Este protocolo de estudo foi projetado para investigar sistematicamente os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii na osteoartrite, por meio de análises multi-ômicas integradas e experimentos in vivo .
Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este protocolo de estudo foi projetado para investigar sistematicamente os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii na osteoartrite, por meio de análises multi-ômicas integradas e experimentos in vivo .
A osteoartrite (OA) é um distúrbio degenerativo progressivo das articulações para o qual as intervenções farmacológicas e cirúrgicas atuais geralmente aliviam os sintomas, em vez de reverter as mudanças patológicas subjacentes, destacando a necessidade urgente de novos agentes terapêuticos. Esse protocolo teve como objetivo investigar os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii contra a OA. Primeiro, o perfil metabolômico não direcionado foi realizado usando cromatografia líquida de ultra-alto desempenho combinada com espectrometria de massa tandem de alta resolução (UHPLC-HRMS/MS) para caracterizar os constituintes químicos do extrato. Uma estratégia integrada que combina farmacologia em rede e mineração transcriptômica foi então aplicada para identificar componentes bioativos e alvos potenciais do extrato, seguida por análise cruzada com genes desregulados relacionados à OA para obter os genes alvo centrais. Foram realizadas análises de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) para anotar os principais processos biológicos e vias de sinalização modulados pelo extrato. Para validação in vivo , modelos de lesão da cartilagem do peixe-zebra e modelos de OA em camundongos foram usados para avaliar os efeitos condroprotetores do extrato. O sequenciamento de RNA (RNA-seq) foi adotado para analisar alterações transcriptômicas em condrócitos após o tratamento, focando em vias associadas à OA e perfis de expressão gênica; Posteriormente, foi realizado um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) para verificar os níveis de expressão das principais proteínas/receptores triados pelo RNA-seq, a fim de confirmar ainda mais os efeitos regulatórios do extrato de Fructus Xanthii nos alvos principais da OA. Esse protocolo multi-ômico integrado e experimental oferece uma abordagem sistemática para explorar o potencial do extrato de Fructus Xanthii como um candidato botânico promissor para intervenção na Artosmodina.
A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa das articulações caracterizada pela degradação progressiva da cartilagem articular, esclerose óssea subcondral, inflamação sinovial e formação deosteófitos 1. De acordo com o estudo Global Burden of Disease (GBD), a prevalência da OA aumentou de forma constante em 204 países e territórios de 1990 a 20202, com essa tendência esperada para acelerar junto com o envelhecimento demográficoglobal 3. Estimativas atuais indicam que mais de 250 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas, colocando uma pressão significativa sobre o bem-estar individual, os sistemas de saúde e as estruturassocioeconômicas 4. Os tratamentos atuais são predominantemente voltados para alívio sintomático, sendo os anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e a viscossuplementação intraarticular com ácido hialurônico (HA) as intervenções mais comuns. No entanto, essas abordagens oferecem benefício clínico limitado e estão associadas a efeitos adversosconsideráveis 5,6. Isso destaca a necessidade crítica de medicamentos eficazes para modificação da doença contra a osteoartrite (DMOADs).
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido usada há muito tempo no manejo da artrite ofrótica, fundamentada no conceito de "bi ósseo", um subtipo da "síndrome bi". Nesse contexto, a patogênese da OA é atribuída principalmente a uma deficiência de essência hepática e renal, insuficiência de qi e sangue, e subsequente invasão por vento, frio eumidade 8. Assim, as estratégias terapêuticas focam em dissipar a umidade causada pelo vento, dispersar o frio e desbloquear os laterais9. Os tratamentos com MTC são conhecidos por seus efeitos multi-alvo, perfis favoráveis de efeitos colaterais e eficácia clinicamentesignificativa 10. Formulações notáveis como Buqi Tongluo Capsule (BQTL) e Fuzi Decoction (FZD) demonstraram efeitos anti-OA claros na prática clínica, enquanto o Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) alivia os sintomas da OA ao suprimir a via inflammasoma NLRP3, apoiada por séculos de uso empírico. Da mesma forma, a Mistura de Shenjinhuoxue (SHM) atenua a dor e a degeneração da cartilagem por meio da regulação para baixo de mediadores pró-inflamatórios como IL-1β e TNF-α 11,12,13. No nível de monômeros, compostos como icariina (Cianosídeo A, CyA) e erianina, derivados de plantas medicinais, foram relatados como promovendo a proliferação de condrócitos, inibem a liberação de citocinas inflamatórias e mantêm a homeostasearticular 14,15. Coletivamente, a MTC oferece uma abordagem terapêutica abrangente com propriedades anti-inflamatórias, condroprotetoras e aliviadoras de sintomas. No entanto, a complexidade de seus mecanismos e as questões relacionadas à padronização exigem pesquisas contínuas e rigorosas.
