O Bex-plex permite visualização simultânea de marcadores proteicos e transcritos de ácidos ribonucleicos para perfilamento espacial profundo de tecido intacto

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para combinar coloração iterativa de proteínas (IBEX) com tecnologia de hibridização in situ por RNAscope para a fenotipagem espacial profunda de tecidos fixos congelados intactos para aplicações de perfil espacial de alta resolução.

Abstract

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o perfilamento espacial simultâneo de marcadores de proteínas e ácidos ribonucleicos (RNA) com resolução de célula única em tecidos intactos. Uma das questões centrais em torno dos cânceres de tumores sólidos é a incapacidade de prever a resposta do paciente à intervenção terapêutica. Decifrar essas complexidades requer medição quantitativa dos comportamentos celulares, interações e fenótipos dentro dos tecidos intactos. Especificamente, o proteoma e o transcriptoma fornecem informações sobrepostas, porém não redundantes, que podem ser críticas para o desenvolvimento de imunoterapias racionais. No entanto, atualmente não existe uma maneira simples e econômica de perfilar profundamente tanto o estado transcricional quanto o funcional de todas as células no microambiente tumoral, mantendo suas informações críticas de localização espacial. Para isso, combinamos com sucesso a plataforma IBEX (branqueamento iterativo estende a multiplexidade) com o HiPlex RNAscope para visualizar simultaneamente marcadores proteicos de alto plex e transcritos de ácido ribonucleico (RNA) de alto plex com resolução de célula única. Essa abordagem incorpora uma etapa modificada de recuperação de alvos de RNA para preservar a morfologia nuclear e permitir o alinhamento preciso da imagem entre os ciclos. "Bex-Plex" nos permite realizar um protocolo IBEX não modificado em tecidos congelados fixos, seguido pelo protocolo HiPlex RNAscope, no qual utilizamos a recuperação de alvo de RNA modificado para garantir alinhamento em nível nuclear com os ciclos IBEX. Este protocolo é otimizado para tecidos congelados fixos e permite a análise espacial integrada dos estados celulares transcricionais e funcionais. O poder de perfilar nesse nível de célula única não apenas fornece um profundo poço de informações sobre o próprio tecido, mas também pode possibilitar previsões sobre as interações celulares complexas que impulsionam a resposta terapêutica, fornecendo uma estrutura para estudar a biologia espacial em microambientes tumorais e sistemas relacionados.

Introduction

Desde sua introdução em 2011, imunoterapias contra o câncer que diminuem a supressão de células T citotóxicas ao bloquear moléculas inibitórias de checkpoint imunológico, como PDL-1 e CTLA-4, emergiram como o padrão ouro para o tratamento de tumores^{sólidos 1}. No entanto, apesar do uso em larga escala em pacientes, a eficácia clínica desses medicamentos varia amplamente porque muitos cânceres tumorais sólidos apresentam intrinsecamente ou eventualmente geram resistência a essas^{terapias 2}. Em muitos casos, isso se deve à natureza extremamente heterogênea dos tumores sólidos, mesmo entre o mesmo tipo^{de câncer 3}. Um entendimento mais aprofundado das relações celulares que ocorrem em tumores sólidos é fundamental para gerar melhores modalidades de tratamento. Assim, identificar os mecanismos exatos e as interações que sustentam e sustentam essa resistência está na vanguarda da pesquisa sobre câncer. Aqui, pretendemos desenvolver um método que permita a análise espacial integrada da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos para melhor caracterizar essas complexas interações celulares.

O microambiente tumoral (TME) é composto pelos componentes celulares e estruturais não cancerosos que moldam o crescimento tumoral e a resposta imunológica, incluindo fibroblastos associados ao câncer, células imunes infiltrantes, componentes vasculares e a matriz^{extracelular 4}. Recentemente, tornou-se evidente que a composição e organização da TME influenciam fortemente se os tumores são permissivos ou resistentes à infiltração imunológica, um dos principais fatores que ditam a resposta à^{imunoterapia 5}. Em muitos cânceres, um fenótipo de "deserto imunológico", caracterizado por baixo número de células T e presença de populações mieloides altamente imunossupressoras, correlaciona-se com baixa resposta às terapias de bloqueio^{por checkpoint 6,7}. A sinalização quimioquina governa muitas dessas dinâmicas de recrutamento. Por exemplo, CXCL1 e CCL2 atraem células mieloides imunossupressoras, enquanto o eixo CXCR3-CXCL9/CXCl10 recruta tanto células T citotóxicas quanto reguladoras no tumor⁸. Consequentemente, o ambiente de sinalização específico de nicho pode influenciar fortemente o fenótipo e a função celular. Por exemplo, em pacientes com câncer colorretal, o eixo CCL5-CCR5 controla a função supressora dos macrófagos associados a tumores (TAMs) e bloquear esse sinal distorce a TAM em direção a um fenótipo antitumorigênico e se correlaciona com respostas clínicas^{melhoradas 9}. Além disso, interações diretas entre células imunes, fibroblastos associados ao câncer e/ou células tumorais via ICAM e PDL-1 podem induzir exaustão imunológica e imunidade antitumoral¹⁰. Juntos, esses achados ressaltam a importância das análises espacialmente resolvidas para entender como a TME influencia a eficácia terapêutica.

