Modelos Animais de Rato para Avaliação dos Efeitos da Estimulação Sacral e Periférica dos Nervos Periféricos na Função da Bexiga

Resumo

Este protocolo descreve técnicas cirúrgicas detalhadas para estimular os nervos sacro, tibial e peroneal em ratos anestesiados. Esses modelos possibilitam a investigação dos efeitos da neuromodulação na função da bexiga, auxiliam na determinação dos parâmetros ótimos de estimulação e possibilitam o estudo dos mecanismos de ação das terapias de estimulação dos nervos sacros e periféricos.

Resumo

A neuromodulação, uma abordagem terapêutica para a disfunção de vários órgãos, tem se mostrado eficaz no tratamento de disfunções do trato urinário inferior. Apesar do sucesso clínico, os mecanismos subjacentes à neuromodulação permanecem incompletamente compreendidos, enfatizando a necessidade de modelos animais padronizados e reprodutíveis. Modelos pré-clínicos de neuromodulação urinária usando estimulação dos nervos sacros e periféricos são estabelecidos há mais de duas décadas; no entanto, a literatura existente fornece detalhes metodológicos limitados sobre os procedimentos cirúrgicos. Este artigo oferece uma descrição detalhada e uma representação visual de técnicas bem estabelecidas para estimulação do nervo sacro. Também descreve uma abordagem modificada para a estimulação do nervo tibial e introduz um novo método de neuromodulação da bexiga usando estimulação do nervo peroneal em um modelo de rato. A abordagem de estimulação do nervo tibial modificado envolve expor e estimular o nervo tibial em sua origem, como um ramo do nervo ciático, em vez de no tornozelo medial, como descrito em estudos anteriores. Dada a recente introdução da estimulação do nervo peroneal para neuromodulação da bexiga na prática clínica, este artigo propõe um modelo único de ratos para investigar seus mecanismos no controle da função do trato urinário inferior. A orientação passo a passo para os três métodos de neuromodulação é descrita para exposição nervosa, colocação de eletrodos e verificação do sucesso da colocação de eletrodos com base em respostas motoras características. Um exemplo representativo do efeito da estimulação do nervo peroneal na função da bexiga em um modelo de rato de hiperatividade bexiga induzida por ácido acético é incluído para demonstrar sua aplicabilidade. Este artigo apresenta um protocolo padronizado e tecnicamente acessível para estudar mecanismos de neuromodulação, incluindo alterações na sinalização sensorial da bexiga, vias regulatórias espinais e supraespinhal, otimização dos parâmetros de estimulação e comparação da eficácia de diferentes alvos de estimulação.

Introdução

A neuromodulação utiliza estimulação elétrica de baixa amplitude para alterar a função do órgão^{terminal 1}. No contexto da disfunção do trato urinário inferior, como síndrome da bexiga hiperativa (OAB), retenção urinária não obstrutiva, bexiga neurogênica e síndrome da dor urinária, a neuromodulação é empregada como tratamento de terceira linha para pacientes que falharam na terapia comportamental e^{na farmacoterapia 2}. Para neuromodulação em pacientes com CCA, a estimulação do nervo tibial posterior e a estimulação do nervo sacro (SNS) têm sido amplamente utilizadas na prática clínica. Abordagens experimentais de neuromodulação que visam nervos periféricos adicionais, incluindo os nervos pudendo e peroneal, estão sendo^estudadas 3,4,5,6.

Embora a neuromodulação tenha sido usada no tratamento de doenças da bexiga e do intestino há várias décadas, seu mecanismo de ação não é totalmente compreendido. Como declarado na revisão do grupo multidisciplinar de especialistas, os parâmetros de estimulação atualmente usados foram escolhidos principalmente pelos fabricantes com base em uma abordagem de tentativa e^{erro 7}. Portanto, é importante continuar usando modelos animais para elucidar as vias subjacentes e otimizar parâmetros de estimulação para melhorar o efeito terapêutico. Vários experimentos pré-clínicos foram realizados, utilizando animais acordados e anestesiados, incluindo camundongos, ratos, ovelhas, cães e^{gatos 4}. Com diretrizes éticas e políticas de pesquisa em todo o mundo incentivando o uso de espécies menores e menos complexas, modelos de roedores têm sido usados com mais frequência nos últimos anos.

A SNS em modelos de disfunção bexiga em ratos tem empregado predominantemente duas abordagens metodológicas. A primeira, descrita por Zvara et al., envolve a implantação de um eletrodo estimulante no forame sacro usando um angiocateter ou uma agulha^{espinhal 8}. A segunda abordagem requer a exposição da raiz nervosa L6 e o posicionamento dos eletrodos estimulantes sob os nervos L6, com cola de silicone usada para fixar o contato entre o eletrodo e o nervo⁹. A técnica que envolve a colocação de eletrodos no forame sacro reflete a abordagem clínica. O método que utiliza a exposição da raiz L6, embora tecnicamente desafiador, proporciona localização precisa e acesso mais consistente ao nervo.

