Este protocolo de estudo foi projetado para investigar sistematicamente os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii na osteoartrite, por meio de análises multi-ômicas integradas e experimentos in vivo .
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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este protocolo de estudo foi projetado para investigar sistematicamente os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii na osteoartrite, por meio de análises multi-ômicas integradas e experimentos in vivo .
A osteoartrite (OA) é um distúrbio degenerativo progressivo das articulações para o qual as intervenções farmacológicas e cirúrgicas atuais geralmente aliviam os sintomas, em vez de reverter as mudanças patológicas subjacentes, destacando a necessidade urgente de novos agentes terapêuticos. Esse protocolo teve como objetivo investigar os potenciais efeitos condroprotetores do extrato de Fructus Xanthii contra a OA. Primeiro, o perfil metabolômico não direcionado foi realizado usando cromatografia líquida de ultra-alto desempenho combinada com espectrometria de massa tandem de alta resolução (UHPLC-HRMS/MS) para caracterizar os constituintes químicos do extrato. Uma estratégia integrada que combina farmacologia em rede e mineração transcriptômica foi então aplicada para identificar componentes bioativos e alvos potenciais do extrato, seguida por análise cruzada com genes desregulados relacionados à OA para obter os genes alvo centrais. Foram realizadas análises de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) para anotar os principais processos biológicos e vias de sinalização modulados pelo extrato. Para validação in vivo , modelos de lesão da cartilagem do peixe-zebra e modelos de OA em camundongos foram usados para avaliar os efeitos condroprotetores do extrato. O sequenciamento de RNA (RNA-seq) foi adotado para analisar alterações transcriptômicas em condrócitos após o tratamento, focando em vias associadas à OA e perfis de expressão gênica; Posteriormente, foi realizado um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) para verificar os níveis de expressão das principais proteínas/receptores triados pelo RNA-seq, a fim de confirmar ainda mais os efeitos regulatórios do extrato de Fructus Xanthii nos alvos principais da OA. Esse protocolo multi-ômico integrado e experimental oferece uma abordagem sistemática para explorar o potencial do extrato de Fructus Xanthii como um candidato botânico promissor para intervenção na Artosmodina.
A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa das articulações caracterizada pela degradação progressiva da cartilagem articular, esclerose óssea subcondral, inflamação sinovial e formação deosteófitos 1. De acordo com o estudo Global Burden of Disease (GBD), a prevalência da OA aumentou de forma constante em 204 países e territórios de 1990 a 20202, com essa tendência esperada para acelerar junto com o envelhecimento demográficoglobal 3. Estimativas atuais indicam que mais de 250 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas, colocando uma pressão significativa....
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Todos os experimentos envolvendo amostras clínicas e camundongos foram conduzidos de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Centro Provincial de Pesquisa em Biotecnologia Médica de Shandong. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento e cultivo de condrócitos articulares humanos
Amostras de cartilagem articular humana foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia artroscópica ou artroplastia articular total no Primeiro Hospital Afiliado da Primeira Universidade Médica....
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Avaliação de qualidade e paisagem metabólica dos dados LC-MS/MS não direcionados
Amostras de QC demonstraram excelente reprodutibilidade, como indicado por cromatografias de TIC altamente sobrepostas tanto nos modos de íons positivos quanto negativos, com a deriva de tempo de retenção permanecendo abaixo de 0,05 min em todo o lote analítico. Os dados brutos passaram por pré-processamento baseado em XCMS, que incluiu detecção de picos, integração e alinhamento no tempo de reten.......
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A OA é um distúrbio degenerativo articular prevalente e uma das principais causas de incapacidade no mundo36. Sua patogênese é complexa e multifatorial, envolvendo alterações bioquímicas, celulares e moleculares nos tecidos articulares. Antes considerado um simples fenômeno de "desgaste" da cartilagem articular, a OA é agora amplamente reconhecida como uma doença crônica que abrange toda a articulação, caracterizada por degradação da cartilagem, inflamação sinovia.......