A imagem imunofluorescente (FI) continua sendo uma abordagem fundamental para visualizar a expressão proteica e as interações célula-célula nos tecidos. O campo avançou de fluxos de trabalho convencionais de 3-4 cores para fluxos de trabalho de imagem de alto conteúdo que dependem de coloração iterativa e imagem. Nesses métodos, grandes conjuntos de dados são gerados por meio de ciclos repetidos de marcação de anticorpos, imagens e inativação ou remoção de fluoróforos, permitindo que marcadores adicionais possam ser corados e visualizados¹¹. A Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) foi recentemente introduzida como uma plataforma de imagem iterativa amigável e econômica¹². Compatível com o uso de anticorpos comerciais e microscópios convencionais, o IBEX utiliza borohidreto de lítio (_{LiBH 4}) para extinguir a fluorescência dos corantes mais comumente usados sem danificar os epítopos teciduais, permitindo a aquisição de até 75 parâmetros para um único^{tecido 13}. As imagens obtidas a partir dessa coloração cíclica são alinhadas usando o software open-source SimpleITK para produzir conjuntos de dados compostos adequados para análises espaciais de alta dimensão.

Complementarmente à fenotipagem em nível de proteína, os métodos transcriptômicos espaciais podem fornecer informações valiosas sobre o estado transcricional das células em seu ambiente nativo. Notavelmente, a hibridização in situ (ISH) é uma técnica popular para identificar a localização de sequências de DNA ou RNA em um tecido^{específico 11}. RNAscope é uma abordagem ISH bem estabelecida que utiliza sondas com uma química Z única para amplificar especificamente transcritos de RNA com resolução de molécula única e é compatível com muitos tipos diferentes^{de amostras 14}. Como uma plataforma amplamente adotada e comercialmente disponível por meio do Advanced Cell Diagnostics (ACD), o RNAscope oferece sondas validadas contra uma grande variedade de alvos, simplificando o desenho experimental para diversas aplicações.

Uma visão mais completa da identidade e das funções celulares pode ser obtida combinando a detecção de proteínas e RNA dentro do mesmo tecido. Proteínas secretadas de curta duração, como citocinas e quimiocinas, tradicionalmente não possuem coloração confiável de anticorpos pelo IHC, mas informações sobre sua expressão podem ser obtidas por meio da quantificação de seus transcritos de mRNA. Tentativas anteriores de co-detectar RNA e proteína, como o IHC cromogênico convencional ou o TSA-OPAL, foram limitadas por amplificação não linear do sinal e protocolos demorados de recuperação^{de antígenos 15}. Comparado a essas abordagens, o método Bex-Plex permite a detecção simultânea de proteínas e RNA de alto plex, preservando o contexto espacial e a morfologia nuclear para registro preciso da imagem.

Aqui apresentamos o "Bex-Plex", um protocolo que integra as plataformas IBEX e RNAscope para caracterização simultânea e quantificável dos estados transcricionais e translacionais das células em seus tecidos nativos. No Bex-Plex, tecidos embutidos com OCT fixo passam pelo protocolo padrão IBEX, seguido por um fluxo de trabalho RNAscope HiPlex ligeiramente modificado, no qual a recuperação do alvo é realizada a 60°C com um tempo de incubação de 1 hora, em comparação com a incubação original de 99°C por 5 minutos. Isso preserva a arquitetura dos núcleos, permitindo um alinhamento preciso dos marcadores fiduciais ao registrar as imagens separadas dos ciclos IF e ISH em um só. Esse protocolo é mais adequado para estudos que exigem análise espacial simultânea da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos, especialmente quando a disponibilidade de tecidos é limitada ou quando a preservação da arquitetura espacial é crítica, como em análise de microambientes tumorais ou estudos de perfilamento imunológico.

Utilizando reagentes amplamente disponíveis e compatível com a maioria das plataformas de imagem, o Bex-Plex pode ser realizado por qualquer pesquisador tecnicamente treinado, familiarizado com imagens fluorescentes e com acesso a um microscópio convencional. O protocolo apresentado aqui é otimizado para amostras congeladas fixas. Atualmente, o protocolo foi validado em tecidos congelados fixos, e uma otimização adicional pode ser necessária para aplicação em outros tipos de amostras, como FFPE ou amostras clínicas humanas.