Os frutos maduros e secos de Fructus Xanthii (Compositae), comumente conhecidos como "Cang-Er-Zi", foram documentados como apresentando uma ampla gama de atividades farmacológicas, incluindo efeitos antimicrobianos, anti-inflamatórios, antioxidantes, analgésicos, antineoplásicos eimunomoduladores 16. Os ácidos fenólicos isolados de Fructus Xanthii reduzem efetivamente a hiperplasia sinovial na artrite reumatoide (AR)17. Entre eles, o ácido clorogênico (CGA), um derivado representativo do ácido cafeoilquínico, foi encontrado estimular a proliferação e diferenciação de osteoblastos enquanto inibe a osteoclastogênese mediada por RANKL, mantendo assim a homeostaseesquelética 18. Outros ácidos fenólicos identificados no mesmo extrato, como ácido neoclorogênico (5-CQA), ácido criptoclorogênico (CCA) e ácido protocatehicii, também apresentam propriedades antimicrobianas, anti-inflamatórias, antitumorais eantioxidantes 19,20,21. Além dos ácidos fenólicos, uma variedade de metabólitos secundários presentes em Cang-Er-Zi contribui para essas bioatividades 16,20,22,23,24,25. No entanto, o papel preciso e os mecanismos subjacentes do extrato de Fructus Xanthii na OA permanecem amplamente inexplorados.
Cromatografia Líquida Não Direcionada-Espectrometria de Massa Tandem (LC-MS/MS) Metabolômica é caracterizada por capacidades sem hipóteses, alta capacidade de produção e cobertura global. Ele permite a detecção simultânea de milhares de características metabólitas, proporcionando uma visão panorâmica das redes metabólicas, e possibilita a descoberta sistemática de novos biomarcadores e vias metabólicas aberrantes sem pré-especificação prévia doalvo 26,27. Combinada com tecnologia de espectrometria de massa de alta resolução, essa abordagem é adequada para a análise abrangente de vários tipos de amostras biológicas (por exemplo, soro, fluido sinovial, urina, tecido cartilaginoso, etc.) e demonstrou vantagens significativas na pesquisa sobre osteoartrite (OA). Por um lado, pode rastrear de forma abrangente metabólitos diferenciais intimamente associados à progressão patológica da OA (como várias classes de metabólitos identificados no fluido sinovial e no tecido sinovial) e mapeá-los para vias-chave, incluindo metabolismo energético, reparo de cartilagem, osteogênese e metabolismo lipídico, aprofundando assim o entendimento da patogênese da OA. Por outro lado, integrar dados multi-ômicos, como transcriptômica e proteômica, ajuda a revelar o papel da reprogramação metabólica na degeneração da cartilagem, respostas inflamatórias e danos à estrutura articular, fornecendo evidências críticas para identificar biomarcadores diagnósticos precoces, avaliar a progressão da doença e desenvolver estratégias metabólicas direcionadas (por exemplo, regulação do ácido biliar, triptofano ou metabolismo dos ácidos graxos), destacando seu potencial translacional em pesquisa sobre digitação de precisão do OA e tratamento personalizado.
