Vitrobot Mark IV e faça mergulho-congelamento em etano líquido mantido em temperatura de nitrogênio líquido.
    4. Colete pilhas de filmes de super-resolução usando software EPU em um Titan Krios G4 crio-EM operando a 300 kV e equipado com um detector direto de elétrons Falcon G4i.
    5. Defina o tempo de exposição para 2,78 s, correspondendo a um tamanho de pixel de 0,73 Å (165k ×) e uma dose total acumulada de aproximadamente 50 e⁻/Å 2 por pilha de filmes ER.

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Resultados

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A preparação bem-sucedida do material lipídico foi indicada pela formação de uma solução clara e transparente após a sonicação. Para o MSP, a cromatografia de afinidade por níquel resultou em um produto de alta pureza a aproximadamente 3 mg/mL. A montagem dos nanodiscos foi confirmada pela SEC, que mostrou um perfil característico de elução (Figura 2). Comparado ao perfil SEC Task2 obtido antes da montagem do nanodisco (Figura 1), o pico da proteína se deslo...

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Discussão

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O método é apresentado para reconstituir proteínas de membrana solubilizadas em detergente em nanodiscos por meio da remoção de detergente, proporcionando assim um ambiente de bicamada lipídica mais nativo. O sucesso desse processo de montagem depende de vários fatores-chave. A principal entre elas é a razão estequiométrica precisa entre a proteína de membrana, MSP e lipídios. Razões estequiométricas inadequadas podem levar à agregação de proteínas ou à montagem malsucedida. Por exemplo,...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem à equipe do Centro de Crio-EM da Universidade de Henan, assim como ao Professor Wei Wang, pelo apoio especializado. O financiamento foi fornecido pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 32371261 para B.L. e 32301011 para R.Z.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bio-contasBio-rad1523920
Hemisuccinato de colesterolAnatraceCH210
ClorofórmioSinoragenteUso em exaustor
Muito LEGALAvanti850725P
MetanolSinoragente
n-Dodecyl-beta-D-maltosideAnatraceD310
N-pentanoAdamasUso em exaustor
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radSiga o protocolo do fabricante para uso adequado
Tubos de Diálise SnakeSkinTermodinâmica68011
Superose  6 Aumento10/300 GLCytiva29091596
Colunas de Ultrafiltração Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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