O Bex-plex permite visualização simultânea de marcadores proteicos e transcritos de ácidos ribonucleicos para perfilamento espacial profundo de tecido intacto

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para combinar coloração iterativa de proteínas (IBEX) com tecnologia de hibridização in situ por RNAscope para a fenotipagem espacial profunda de tecidos fixos congelados intactos para aplicações de perfil espacial de alta resolução.

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o perfilamento espacial simultâneo de marcadores de proteínas e ácidos ribonucleicos (RNA) com resolução de célula única em tecidos intactos. Uma das questões centrais em torno dos cânceres de tumores sólidos é a incapacidade de prever a resposta do paciente à intervenção terapêutica. Decifrar essas complexidades requer medição quantitativa dos comportamentos celulares, interações e fenótipos dentro dos tecidos intactos. Especificamente, o proteoma e o transcriptoma fornecem informações sobrepostas, porém não redundantes, que podem ser críticas para o desenvolvimento de imunoterapias racionais. No entanto, atualmente não existe uma maneira simples e econômica de perfilar profundamente tanto o estado transcricional quanto o funcional de todas as células no microambiente tumoral, mantendo suas informações críticas de localização espacial. Para isso, combinamos com sucesso a plataforma IBEX (branqueamento iterativo estende a multiplexidade) com o HiPlex RNAscope para visualizar simultaneamente marcadores proteicos de alto plex e transcritos de ácido ribonucleico (RNA) de alto plex com resolução de célula única. Essa abordagem incorpora uma etapa modificada de recuperação de alvos de RNA para preservar a morfologia nuclear e permitir o alinhamento preciso da imagem entre os ciclos. "Bex-Plex" nos permite realizar um protocolo IBEX não modificado em tecidos congelados fixos, seguido pelo protocolo HiPlex RNAscope, no qual utilizamos a recuperação de alvo de RNA modificado para garantir alinhamento em nível nuclear com os ciclos IBEX. Este protocolo é otimizado para tecidos congelados fixos e permite a análise espacial integrada dos estados celulares transcricionais e funcionais. O poder de perfilar nesse nível de célula única não apenas fornece um profundo poço de informações sobre o próprio tecido, mas também pode possibilitar previsões sobre as interações celulares complexas que impulsionam a resposta terapêutica, fornecendo uma estrutura para estudar a biologia espacial em microambientes tumorais e sistemas relacionados.

Introdução

Desde sua introdução em 2011, imunoterapias contra o câncer que diminuem a supressão de células T citotóxicas ao bloquear moléculas inibitórias de checkpoint imunológico, como PDL-1 e CTLA-4, emergiram como o padrão ouro para o tratamento de tumores^{sólidos 1}. No entanto, apesar do uso em larga escala em pacientes, a eficácia clínica desses medicamentos varia amplamente porque muitos cânceres tumorais sólidos apresentam intrinsecamente ou eventualmente geram resistência a essas^{terapias 2}. Em muitos casos, isso se deve à natureza extremamente heterogênea dos tumores sólidos, mesmo entre o mesmo tipo

Protocolo

Os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade da Califórnia, San Diego (número de protocolo S24049). Foram usados camundongos machos e fêmeas de 7 a 12 semanas de idade com base genética C57BL/6 e alojados sob condições específicas livres de patógenos para esses experimentos.

1. Preparação de tecidos

1. Eutanasiar camundongos experimentais por meio de medidas primárias e secundárias aprovadas (por exemplo, eutanásia de CO₂ e luxação cervical) e colher tecidos de interesse em meios suplemen....

Resultados

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do Bex-Plex.
Tecidos congelados fixos seccionados em lâminas revestidas com alúmen cromado passam por até 3 ciclos de IBEX padrão, seguidos de até três ciclos de RNAScope HiPlex, nos quais a etapa inicial de recuperação do alvo é realizada a 60°C por 1 hora. Imagens de ciclos separados são então registradas e alinhadas usando um marcador fidu.......

Discussão

O fluxo de trabalho Bex-Plex integra a plataforma iterativa de coloração proteica, IBEX, com hibridização in situ por RNAscope para permitir a detecção simultânea de proteínas e transcritos de RNA em resolução de célula única. O objetivo principal deste protocolo é fornecer um método reprodutível para análise espacial integrada da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos. A capacidade de medir tanto a expressão de proteínas quanto de RNA no mesmo tecido já apresentou des.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeabilization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retrieval reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023