Modelos animais de rato que imitam a estimulação do nervo tibial posterior foram descritos na literatura. O método mais frequentemente utilizado envolve a exposição cirúrgica do nervo tibial na face medial do membro posterior acima do^tornozelo 10,11,12,13,14,15,16. Outro método consiste na inserção percutânea de eletrodos de agulha próximos ao nervo^{tibial 17}. Este artigo tem como objetivo fornecer uma descrição detalhada da estimulação do nervo tibial em sua origem, entre os músculos glúteo maior e bíceps femoral, onde o nervo ciático se divide em três ramos: o nervos tibial, o peroneal comum e o sural. Além disso, este estudo introduz a estimulação do nervo peroneal como um novo modelo animal para investigar um novo método de neuromodulação. A relevância translacional desse modelo de rato é apoiada pela recente introdução clínica da estimulação do nervo peroneal para neuromodulação da^{bexiga 18,19}.

Protocolo

Os animais foram alojados na Unidade de Cuidados Animais da Universidade do Sul da Dinamarca, seguindo as diretrizes institucionais. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório. O Comitê de Ética da Inspetoria Dinamarquesa de Experimentos com Animais aprovou os procedimentos do estudo (Protocolo nº 2022-15-0201-01158). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação dos eletrodos

NOTA: Para estimulação tibial, peroneal e do nervo L6, eletrodos bipolares em formato de gancho foram^{usados 20}. Os passos a seguir fornecem uma breve descrição do projeto e construção dos eletrodos.

1. Corte dois fios de prata revestidos com politetrafluoroetileno (PTFE) de comprimento igual e torça-os juntos.
2. Retire 4–5 mm de PTFE de uma das extremidades dos fios, corte as extremidades expostas uniformemente e dobre as pontas para cima sobre uma agulha de 23 G para formar dois ganchos paralelos espaçados a 2 mm.
3. Fixe o eletrodo em uma placa e posicione os ganchos voltados para cima e se estendendo sobre a borda da placa.
4. Misture a cola de silicone bicomponente por 5 segundos. Aplique uma gota de 1–2 mm dos ganchos e deixe secar por aproximadamente 5 minutos.
5. Remova uma seção de 1–2 cm do revestimento de PTFE da extremidade oposta do eletrodo para permitir a conexão ao estimulador.

2. Preparação de animais

NOTA: Em condições estéreis, cateteres PE-50, com a extremidade dilatada pelo calor, foram implantados na cúpula da bexiga das fêmeas de ratos Sprague-Dawley (250–300 g) e fixados com uma sutura de cordão de bolsa. A extremidade distal do tubo foi externalizada nas costas do animal e enrolada em uma bolsa subcutânea²¹. Cinco dias foram permitidos para a bexiga se recuperar após a cirurgia.

1. Anestesiar o animal com uretano (1,5 g/kg, intraperitoneal) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Administre uretano em três doses divididas em intervalos de 15 minutos, aproximadamente 2 horas antes do início do experimento.
2. Transfira o animal para uma bolsa térmica e coloque-o em posição deitada.
3. Para estimulação dos nervos tibial e peroneal, raspe o membro posterior do rato ao redor da região da coxa, assim como a metade inferior das costas. Coloque a cauda e uma seringa de 5 mL sob o membro traseiro esquerdo do rato e fixe a cauda e a perna conforme mostrado na Figura 1A.
4. Para SNS, raspe as costas do rato da cauda até a coluna torácica e coloque um tubo centrífugo de 50 mL sob o abdômen para elevar a região lombar e sacral.
   NOTA: Todos os experimentos de neuroestimulação representam procedimentos não relacionados à sobrevivência. Use técnicas cirúrgicas limpas.

