O Bex-plex permite visualização simultânea de marcadores proteicos e transcritos de ácidos ribonucleicos para perfilamento espacial profundo de tecido intacto

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para combinar coloração iterativa de proteínas (IBEX) com tecnologia de hibridização in situ por RNAscope para a fenotipagem espacial profunda de tecidos fixos congelados intactos para aplicações de perfil espacial de alta resolução.

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o perfilamento espacial simultâneo de marcadores de proteínas e ácidos ribonucleicos (RNA) com resolução de célula única em tecidos intactos. Uma das questões centrais em torno dos cânceres de tumores sólidos é a incapacidade de prever a resposta do paciente à intervenção terapêutica. Decifrar essas complexidades requer medição quantitativa dos comportamentos celulares, interações e fenótipos dentro dos tecidos intactos. Especificamente, o proteoma e o transcriptoma fornecem informações sobrepostas, porém não redundantes, que podem ser críticas para o desenvolvimento de imunoterapias racionais. No entanto, atualmente não existe uma maneira simples e econômica de perfilar profundamente tanto o estado transcricional quanto o funcional de todas as células no microambiente tumoral, mantendo suas informações críticas de localização espacial. Para isso, combinamos com sucesso a plataforma IBEX (branqueamento iterativo estende a multiplexidade) com o HiPlex RNAscope para visualizar simultaneamente marcadores proteicos de alto plex e transcritos de ácido ribonucleico (RNA) de alto plex com resolução de célula única. Essa abordagem incorpora uma etapa modificada de recuperação de alvos de RNA para preservar a morfologia nuclear e permitir o alinhamento preciso da imagem entre os ciclos. "Bex-Plex" nos permite realizar um protocolo IBEX não modificado em tecidos congelados fixos, seguido pelo protocolo HiPlex RNAscope, no qual utilizamos a recuperação de alvo de RNA modificado para garantir alinhamento em nível nuclear com os ciclos IBEX. Este protocolo é otimizado para tecidos congelados fixos e permite a análise espacial integrada dos estados celulares transcricionais e funcionais. O poder de perfilar nesse nível de célula única não apenas fornece um profundo poço de informações sobre o próprio tecido, mas também pode possibilitar previsões sobre as interações celulares complexas que impulsionam a resposta terapêutica, fornecendo uma estrutura para estudar a biologia espacial em microambientes tumorais e sistemas relacionados.

Introdução

Desde sua introdução em 2011, imunoterapias contra o câncer que diminuem a supressão de células T citotóxicas ao bloquear moléculas inibitórias de checkpoint imunológico, como PDL-1 e CTLA-4, emergiram como o padrão ouro para o tratamento de tumores^{sólidos 1}. No entanto, apesar do uso em larga escala em pacientes, a eficácia clínica desses medicamentos varia amplamente porque muitos cânceres tumorais sólidos apresentam intrinsecamente ou eventualmente geram resistência a essas^{terapias 2}. Em muitos casos, isso se deve à natureza extremamente heterogênea dos tumores sólidos, mesmo entre o mesmo tipo^{de câncer 3}. Um entendimento mais aprofundado das relações celulares que ocorrem em tumores sólidos é fundamental para gerar melhores modalidades de tratamento. Assim, identificar os mecanismos exatos e as interações que sustentam e sustentam essa resistência está na vanguarda da pesquisa sobre câncer. Aqui, pretendemos desenvolver um método que permita a análise espacial integrada da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos para melhor caracterizar essas complexas interações celulares.

