Este estudo descreve o procedimento para reconstituir o canal K+ sensível à ácido-sensitivo relacionado à proteína de membrana TWIK (Task2) em nanodiscos. A montagem bem-sucedida foi confirmada por microscopia crio-eletrônica de partícula única, que forneceu médias de classe bidimensionais bem definidas.
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Artigo de método
Uma técnica para estabilizar proteínas de membrana em nanodiscos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas proteínas de membrana apresentam baixa estabilidade, perda de atividade e heterogeneidade da amostra quando extraídas em ambientes baseados em detergente, apresentando desafios substanciais para a análise de crioscopia eletrônica de alta resolução. A tecnologia de nanodiscos aborda essas limitações empregando proteínas de andaime de membrana (MSPs) e fosfolipídios para reconstituir as proteínas-alvo em uma bicamada lipídica semelhante à nativa. Neste estudo, o canal de potássio humano Task2 foi expresso, solubilizado e purificado na presença de detergentes apropriados antes da montagem do nanodisco. O protocolo resultante estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para a reconstituição de nanodiscos da Task2, como demonstrado por etapas chave de validação: uma clara mudança nos perfis de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) confirmando o aumento das partículas, co-migração da Task2 e MSP no SDS-PAGE, e médias bem definidas de classes 2D com características estruturais secundárias visíveis. Uma reconstrução inicial em 3D confirma ainda mais a integridade da proteína embutida no nanodisco. Ao melhorar a pureza, homogeneidade e qualidade das partículas, essa abordagem fornece uma plataforma robusta para estudos estruturais de alta resolução do Task2 e oferece uma estrutura metodológica aplicável a outras proteínas de membrana.
Introdução
As proteínas de membrana desempenham um papel crucial na transdução de sinais celulares, transporte de metabólitos, manutenção da integridade estrutural celular e respostas imunológicas. A desregulação das proteínas de membrana está implicada em várias doenças, tornando-as alvos proeminentes para o desenvolvimento de medicamentos1. O advento da criomicroscopia eletrônica (crio-EM) possibilitou estudos estruturais de proteínas de membrana grandes edinâmicas 2. Um dos principais desafios para obter estruturas de alta resolução está em extrair essas proteínas de suas bicamadas lipídicas nat....
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Protocolo
1. Preparação do caldo lipídico
- Preparação de Lípidos
- Prepare misturas lipídicas usando três fosfolipídios: 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 2-oleoil-1-palmitoilglicero-3-fosfocolina (POPC) e 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilserina (POPS).
- Use soluções pré-preparadas desses lipídios em clorofórmio, cada uma com concentração de 25 mg/mL.
NOTA: Equipamentos de proteção individual são necessários ao manusear clorofórmio, e todos os procedimentos devem ser realizados em uma exaustão de fumo. Armazene o clorofórmio em um armário químico dedicado. - Devido à volati....
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Resultados
A preparação bem-sucedida do material lipídico foi indicada pela formação de uma solução clara e transparente após a sonicação. Para o MSP, a cromatografia de afinidade por níquel resultou em um produto de alta pureza a aproximadamente 3 mg/mL. A montagem dos nanodiscos foi confirmada pela SEC, que mostrou um perfil característico de elução (Figura 2). Comparado ao perfil SEC Task2 obtido antes da montagem do nanodisco (Figura 1), o pico da proteína se deslo.......
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Discussão
O método é apresentado para reconstituir proteínas de membrana solubilizadas em detergente em nanodiscos por meio da remoção de detergente, proporcionando assim um ambiente de bicamada lipídica mais nativo. O sucesso desse processo de montagem depende de vários fatores-chave. A principal entre elas é a razão estequiométrica precisa entre a proteína de membrana, MSP e lipídios. Razões estequiométricas inadequadas podem levar à agregação de proteínas ou à montagem malsucedida. Por exemplo,.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à equipe do Centro de Crio-EM da Universidade de Henan, assim como ao Professor Wei Wang, pelo apoio especializado. O financiamento foi fornecido pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 32371261 para B.L. e 32301011 para R.Z.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bio-contas | Bio-rad | 1523920 | |
| Hemisuccinato de colesterol | Anatrace | CH210 | |
| Clorofórmio | Sinoragente | Uso em exaustor | |
| Muito LEGAL | Avanti | 850725P | |
| Metanol | Sinoragente | ||
| n-Dodecyl-beta-D-maltoside | Anatrace | D310 | |
| N-pentano | Adamas | Uso em exaustor | |
| POPC | Avanti | 850457P | |
| POPS | Avanti | 840034P | |
| SEC | Bio-rad | Siga o protocolo do fabricante para uso adequado | |
| Tubos de Diálise SnakeSkin | Termodinâmica | 68011 | |
| Superose 6 Aumento10/300 GL | Cytiva | 29091596 | |
| Colunas de Ultrafiltração Amicon Ultra-15 | Millipore | UFC905008 |
Referências
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Dodd....
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Reimpressões e permissões