O peixe-zebra serve como um excelente organismo-modelo devido a múltiplas vantagens: seu genoma é altamente conservado em relação ao dos humanos, compartilhando homologia com aproximadamente 70% dos genes codificadores de proteínashumanos 28,29. Apresenta características-chave como desenvolvimento rápido, fertilização in vitro, embriões transparentes que permitem imagens in vivo convenientes, alta fecundidade e baixos custosde manutenção 30, 31, 32, 33. Na pesquisa esquelética, o peixe-zebra permite visualização clara da formação óssea, dos processos de mineralização e da capacidade de regeneração, podendo ser utilizado para simular condições patológicas como osteoporose e danos à cartilagem. No entanto, no estudo da osteoartrite (OA), uma doença complexa que abrange toda a articulação caracterizada por degeneração da cartilagem articular, inflamação sinovial e alterações ósseas subcondrais, a aplicação do modelo do peixe-zebra permanece relativamente limitada.
Este artigo apresenta um protocolo que integra metabolômica não direcionada baseada em UHPLC-HRMS/MS, farmacologia em rede, mineração transcriptômica e validação experimental in vivo para explorar o potencial do extrato de Xanthium sibiricum como candidato viável a planta para intervenção na OA. O objetivo não é apenas identificar os componentes bioativos, potenciais alvos e vias regulatórias centrais do extrato de Xanthium sibiricum relacionadas à OA por meio da integração multi-ômica e análise computacional, mas também verificar seu efeito condroprotetor sobre a OA por meio de modelos in vivo e esclarecer ainda mais seu mecanismo regulador sobre o transcriptoma de condrócitos.
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Todos os experimentos envolvendo amostras clínicas e camundongos foram conduzidos de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Centro Provincial de Pesquisa em Biotecnologia Médica de Shandong. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento e cultivo de condrócitos articulares humanos
Amostras de cartilagem articular humana foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia artroscópica ou artroplastia articular total no Primeiro Hospital Afiliado da Primeira Universidade Médica de Shandong. Fatias de cartilagem foram transportadas para o laboratório em gelo dentro de 30 minutos após a excisão cirúrgica. O tecido foi lavado cuidadosamente com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS; 3–5 lavagens), depois picado finamente em aproximadamente 1mm 3 fragmentos usando tesouras cirúrgicas estéreis. Foi realizada digestão enzimática sequencial, começando com a pré-digestão usando tripsina-EDTA 0,25% por 30 minutos a 37 °C. O processo de digestão era monitorado até que os fragmentos de cartilagem ficassem mais finos, reduzidos de tamanho e translúcidos, após o que os fragmentos de cartilagem eram coletados por centrifugação (200 × g, 5 min) em temperatura ambiente. Em seguida, houve digestão durante a noite (8 h, 37 °C) com 0,2% de colagênase tipo II sob agitação suave contínua. O processo digestivo foi monitorado até que todos os fragmentos de cartilagem visíveis macroscopicamente estivessem completamente dissolvidos. As células liberadas foram coletadas por centrifugação (200 × g, 5 min) em temperatura ambiente, ressuspensas em DMEM completo suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, e semeadas em2 frascos de cultura de 75 cm. As células foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Condrócitos aderentes foram destacados usando 0,25% de tripsina-EDTA, e as células foram subcultivadas em proporção de 1:3 quando as células aderentes atingiram 80% da confluência da superfície do frasco de cultura.
2. Preparação do extrato de Fructus Xanthii
Frutos secos e maduros de Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) foram coletados de populações naturais no norte da China e autenticados por um farmacnólogo sênior. O espécime foi depositado no herbário da Primeira Universidade Médica de Shandong. 20 g de Fructus Xanthii finamente em pó foram colocados em um dedal de extração, e a extração exaustiva com Soxhlet foi realizada usando etanol 95% (aproximadamente 250 mL) até que sete a oito ciclos de sifão fossem concluídos. O extrato etanólico foi filtrado, e o filtrado foi concentrado até ressecar sob pressão reduzida a 45 °C usando um evaporador rotativo. O resíduo resultante era ressuspenso em 60 mL de água duplamente destilada e dividido sucessivamente com 60 mL de acetato de etila em um funil separador. A mistura foi agitada vigorosamente e deixada passar por separação de fases a 4 °C por 24 horas. A camada aquosa era então coletada, liofilizada e armazenada a −80 °C até uso posterior.