O microambiente tumoral (TME) é composto pelos componentes celulares e estruturais não cancerosos que moldam o crescimento tumoral e a resposta imunológica, incluindo fibroblastos associados ao câncer, células imunes infiltrantes, componentes vasculares e a matriz^{extracelular 4}. Recentemente, tornou-se evidente que a composição e organização da TME influenciam fortemente se os tumores são permissivos ou resistentes à infiltração imunológica, um dos principais fatores que ditam a resposta à^{imunoterapia 5}. Em muitos cânceres, um fenótipo de "deserto imunológico", caracterizado por baixo número de células T e presença de populações mieloides altamente imunossupressoras, correlaciona-se com baixa resposta às terapias de bloqueio^{por checkpoint 6,7}. A sinalização quimioquina governa muitas dessas dinâmicas de recrutamento. Por exemplo, CXCL1 e CCL2 atraem células mieloides imunossupressoras, enquanto o eixo CXCR3-CXCL9/CXCl10 recruta tanto células T citotóxicas quanto reguladoras no tumor⁸. Consequentemente, o ambiente de sinalização específico de nicho pode influenciar fortemente o fenótipo e a função celular. Por exemplo, em pacientes com câncer colorretal, o eixo CCL5-CCR5 controla a função supressora dos macrófagos associados a tumores (TAMs) e bloquear esse sinal distorce a TAM em direção a um fenótipo antitumorigênico e se correlaciona com respostas clínicas^{melhoradas 9}. Além disso, interações diretas entre células imunes, fibroblastos associados ao câncer e/ou células tumorais via ICAM e PDL-1 podem induzir exaustão imunológica e imunidade antitumoral¹⁰. Juntos, esses achados ressaltam a importância das análises espacialmente resolvidas para entender como a TME influencia a eficácia terapêutica.

A imagem imunofluorescente (FI) continua sendo uma abordagem fundamental para visualizar a expressão proteica e as interações célula-célula nos tecidos. O campo avançou de fluxos de trabalho convencionais de 3-4 cores para fluxos de trabalho de imagem de alto conteúdo que dependem de coloração iterativa e imagem. Nesses métodos, grandes conjuntos de dados são gerados por meio de ciclos repetidos de marcação de anticorpos, imagens e inativação ou remoção de fluoróforos, permitindo que marcadores adicionais possam ser corados e visualizados¹¹. A Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) foi recentemente introduzida como uma plataforma de imagem iterativa amigável e econômica¹². Compatível com o uso de anticorpos comerciais e microscópios convencionais, o IBEX utiliza borohidreto de lítio (_{LiBH 4}) para extinguir a fluorescência dos corantes mais comumente usados sem danificar os epítopos teciduais, permitindo a aquisição de até 75 parâmetros para um único^{tecido 13}. As imagens obtidas a partir dessa coloração cíclica são alinhadas usando o software open-source SimpleITK para produzir conjuntos de dados compostos adequados para análises espaciais de alta dimensão.

Complementarmente à fenotipagem em nível de proteína, os métodos transcriptômicos espaciais podem fornecer informações valiosas sobre o estado transcricional das células em seu ambiente nativo. Notavelmente, a hibridização in situ (ISH) é uma técnica popular para identificar a localização de sequências de DNA ou RNA em um tecido^{específico 11}. RNAscope é uma abordagem ISH bem estabelecida que utiliza sondas com uma química Z única para amplificar especificamente transcritos de RNA com resolução de molécula única e é compatível com muitos tipos diferentes^{de amostras 14}. Como uma plataforma amplamente adotada e comercialmente disponível por meio do Advanced Cell Diagnostics (ACD), o RNAscope oferece sondas validadas contra uma grande variedade de alvos, simplificando o desenho experimental para diversas aplicações.

Uma visão mais completa da identidade e das funções celulares pode ser obtida combinando a detecção de proteínas e RNA dentro do mesmo tecido. Proteínas secretadas de curta duração, como citocinas e quimiocinas, tradicionalmente não possuem coloração confiável de anticorpos pelo IHC, mas informações sobre sua expressão podem ser obtidas por meio da quantificação de seus transcritos de mRNA. Tentativas anteriores de co-detectar RNA e proteína, como o IHC cromogênico convencional ou o TSA-OPAL, foram limitadas por amplificação não linear do sinal e protocolos demorados de recuperação^{de antígenos 15}. Comparado a essas abordagens, o método Bex-Plex permite a detecção simultânea de proteínas e RNA de alto plex, preservando o contexto espacial e a morfologia nuclear para registro preciso da imagem.