3. Dissecação dos nervos peroneal e tibial e implantação dos eletrodos

1. Use um bisturi para fazer uma incisão de 3–3,5 cm no centro entre a articulação do joelho e a tuberosidade isquial (Figura 1B).
2. Separe a pele do músculo deslizando a tesoura por baixo da pele e cortando o tecido conjuntivo.
3. Abra a pele usando retratores e exponha a fáscia que conecta o glúteo máximo aos músculos bíceps femoris (Figura 1C).
4. Use tesouras retas para cortar a fáscia e dissecar o espaço entre o glúteo máximo e o bíceps femoral até que o nervo ciático seja visualizado (Figuras 1D,E).
5. Reposicione os retratores no bíceps femoral para obter boa exposição do nervo ciático e seus ramos – os nervos tíbio, peroneal e sural (Figura 2A). Nesse contexto, "nervo peroneal" refere-se ao nervo peroneal comum antes de sua divisão em nervos peroneus profundos e superficiais. O nervo tibial é o maior ramo; O nervo sural é o menor e o peroneal tem diâmetro intermediário.
6. Separe o nervo peroneal do tecido conjuntivo ao redor usando pinças curvas e microtesouras. Depois, use microfórceps para espalhar cuidadosamente o tecido dos dois lados e por baixo dele, isolando uma seção de 5 mm do nervo. Repita o mesmo procedimento com o nervo tibial para estimulação do nervo tibial (Figura 2B).
   NOTA: Evite esmagar o nervo levantando-o com a pinça e reduza ao mínimo a puxada no nervo.
7. Faça uma incisão de 5 mm de comprimento na metade inferior das costas usando um bisturi e deslize um hemostado sob a pele através da incisão para criar um canal subcutâneo. Avance o hemostat cuidadosamente até que a ponta surja na incisão do membro posterior (Figura 2C).
8. Usando o hemostato, segure a extremidade desencaixada do eletrodo e retire lentamente o instrumento pela incisão na metade inferior das costas. Usando duas pinças, dobre a outra extremidade do eletrodo (extremidade ganchosa) em um ângulo de 90° em relação ao plano subcutâneo e certifique-se de que os ganchos do eletrodo estejam posicionados adjacentes e perpendiculares ao nervo (peroneal ou tibial) (Figura 2D).
   NOTA: O posicionamento correto do eletrodo é importante para evitar esticar o nervo.
9. Use micropinças curvas para levantar o nervo e deslize os ganchos do eletrodo sob o nervo. Misture a cola de silício de dois componentes por 5 segundos, use um cotonete para secar o nervo e aplique cola suficiente para cobrir os ganchos e a área adjacente ao nervo (Figura 2E–G).
   NOTA: Antes de aplicar cola, conecte os eletrodos ao estimulador e estimule o nervo no nível do limiar motor para confirmar a colocação correta do eletrodo. O limiar do motor foi determinado como a tensão mínima necessária para provocar um movimento fásico consistente do pé. A estimulação do nervo peroneal gera uma flexão dorsal fasica do pé, enquanto a estimulação do nervo tibial gera uma flexão plantar. Na ausência da resposta motora à estimulação, verifique a conexão entre o estimulador e o eletrodo.
10. Coloque um ponto de nylon 5-0 no tecido conjuntivo na incisão traseira, deixando ambas as extremidades do ponto suficientemente longas. Essas extremidades são usadas para fixar o eletrodo no lugar, garantindo uma posição estável.
11. Feche a pele na incisão do membro posterior usando um ponto de sutura 4-0 com Vicryl.

4. Exposição do nervo L6 e implantação do eletrodo

1. Use um bisturi para fazer uma incisão média de 4–5 cm sobre a região lombar e o sacro. Coloque retratores para abrir a incisão, exponha os músculos subjacentes das costas e as pontas dos processos espinhosos vertebrais (Figura 3A).
2. Palpar a crista ilíaca e usá-la como ponto de referência para localizar os processos espinhosos de L6. Pode ser identificado como o primeiro processo espinhoso localizado logo abaixo da crista ilíaca (Figura 3B).
3. Use tesoura para remover a fáscia no topo das vértebras de L5 a S2. Em seguida, isole e desprenda cuidadosamente os músculos paravertebrais bilateralmente para expor os processos espinhosos, lâminas e processos articulares. Remova o tecido conjuntivo e o músculo restantes com microtesoura até que as estruturas ósseas fiquem claramente visíveis (Figuras 4A,B).
   NOTA: Isso cria uma janela anatômica que expõe pontos de referência e dá acesso ao tronco nervoso L6. Identificar a articulação facetária posterior da L6; o tronco nervoso L6 passa caudal até essa articulação. Além disso, identifique o sacro e as articulações sacroilíacas. O tronco nervoso L6 corre caudal e medial até essa articulação (Figura 4B).
4. Use um rongeur para remover cuidadosamente o processo espinhoso de S1 e gradualmente quebre e remova pequenos fragmentos do osso sacro na região entre as vértebras S1 e S2 para expor o tronco nervoso L6 (Figura 4C).
5. Separe o nervo L6 do tecido ao redor usando pinças curvas e microtesouras. Conecte o nervo a um eletrodo de fio de prata revestido com PTFE bipolar e isole-o do tecido ao redor usando cola de silicone biocompatível, conforme descrito no passo 3.9 (Figura 4D).
   NOTA: A estimulação do nervo L6 gera contração dos músculos do assoalho pélvico e contração da cauda.
6. Repita o mesmo procedimento do lado oposto para estimulação nervosa bilateral.
7. Feche a pele com um ponto de Vicryl 4-0.