3. Fluxo de trabalho padronizado para metabolômica LC-MS/MS não direcionada
4. Análise de farmacologia de redes
5. Determinação da Concentração Máxima Tolerada (MTC) no peixe-zebra
Larvas transgênicas de peixe-zebra (Tg col2a1a:EGFP) 2 dias após a fertilização (2 dpf) foram distribuídas aleatoriamente em placas de 6 poços com uma densidade de 30 larvas por poço. Cada poço foi suplementado com 3 mL de meio de exposição contendo extrato de Fructus Xanthii diluído em série. Larvas moribudas ou mortas eram removidas diariamente. As larvas foram expostas continuamente a 28 °C por 72 horas, após o que a concentração máxima tolerada (CMT) foi determinada como a mais alta na qual a mortalidade larval não ultrapassou 10%.
6. Estabelecimento do modelo de lesão óssea do peixe-zebra
Tg col2a1a: Larvas de peixe-zebra de EGFP 2 dias após a fertilização (2 dpf) foram distribuídas em quatro grupos: controle, modelo, sulfato de condroitina (CS) controle positivo e tratamento com extrato de Fructus Xanthii . Todos os grupos, exceto o grupo controle, foram expostos a Staphylococcus aureus (OD600 = 0,8, 1 × 108 CFU/mL) por 24 horas para induzir lesão óssea. O estabelecimento bem-sucedido do modelo foi confirmado pela verificação de uma redução de pelo menos 50% na intensidade de fluorescência verde específica da cartilagem na região craniofacial em relação ao grupo controle sob um microscópio de epifluorescência.
7. Avaliação quantitativa da fluorescência específica da cartilagem em larvas de peixe-zebra
As larvas foram expostas continuamente a concentrações graduadas de extrato de Fructus Xanthii ou 1.000 μg/mL de sulfato de condroitina de sódio A (controle positivo) a 28 °C por 72 horas. Posteriormente, 10 larvas foram selecionadas aleatoriamente de cada réplica de 6 poços (n = 30 por grupo). As larvas selecionadas foram anestesiadas usando 0,016% de tricaína e posicionadas lateralmente sobre almofadas de agarose de 1% de baixa fusão. Imagens de fluorescência foram obtidas com ampliação de 2× (excitação 488 nm, emissão 525/50 nm) usando um estereoscópio equipado com uma câmera de fluorescência. A intensidade específica da cartilagem do EGFP na região craniofacial, incluindo a cartilagem cerato-hial e a cartilagem de Meckel, foi quantificada usando software de análise de imagem. A correção de antecedentes foi realizada nos valores integrados de densidade, e os valores corrigidos foram normalizados para o grupo controle para análise estatística da eficácia condroprotetora.
8. Indução de OA em camundongos C57BL/6J
Ratos machos C57BL/6J (6–8 semanas, 20–22 g) foram alojados sob condições específicas livres de patógenos (FPS) a 22 °C ± 2 °C, com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos foram autorizados a se aclimatar por uma semana e depois foram distribuídos aleatoriamente em três grupos (n = 8 por grupo) usando uma tabela de números aleatórios: (1) controle operado por simulação, (2) OA induzida por ACLT (ACLT) e (3) intervenção com extrato ACLT mais Fructus Xanthii (ACLT + extrato de Fructus Xanthii ). Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em condições estéreis, de acordo com um protocolo previamente validado.
Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital de sódio intraperitoneal (50 mg/kg) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados), e uma incisão parapatelar medial foi feita para expor a cápsula da articulação direita do joelho. O ligamento cruzado anterior foi cortado sob um microscópio cirúrgico para induzir instabilidade articular, após o que a cápsula articular e a pele foram fechadas em camadas usando suturas absorvíveis 6-0. Camundongos operados por simulação passaram por procedimentos de artrotomia idênticos sem transeção ligamentar. A estabilidade articular foi avaliada, e o estabelecimento bem-sucedido do modelo foi confirmado pela realização do teste da gaveta ou pela avaliação do grau de lesão articular em seções histológicas dos camundongos do grupo modelo.
Analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,1 mg/kg, injeção subcutânea) foi administrada por três dias consecutivos. Os agentes de tratamento eram administrados uma vez ao dia por gavage. O grupo do extrato ACLT + Fructus Xanthii recebeu 100 μL de 1.000 μg/mL de extrato de Fructus Xanthii diluído em soro fisiológico normal, enquanto os outros dois grupos receberam 100 μL de soro fisiológico normal como controle do veículo. Às 8 semanas pós-cirurgia, os camundongos foram eutanasiados por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical, e as articulações do joelho foram recolhidas para análises histológicas.