Aqui apresentamos o "Bex-Plex", um protocolo que integra as plataformas IBEX e RNAscope para caracterização simultânea e quantificável dos estados transcricionais e translacionais das células em seus tecidos nativos. No Bex-Plex, tecidos embutidos com OCT fixo passam pelo protocolo padrão IBEX, seguido por um fluxo de trabalho RNAscope HiPlex ligeiramente modificado, no qual a recuperação do alvo é realizada a 60°C com um tempo de incubação de 1 hora, em comparação com a incubação original de 99°C por 5 minutos. Isso preserva a arquitetura dos núcleos, permitindo um alinhamento preciso dos marcadores fiduciais ao registrar as imagens separadas dos ciclos IF e ISH em um só. Esse protocolo é mais adequado para estudos que exigem análise espacial simultânea da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos, especialmente quando a disponibilidade de tecidos é limitada ou quando a preservação da arquitetura espacial é crítica, como em análise de microambientes tumorais ou estudos de perfilamento imunológico.

Utilizando reagentes amplamente disponíveis e compatível com a maioria das plataformas de imagem, o Bex-Plex pode ser realizado por qualquer pesquisador tecnicamente treinado, familiarizado com imagens fluorescentes e com acesso a um microscópio convencional. O protocolo apresentado aqui é otimizado para amostras congeladas fixas. Atualmente, o protocolo foi validado em tecidos congelados fixos, e uma otimização adicional pode ser necessária para aplicação em outros tipos de amostras, como FFPE ou amostras clínicas humanas.

Esse fluxo de trabalho será inestimável em qualquer contexto onde o tecido seja limitado ou precioso, como biópsias de tecidos ou experimentos com animais com amostra limitada, assim como para a fenotipagem de células que podem ser difíceis de extrair usando técnicas dissociativas. O Bex-Plex fornece informações simultâneas e quantificáveis sobre os perfis transcricional e translacional de células individuais, mantendo seu contexto espacial, dados que estão especialmente preparados para responder perguntas sobre as relações e a intercomunicação entre células em seu ambiente original.

Protocolo

Os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade da Califórnia, San Diego (número de protocolo S24049). Foram usados camundongos machos e fêmeas de 7 a 12 semanas de idade com base genética C57BL/6 e alojados sob condições específicas livres de patógenos para esses experimentos.

1. Preparação de tecidos

1. Eutanasiar camundongos experimentais por meio de medidas primárias e secundárias aprovadas (por exemplo, eutanásia de CO₂ e luxação cervical) e colher tecidos de interesse em meios suplementados.
2. Prepare um novo estoque de fixador de tecido diluindo uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% para 0,5% ou 1% de PFA em 1X PBS. Use 0,5% de PFA para tecidos de menor volume, como linfonodos, e 1% de PFA para tecidos de maior volume, como tumores.
   ATENÇÃO: O paraformaldeído é inflamável e tóxico se ingerido ou engolido. Manuseie com o EPI adequado e evite contato com pele ou olhos.
3. Transfira os tecidos para uma placa de 24 poços com fixador de 2 mL por poço e incube durante a noite a 4°C.
   Nota: Tempos de incubação superiores a 16 horas podem levar a problemas de superfixação.
4. Encha os poços de uma nova placa de 24 poços com 1X PBS e transfira os tecidos da placa fixadora.
   Ponto de pausa: Se necessário, os tecidos podem ser armazenados em 1X PBS a 4°C por até 7 dias.
5. Corte o excesso de gordura/detritos dos tecidos um de cada vez usando um telescópio e ferramentas. Adicione um pequeno volume de 1X PBS diretamente ao tecido para evitar desidratação durante o aparamento.
6. Prepare uma solução de sacarose a 30% de pó/v diluindo caldo de sacarose em pó em 1X PBS.
7. Transfira os tecidos para uma placa de 24 poços com 2 mL de sacarose a 30% por poço e incube durante a noite a 4°C para desidratar. Os tecidos estão adequadamente desidratados quando afundam no fundo dos poços.
8. Preencha criomoldes rotulados com OCT e coloque os tecidos um de cada vez nos moldes. A orientação do tecido dependerá da origem, mas nossa recomendação padrão seria que a maior área de superfície fique paralela ao fundo do criomold. Certifique-se de que os tecidos estejam completamente submersos no OCT.
9. Coloque sobre gelo seco por 10 minutos para congelar e armazenar a -80°C.