5. Inserção de um eletrodo estimulante no forame sacro

1. Use um bisturi para fazer uma incisão na linha média sobre o sacro e retráteis para abrir a incisão e expor os músculos subjacentes das costas.
   NOTA: Palpar a crista ilíaca conforme mencionado no passo 4.2 para localizar os pontos de referência L6/S1.
2. Separe os músculos paravertebrais dos processos espinhosos usando dissecação contunda. Reposicione os retratores nos músculos para obter exposição dos processos espinhosos e facilitar o acesso ao forame sacro S1 (Figura 5A).
3. Identifique a localização do forame S1, que está caudal e lateral ao processo espinhoso S1. Sonde o forame sacro S1 com uma agulha de calibre 18 pré-carregada com o eletrodo monopolar (Figura 5B).
   NOTA: É utilizado um fio de aço inoxidável revestido a PTFE de 180 μm, com 5 mm de isolamento removido de ambas as extremidades.
4. Posicione a ponta da agulha no forame S1, mantendo-a paralela à coluna e inclinada aproximadamente 30° em relação às costas do animal. Avance suavemente o fio ao longo da trajetória do nervo enquanto retira lentamente a agulha. Repita o procedimento no forame contralateral S1 para estimulação bilateral.
   NOTA: Para confirmar o posicionamento correto do eletrodo, conecte a extremidade distal do fio ao estimulador. A estimulação elétrica gera um espasmo na cauda.
5. Fixe os fios ao processo espinhoso adjacente (L6) usando um ponto de sutura 5-0 Vicryl (Figura 5C).
6. Faça uma incisão de 1 cm na parte de trás do pescoço usando um bisturi e crie um túnel subcutâneo usando um hemostato, desde a incisão na parte de trás do pescoço até a incisão no nível sacral.
7. Passe a extremidade distal do fio pelo túnel e exteriorize-a na parte de trás do pescoço (Figura 5D).
8. Feche a fáscia e a pele no nível sacro, assim como a pele na parte de trás do pescoço, usando sutura 4-0 Vicryl.

6. Registro de cistometria

1. Após 5 dias, antes de realizar os experimentos de estimulação, externalice o tubo de PE-50 e conecte-o ao transdutor de pressão e à bomba de infusão.
2. Infunde a bexiga continuamente a uma taxa de 3 mL/h por 2 horas para permitir a estabilização dos parâmetros da bexiga.
3. Avalie parâmetros de cistometria, incluindo pressão basal, pressão limiar, compaciência da bexiga, pressão de micção e capacidade da bexiga antes, durante e depois da estimulação nervosa, utilizando um único ciclo de micção na infusão^{intravesical 21}.
4. Ao final de cada experimento, em conformidade com os padrões éticos, eutanasia dos animais por overdose anestésica.

Resultados

Para demonstrar o desenho experimental para avaliar o efeito da neuromodulação na função do trato urinário inferior, foi apresentado um estudo no qual a estimulação do nervo peroneal foi aplicada em um modelo de rato de hiperatividade urinária induzida pela infusão intravesical de 0,5% de ácido acético. A função da bexiga foi registrada usando uma única cistometria do ciclo de micção antes, durante e depois da estimulação (Figura 6 A,B). A configuração experimental incluiu d...

Discussão

Este artigo fornece uma descrição detalhada dos métodos cirúrgicos para implantação de eletrodos para estimulação dos nervos sacro, tibial e peroneal em um rato anestesiado.

A implantação de um eletrodo de chumbo no forame sacro para estimulação contínua e de baixa amplitude do nervo sacro S3 é um tratamento amplamente aceito para disfunção do trato urinário inferior (LUT) e incontinência fecal. Nos pacientes, o eletrodo é normalmente colocado no forame S3 e d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
18 G disposable injection needle	KRUUSE	121282
Dumont forceps style 5TM	DUMONT	1708-5TM-PO	Curved
Dumont forceps style 7XL	DUMONT	0508-7XL-PO	Curved
Grass SD9 square pulse stimulator	Somatco	1077/183
Hemostat	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm, fine tip
Iris scissors	World Precision Instruments	14218	Straight scissors
Kwik-Sil silicone Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Two-component glue
Micro Adson forceps	World Precision Instruments	501245
Microscissors	S&T	SAC-15 R-8	curved tip ≤ 10mm long
NaCl 0.9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50 tubing	Instech	BTPE-50
Prolene 5-0 suture	Ethicon	EH7257
Rongeur	George Tiemann & Co	160-424-08	Fine curved tip
Surgical Scalpel	Swann-Morton	0505
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500
Vicryl 4-0 suture	Ethicon	V451
Vicryl 5-0 suture	Ethicon	V303
Wire Silver Teflon-coated 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
Wire Stainless Steel Teflon-coated 0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50