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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Essa pesquisa foi financiada pelo Projeto de Superfície do Fundo de Natureza da Província de Shandong (Nº ZR2024MH088), o Projeto de Tecnologia de Medicina Tradicional Chinesa da Província de Shandong (nº 2020M070), e o Fundo de Cultivo do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Primeira de Shandong e do Hospital Provincial de Shandong Qianfoshan (Bolsa nº QYPY2022NSFC0601)".
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp, China | BL539A | pH 7.4, estéril |
| C57BL/6 Mice | Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China | N/A | Macho, 8-10 semanas de idade, 20-25g |
| Sulfato de condroitina | MCE, America | HY-B2162 | Pureza ≥98% |
| ClusterProfiler (R Package) | Bioconductor | Acesso gratuito | Integrado no R v4.2.2 |
| Colagenase, Tipo II, pó | Gibco, America | 17101015 | ≥125 U/mg |
| Cytoscape | Consórcio Cytoscape | Acesso gratuito (https://cytoscape.org/) | v3.9.1 (com CytoHubba) |
| Cytoscape | Consórcio Cytoscape | Acesso gratuito | Versão 3.9.1 |
| DESeq2 (R Package) | Bioconductor | Acesso gratuito | Integrado no R v4.2.2 |
| DMEM, alta glicose | Gibco, America | 11965092 | Meio estéril |
| Etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009218 | Grau analítico, 95% |
| Acetato de etilo | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009418 | Grau analítico |
| Soro fetal bovino (FBS) | Cellmax, China | SA102.02 | Inativado por calor |
| Microscópio de Fluorescência | Nikon, Japão | Eclipse Ti2-U | Equipado com filtro GFP (excitação de 488nm) & câmera digital |
| Banco de Dados GEO | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r | Ferramenta de análise GEO2R |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC, America | Comercial | Versão 9.5.1 |
| Kit de Coloração Hematoxilina-Eosina(HE) | Solarbio, China | G1120 | Kit pronto para uso |
| Banco de Dados HERB | Academia Chinesa de Ciências | http://herb.ac.cn/ | V2.0 |
| Kit ELISA para MMP-1 Humano | Yamei Biotechnology, China | HJ088 | Para humanos, placa de 96 poços |
| Kit ELISA para Receptor de Progesterona Humano (PR) | Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China | ml05997 | Para humanos, placa de 96 poços |
| ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde (NIH) | Acesso gratuito | Versão 1.53t |
| Microscópio de Luz | Olympus, Japão | BX53 | Objetivos 10×/20× & câmera digital |
| Liofilizador | Christ, Alemanha | Alpha 1-4 LDplus | Sistema de secagem a vácuo |
| Kit de Coloração Modificado Saffron-O e Fast Green | Solarbio, China | G1371 | Para coloração de osso/cartilagem |
| Bálsamo Neutro | Solarbio, China | G8590 | Meio de montagem |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco, America | 15070063 | 100×, estéril |
| Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) | Sparkjade, China | CR0013-500ML | pH 7.2-7.4, estéril |
| Software R | Fundação R para Computação Estatística | Acesso gratuito (https://www.r-project.org/) | v4.4.1 (com ggvenn) |
| Meio de Congelamento Celular Livre de Soro | Biosharp, China | BL203B | Estéril |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 25923 | Cepa padrão |
| Banco de Dados STRING | Consórcio STRING | https://string-db.org/ | Análise de interação de proteínas |
| Banco de Dados TCMID | Centro de Inovação Colaborativa de Shaanxi Qinling Qiyao | https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php | V3.0 |
| Zebrafish Tg(col2a1a:EGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | N/A | Larvae (2 dpf), linhagem AB |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher, America | 15596018CN | Para extração de RNA total |
| Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho | Gibco, America | 25200056 | Solução estéril |
| Cromatografia Líquida de Ultra-Alto Desempenho (UHPLC) | Thermo Fisher, America | Q Exactive Focus | Acoplado com HRMS/MS |
| XCMS-online | Instituto de Pesquisa Scripps | Acesso gratuito | Plataforma baseada na web |