2. Corte de tecidos

Nota: Todos os reagentes e materiais de laboratório usados para este protocolo devem ser livres de RNase. Tenha cuidado para evitar contaminação ao manusear os lâminos.

1. Recubra as lâminas de microscópio sem RNase com 15 μL de adesivo de alúmen cromado e incube por 1 hora a 60°C em um forno. Slides revestidos com alúmen cromado podem ser armazenados em temperatura ambiente (RT) por até um mês antes do uso.
2. Retire os tecidos embutidos com OCT do freezer a -80°C e coloque-o em um criostato/criotoma a -20°C para equilibrar por pelo menos 20 minutos.
3. Seccione tecidos sobre lâminas revestidas com alúmen cromado com espessura de 10–15 μm.
4. Armazene lâminas com seções cortadas a 4°C ou, se tingidas no mesmo dia, deixe as lâminas se equilibrarem com RT. Lâminas seccionadas podem ser armazenadas a 4°C por até 5 dias antes do uso.

3. Coloração de proteínas

1. Em um tanque de mergulho, deixe a lâmina de molho para ser tingida em PBS 1X sem RNase por 5 minutos para remover o excesso de OCT dos tecidos.
2. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar caixas ao redor dos lenços no ferrolho e deixe secar por 2 minutos.
3. Prepare uma solução bloqueante de bloqueio do receptor FC anti-camundongo 10 μg·mL⁻¹ em PBS 1X livre de RNase. Adicione o tampão de bloqueio às amostras na lâmina, usando o suficiente para criar uma bolha que cubra completamente o tecido (100–150 μL·^seção-1).
   Nota: Às vezes, a adição de FBS ou BSA (tipicamente 1–2%) ao buffer de bloqueio é necessária para tecidos e/ou marcadores difíceis.
4. Incube as lâminas em RT em uma caixa úmida de coloração por 1 hora, depois lave submergindo-as completamente em um tanque de mergulho cheio de PBS 1X sem RNase por 5 minutos.
5. Prepare a solução primária de coloração de anticorpos em PBS 1X livre de RNase, planejando 100-200 μL por seção de tecido. Diluições padrão de anticorpos variam de 1:50 a 1:200, mas recomenda-se realizar titulações de uma única coloração para identificar o melhor fator de diluição para um determinado anticorpo e/ou tipo de tecido. Vórtices e pulsos giram os anticorpos antes de pipetar para evitar agregados fluorescentes.
6. Retire as lâminas da lavagem e esvaie suavemente o excesso de líquido do canto das caixas de amostra usando um lenço absorvente para evitar diluir a solução de anticorpos.
7. Aplique a solução de anticorpos da mesma forma que a solução bloqueante, formando uma bolha sobre o tecido.
8. Coloque as lâminas horizontalmente em um forno a 37°C e incube por 1 hora. Alternativamente, o Incubate desliza em RT por 3–4 horas em uma caixa úmida. Protocolos padrão de FI já otimizados para o tecido desejado podem ser utilizados. Mantenha lâminas em um ambiente úmido durante a incubação para evitar a desidratação. (por exemplo, use uma toalha de papel úmida no fundo da bandeja de tingimento).
9. Lave as lâminas submergindo em PBS 1X sem RNase por 2 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens. Se necessário para seu painel de coloração, prepare uma solução secundária de anticorpos em PBS 1X sem RNase durante esse período. As diluições padrão de anticorpos variam de 1:500 a 1:1000, mas recomenda-se realizar titulações de coloração única para identificar o melhor fator de diluição para um determinado anticorpo e/ou tipo de tecido.
10. Retire qualquer excesso de PBS das lâminas com uma lâmina absorvente e adicione 100–200 μL de solução secundária de coloração de anticorpos em cada seção de tecido. Coloque as lâminas horizontalmente em um forno a 37°C e incube por 30 minutos. Alternativamente, os slides podem ser tingidos em RT por 1–2 horas em uma caixa úmida.
11. Lave as lâminas submergindo em 1X PBS sem RNase por 2 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
12. Dilua o corante nuclear DAPI até uma concentração final de 0,2 μg·mL⁻¹ em PBS 1X livre de RNase e adicione 100–200 μL a cada seção de tecido.
13. Incube os slides por 10 minutos em RT em uma caixa úmida, depois lave uma vez submergindo em PBS 1X sem RNase e mergulhando brevemente para cima e para baixo.
14. Retire o excesso de líquido das lâminas com uma limpeza absorvente e adicione 20–30 μL de meio de montagem antifade com base aquosa em cada seção. Coloque cuidadosamente uma capa de cobertura no lâmina, minimizando as bolhas, e deixe o meio de montagem curar por 15–30 minutos.
15. Imagine os slides manchados. Para uma explicação mais detalhada das considerações de design de painéis e aquisição de imagem para IBEX, veja os protocolos IBEX originais^{publicados 12,13}.
    Ponto de pausa: Armazene as lâminas montadas no escuro a 4°C por até 3 dias, embora recomendemos proceder imediatamente para garantir a mínima degradação do RNA.