9. Coloração histopatológica
10. Sequenciamento de RNA (RNA-seq)
Condrócitos articulares humanos primários (passagens 2–3) foram semeados em placas de 6 poços com densidade de 5 × 10células 5 por poço. As células foram privadas de soro por 24 horas e depois distribuídas em dois grupos (n = 3 por grupo): (1) Grupo controle: as células foram tratadas apenas com veículo (0,1% de DMSO); (2) Grupo do extrato de Fructus Xanthii : as células foram tratadas com extrato de Fructus Xanthii de 1.000 μg/mL dissolvido em DMSO.
As células foram tratadas por 24 horas, após as quais o RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol, conforme o protocolo do fabricante. A integridade e concentração do RNA (RIN ≥7,0) foram avaliadas usando um analisador de RNA. Bibliotecas de cDNA específicas para fita foram preparadas usando um kit de preparação de biblioteca de sequenciamento de RNA e sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração (NGS) de alta taxa em modo pareado de 150 bp (PE150). O controle de qualidade dos arquivos FASTQ brutos era realizado usando FastQC, seguido por adaptadores e corte de qualidade usando Trimmomatic antes da análise posterior.
11. Processamento de dados RNA-seq
Genes diferencialmente expressos por extrato de Fructus Xanthii (vs. grupo controle; p < 0,05 e logFC < −0,5) foram extraídos do conjunto de dados RNA-seq e intersectados com os 10 principais alvos centrais. Os alvos centrais resultantes associados ao extrato de Fructus Xanthii e à osteoartrite foram visualizados usando o pacote ggvenn.
12. ELISA
Condrócitos articulares humanos primários nas passagens 2–3 foram semeados em placas de 6 poços com densidade de 5 × 10 células5 por poço. As células foram incubadas em meio sem soro por 24 horas para induzir a quiescência. As células foram subsequentemente divididas nos seguintes três grupos (n = 3 por grupo):
(1) Controle em branco: as células foram tratadas apenas com veículo (0,1% DMSO); (2) Controle positivo: a inflamação celular foi induzida com IL-1β, seguida de tratamento com veículo (DMSO 0,1%); (3) Grupo do extrato de Fructus Xanthii : a inflamação celular foi induzida com IL-1β, seguida do tratamento com extrato de Fructus Xanthii de 1000 μg/mL dissolvido em 0,1% de DMSO. Os supernadantes de cultura celular eram coletados após 24 horas de incubação e armazenados a −80 °C até o uso. Os níveis de MMP1 e PGR nos supernadantes da cultura foram determinados usando kits de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponíveis, específicos para MMP1 e PGR humanos, respectivamente. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
13. Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando software de análise estatística e gráficos, e os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DS). A normalidade dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk, e a homocedasticidade foi avaliada usando o teste de Levene. Comparações entre grupos foram realizadas usando análise de variância unidirecional ou bidirecional (ANOVA), seguidas por testes pós-hoc de Tukey ou Šidák, conforme apropriado. Comparações par a par foram realizadas usando um teste t de Student de duas caudas. Dados não paramétricos foram analisados usando o teste Mann–Whitney U. Um valor P bilateral < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Avaliação de qualidade e paisagem metabólica dos dados LC-MS/MS não direcionados
Amostras de QC demonstraram excelente reprodutibilidade, como indicado por cromatografias de TIC altamente sobrepostas tanto nos modos de íons positivos quanto negativos, com a deriva de tempo de retenção permanecendo abaixo de 0,05 min em todo o lote analítico. Os dados brutos passaram por pré-processamento baseado em XCMS, que incluiu detecção de picos, integração e alinhamento no tempo de reten...
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A OA é um distúrbio degenerativo articular prevalente e uma das principais causas de incapacidade no mundo36. Sua patogênese é complexa e multifatorial, envolvendo alterações bioquímicas, celulares e moleculares nos tecidos articulares. Antes considerado um simples fenômeno de "desgaste" da cartilagem articular, a OA é agora amplamente reconhecida como uma doença crônica que abrange toda a articulação, caracterizada por degradação da cartilagem, inflamação sinovia...