4. Branqueamento por fluoróforo e coloração iterativa de proteínas

1. Submerga os slides em PBS 1X sem RNase até que a cobertura deslize facilmente sem aplicar força. Dependendo de quanto tempo a cobertura está montada, isso pode levar até 16 horas.
2. Enquanto as lâminas estão de molho, prepare uma solução de LiBH₄ de 1 mg·mL^⁻1 em DI H₂O livre de RNase, misturando suavemente até que esteja totalmente dissolvido e espere 10 minutos para ativar. A ativação ocorreu quando bolhas estão presentes na solução e a atividade dura até 4 horas.
   Cuidado: LiBH₄ é reativo à água, evite exposição excessiva de material em pó à umidade e descarte os resíduos adequadamente de acordo.
3. Lave as lâminas uma vez por 2 minutos em PBS 1X sem RNase para remover qualquer resíduo de meio de montagem, depois pipete 100–150 μL da solução_{LiBH 4} em cada tecido. Incube em uma caixa úmida por 15 minutos.
   Nota: Dependendo dos fluoróforos usados para a coloração, esse tempo de incubação pode precisar ser alongado (discutido detalhadamente nos artigos sobre métodos IBEX^)12,13.
4. Lave as lâminas uma vez submergindo em PBS 1X sem RNase e mergulhando para cima e para baixo brevemente.
5. Prossiga para colorir as lâminas com marcadores proteicos adicionais seguindo os passos 3.5-3.15. Não é necessário re-tingir o corante nuclear porque ele não descolore com_{LiBH 4}. Repita a coloração de proteínas, se necessário.
   Ponto de pausa: As lâminas montadas podem ser armazenadas a 4°C durante a noite antes de branquear o último ciclo de proteína/IBEX e prosseguir para o RNA.
6. Imediatamente prossiga para o RNAscope HiPlex após descolorir os fluoróforos do ciclo final. Embora até seis ciclos de IBEX padrão tenham sido realizados sem perda de tecido ou epítopo, não recomendamos exceder três ciclos de coloração proteica para esse protocolo devido ao potencial de diminuição da qualidade dos transcritos de RNA ao longo de períodos mais longos.