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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Essa pesquisa foi financiada pelo Projeto de Superfície do Fundo de Natureza da Província de Shandong (Nº ZR2024MH088), o Projeto de Tecnologia de Medicina Tradicional Chinesa da Província de Shandong (nº 2020M070), e o Fundo de Cultivo do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Primeira de Shandong e do Hospital Provincial de Shandong Qianfoshan (Bolsa nº QYPY2022NSFC0601)".
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp, China | BL539A | pH 7.4, estéril |
| C57BL/6 Mice | Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China | N/A | Macho, 8-10 semanas de idade, 20-25g |
| Sulfato de condroitina | MCE, America | HY-B2162 | Pureza ≥98% |
| ClusterProfiler (R Package) | Bioconductor | Acesso gratuito | Integrado no R v4.2.2 |
| Colagenase, Tipo II, pó | Gibco, America | 17101015 | ≥125 U/mg |
| Cytoscape | Consórcio Cytoscape | Acesso gratuito (https://cytoscape.org/) | v3.9.1 (com CytoHubba) |
| Cytoscape | Consórcio Cytoscape | Acesso gratuito | Versão 3.9.1 |
| DESeq2 (R Package) | Bioconductor | Acesso gratuito | Integrado no R v4.2.2 |
| DMEM, alta glicose | Gibco, America | 11965092 | Meio estéril |
| Etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009218 | Grau analítico, 95% |
| Acetato de etilo | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009418 | Grau analítico |
| Soro fetal bovino (FBS) | Cellmax, China | SA102.02 | Inativado por calor |
| Microscópio de Fluorescência | Nikon, Japão | Eclipse Ti2-U | Equipado com filtro GFP (excitação de 488nm) & câmera digital |
| Banco de Dados GEO | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r | Ferramenta de análise GEO2R |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC, America | Comercial | Versão 9.5.1 |
| Kit de Coloração Hematoxilina-Eosina(HE) | Solarbio, China | G1120 | Kit pronto para uso |
| Banco de Dados HERB | Academia Chinesa de Ciências | http://herb.ac.cn/ | V2.0 |
| Kit ELISA para MMP-1 Humano | Yamei Biotechnology, China | HJ088 | Para humanos, placa de 96 poços |
| Kit ELISA para Receptor de Progesterona Humano (PR) | Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China | ml05997 | Para humanos, placa de 96 poços |
| ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde (NIH) | Acesso gratuito | Versão 1.53t |
| Microscópio de Luz | Olympus, Japão | BX53 | Objetivos 10×/20× & câmera digital |
| Liofilizador | Christ, Alemanha | Alpha 1-4 LDplus | Sistema de secagem a vácuo |
| Kit de Coloração Modificado Saffron-O e Fast Green | Solarbio, China | G1371 | Para coloração de osso/cartilagem |
| Bálsamo Neutro | Solarbio, China | G8590 | Meio de montagem |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco, America | 15070063 | 100×, estéril |
| Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) | Sparkjade, China | CR0013-500ML | pH 7.2-7.4, estéril |
| Software R | Fundação R para Computação Estatística | Acesso gratuito (https://www.r-project.org/) | v4.4.1 (com ggvenn) |
| Meio de Congelamento Celular Livre de Soro | Biosharp, China | BL203B | Estéril |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 25923 | Cepa padrão |
| Banco de Dados STRING | Consórcio STRING | https://string-db.org/ | Análise de interação de proteínas |
| Banco de Dados TCMID | Centro de Inovação Colaborativa de Shaanxi Qinling Qiyao | https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php | V3.0 |
| Zebrafish Tg(col2a1a:EGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | N/A | Larvae (2 dpf), linhagem AB |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher, America | 15596018CN | Para extração de RNA total |
| Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho | Gibco, America | 25200056 | Solução estéril |
| Cromatografia Líquida de Ultra-Alto Desempenho (UHPLC) | Thermo Fisher, America | Q Exactive Focus | Acoplado com HRMS/MS |
| XCMS-online | Instituto de Pesquisa Scripps | Acesso gratuito | Plataforma baseada na web |
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