5. Preparação de lâmina para RNAscope HiPlex

1. Submerga completamente as lâminas em PBS 1X sem RNase até que o cobertor deslize facilmente sem aplicar força. Dependendo de quanto tempo a cobertura está montada, isso pode levar até 16 horas. Lave uma vez por 2 minutos em 1X PBS sem RNase para remover qualquer resíduo de meio de montagem.
2. Prepare 200 mL de 50% de etanol, 200 mL de 70% de etanol e 400 mL de 100% de etanol.
3. Ligue um forno de hibridização e ajuste para 60°C. Dilua o Reagente de Recuperação de Alvos 10X em um estoque de trabalho 1X em DI_{H 2O}livre de RNase e pré-aqueça colocando-o no forno até a etapa 5.8.
   Nota: A falha em pré-aquecer o reagente de recuperação do alvo a 60°C afetará o registro posterior das imagens dos ciclos separados. O reagente de recuperação do alvo deve permanecer a 60°C durante toda a etapa de recuperação.
4. Imerga os slides em 50% de etanol. Incubar por 5 minutos no tempo de descanso.
5. Remova os slides do etanol 50% e imerga em etanol 70%. Incubar por 5 minutos no tempo de descanso.
6. Remova as lâminas do etanol 70% e imerga em etanol 100%. Incube por 5 minutos em tempo de descanso e repita com etanol fresco 100%.
7. Retire os lâminas do etanol 100% e deixe secar em RT por 5 minutos.
8. Adicione 100–150 μL do Reagente de Recuperação de Alvo 1X a 60°C em cada seção de tecido e coloque as lâminas no forno de hibridização. Incube a 60°C por 1 hora.
9. Remova as lâminas e enxágue mergulhando em DI H2O sem RNase por 15 segundos. Nesse momento, ajuste a temperatura definida no forno para 40°C.
10. Transfira as lâminas para 100% etanol e incube por 5 minutos, depois seque em RT por pelo menos 5 minutos.
11. Aplique Protease III nas lâminas, 1–2 gotas por seção de tecido. Coloque os lâminas no forno de hibridização e incube a 40°C por 30 minutos.
12. Submerga as lâminas em DI H_2Osem RNase e lave mergulhando brevemente para cima e para baixo. Repita com água destilada fresca para um total de 2 lavagens.

6. Preparação do reagente RNAscope e hibridização com sonda

1. Prepare as coronhas da sonda RNAscope HiPlex e o diluente da sonda HiPlex, aquecendo-as a 40°C por 10 minutos em forno ou banho-maria.
2. Brevemente faça pulso de spin para todas as ações de sonda 50X. Prepare uma mistura funcional de sonda diluindo cada sonda alvo única a 1X com o Diluente de Sonda RNAscopo. Planeje usar 50–100 μL de mistura de sonda por tecido e misturá-la bem por meio de vórtice antes do uso. O protocolo RNAscope HiPlex pode acomodar até 3 ciclos de 4 sondas (12 sondas no total, indicadas T1-12). Para orientações sobre o projeto da sonda, consulte o protocolo original publicado^{no RNAscope 14}.
3. Coloque os reagentes RNAscope HiPlex Amp 1–3 e HiPlex Fluoro T1-T4 em RT para equilibrar.
4. Pegue as lâminas tratadas com protease III e pipete 50–100 μL da mistura da sonda em cada seção de tecido. Coloque horizontalmente no forno de hibridização e incube por 2 horas a 40°C.
5. Lave os slides submergindo completamente em um buffer de lavagem 1X por 2 minutos. Repita com um tampão fresco para um total de 2 lavagens.
   Ponto de pausa: As lâminas podem ser armazenadas em buffer SSC 5X no RT durante a noite, conforme descrito no protocolo RNAscope do ACD. Se esse ponto de pausa for usado, note que duas lavagens de 2 minutos em buffer de lavagem 1X serão necessárias na manhã seguinte.

7. Amplificação da sonda

Nota: Certifique-se de que todos os reagentes estejam equilibrados a RT antes de aplicar em slides.

1. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Amp1 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
2. Adicione 1 a 2 gotas do reagente HiPlex Amp2 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
3. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Amp3 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
4. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Fluoro T1-T4 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 15 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
5. Adicione 3–4 gotas do reagente HiPlex DAPI em cada seção de tecido e incube por 1 minuto em RT.
6. Remova o DAPI retirando o líquido das lâminas com um lenço absorvente. Adicione imediatamente 100 μL de meio de montagem antidescolorido com base aquosa (pode ser o mesmo usado durante as etapas de coloração IBEX) a cada seção. Coloque cuidadosamente uma cobertura no ferrolho, minimizando as bolhas, e deixe o meio de montagem secar por 15–30 minutos.
7. Prossiga para a imagem de imagem.
   Ponto de pausa: As lâminas montadas podem ser armazenadas no escuro a 4°C por até 3 dias, embora recomendemos agir rapidamente para garantir a mínima degradação do RNA.

8. Clivagem dos fluoróforos e hibridização iterativa de RNA

1. Para remover os deslizamentos de cobertura dos slides, deixe de molho em buffer 4X SSC por pelo menos 30 minutos no RT. Lave uma vez submergindo completamente os slides em buffer 4X SSC novo e mergulhando brevemente para cima e para baixo.
2. Abra uma ampola nova de solução de corte e faça um estoque funcional de 10% diluindo com 4X SSC buffer.
3. Coloque as lâminas em uma caixa úmida e adicione 3 a 4 gotas da solução de 10% para clivar. Incube em RT por 15 minutos, depois lave as lâminas submergindo completamente em PBST 0,5% por 2 minutos. Repita com PBST fresco para um total de 2 lavagens.
4. Para prosseguir com o ciclo de imagem 2 do painel de RNAscópio, equilibre o reagente HiPlex Fluoro T5-T8 com RT.
5. Ligue o forno de hibridização e ajuste a temperatura para 40°C.
6. Adicione o reagente HiPlex Fluoro T5-T8 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 15 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
7. Cuidadosamente esvaie o excesso de líquido das lâminas. Adicione imediatamente 100 μL de meio de montagem em cada seção e coloque cuidadosamente um revestimento no ferrolho. Deixe o meio de montagem secar por 15–30 minutos e depois prossiga para a imagem.
8. Repita os passos 8.1–8.7 com o reagente HiPlex Fluoro T9-T12 por um total de 3 ciclos de RNAscópio, se apropriado. Note que, embora 3 ciclos sejam possíveis com o protocolo RNAscope HiPlex, o tempo adicional necessário para a coloração de proteínas com esse protocolo pode afetar a qualidade do RNA. Portanto, 3 ciclos podem nem sempre ser viáveis, dependendo dos históricos específicos que estão sendo alvoados.

9. Processamento de imagem

1. Processe individualmente os arquivos raw de cada rodada e realize o processamento de imagem usando parâmetros consistentes, incluindo configurações de subtração de fundo, filtros de suavização e tipo de transformação de registro. Os canais devem ser nomeados com um caractere separador consistente (por exemplo, Ciclo 1: CD45 AF532, onde ":" faz a distinção entre ciclo e marcador/fluor).
2. Inicie o software SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) e clique nas extensões Imaris > SimpleITK > registro afim da pilha z usando canal comum.
3. Faça upload de um arquivo de imagem de cada ciclo multiplex e insira o caractere separador para todos os canais nomeados (por exemplo, ":").
4. Selecione o canal a ser usado para o registro de imagens e a imagem fixa à qual todas as outras imagens serão alinhadas. Recomenda-se usar DAPI como marcador fiducial, embora qualquer canal nomeado comum entre todos os ciclos possa ser utilizado.
5. Clique em "Registrar" e depois em "Reamostrar e salvar a imagem combinada".
6. Prossiga para a análise posterior com o software que você preferir. Para mais informações sobre processamento e registro de imagens, consulte o protocolo original^{IBEX 12,13}.

Resultados

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do Bex-Plex.
Tecidos congelados fixos seccionados em lâminas revestidas com alúmen cromado passam por até 3 ciclos de IBEX padrão, seguidos de até três ciclos de RNAScope HiPlex, nos quais a etapa inicial de recuperação do alvo é realizada a 60°C por 1 hora. Imagens de ciclos separados são então registradas e alinhadas usando um marcador fidu...

Discussão

O fluxo de trabalho Bex-Plex integra a plataforma iterativa de coloração proteica, IBEX, com hibridização in situ por RNAscope para permitir a detecção simultânea de proteínas e transcritos de RNA em resolução de célula única. O objetivo principal deste protocolo é fornecer um método reprodutível para análise espacial integrada da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos. A capacidade de medir tanto a expressão de proteínas quanto de RNA no mesmo tecido já apresentou des...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeabilization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retrieval reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023