Esse fluxo de trabalho será inestimável em qualquer contexto onde o tecido seja limitado ou precioso, como biópsias de tecidos ou experimentos com animais com amostra limitada, assim como para a fenotipagem de células que podem ser difíceis de extrair usando técnicas dissociativas. O Bex-Plex fornece informações simultâneas e quantificáveis sobre os perfis transcricional e translacional de células individuais, mantendo seu contexto espacial, dados que estão especialmente preparados para responder perguntas sobre as relações e a intercomunicação entre células em seu ambiente original.

Protocol

Os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade da Califórnia, San Diego (número de protocolo S24049). Foram usados camundongos machos e fêmeas de 7 a 12 semanas de idade com base genética C57BL/6 e alojados sob condições específicas livres de patógenos para esses experimentos.

1. Preparação de tecidos

1. Eutanasiar camundongos experimentais por meio de medidas primárias e secundárias aprovadas (por exemplo, eutanásia de CO₂ e luxação cervical) e colher tecidos de interesse em meios suplementados.
2. Prepare um novo estoque de fixador de tecido diluindo uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% para 0,5% ou 1% de PFA em 1X PBS. Use 0,5% de PFA para tecidos de menor volume, como linfonodos, e 1% de PFA para tecidos de maior volume, como tumores.
   ATENÇÃO: O paraformaldeído é inflamável e tóxico se ingerido ou engolido. Manuseie com o EPI adequado e evite contato com pele ou olhos.
3. Transfira os tecidos para uma placa de 24 poços com fixador de 2 mL por poço e incube durante a noite a 4°C.
   Nota: Tempos de incubação superiores a 16 horas podem levar a problemas de superfixação.
4. Encha os poços de uma nova placa de 24 poços com 1X PBS e transfira os tecidos da placa fixadora.
   Ponto de pausa: Se necessário, os tecidos podem ser armazenados em 1X PBS a 4°C por até 7 dias.
5. Corte o excesso de gordura/detritos dos tecidos um de cada vez usando um telescópio e ferramentas. Adicione um pequeno volume de 1X PBS diretamente ao tecido para evitar desidratação durante o aparamento.
6. Prepare uma solução de sacarose a 30% de pó/v diluindo caldo de sacarose em pó em 1X PBS.
7. Transfira os tecidos para uma placa de 24 poços com 2 mL de sacarose a 30% por poço e incube durante a noite a 4°C para desidratar. Os tecidos estão adequadamente desidratados quando afundam no fundo dos poços.
8. Preencha criomoldes rotulados com OCT e coloque os tecidos um de cada vez nos moldes. A orientação do tecido dependerá da origem, mas nossa recomendação padrão seria que a maior área de superfície fique paralela ao fundo do criomold. Certifique-se de que os tecidos estejam completamente submersos no OCT.
9. Coloque sobre gelo seco por 10 minutos para congelar e armazenar a -80°C.

2. Corte de tecidos

Nota: Todos os reagentes e materiais de laboratório usados para este protocolo devem ser livres de RNase. Tenha cuidado para evitar contaminação ao manusear os lâminos.

1. Recubra as lâminas de microscópio sem RNase com 15 μL de adesivo de alúmen cromado e incube por 1 hora a 60°C em um forno. Slides revestidos com alúmen cromado podem ser armazenados em temperatura ambiente (RT) por até um mês antes do uso.
2. Retire os tecidos embutidos com OCT do freezer a -80°C e coloque-o em um criostato/criotoma a -20°C para equilibrar por pelo menos 20 minutos.
3. Seccione tecidos sobre lâminas revestidas com alúmen cromado com espessura de 10–15 μm.
4. Armazene lâminas com seções cortadas a 4°C ou, se tingidas no mesmo dia, deixe as lâminas se equilibrarem com RT. Lâminas seccionadas podem ser armazenadas a 4°C por até 5 dias antes do uso.

3. Coloração de proteínas

1. Em um tanque de mergulho, deixe a lâmina de molho para ser tingida em PBS 1X sem RNase por 5 minutos para remover o excesso de OCT dos tecidos.
2. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar caixas ao redor dos lenços no ferrolho e deixe secar por 2 minutos.
3. Prepare uma solução bloqueante de bloqueio do receptor FC anti-camundongo 10 μg·mL⁻¹ em PBS 1X livre de RNase. Adicione o tampão de bloqueio às amostras na lâmina, usando o suficiente para criar uma bolha que cubra completamente o tecido (100–150 μL·^seção-1).
   Nota: Às vezes, a adição de FBS ou BSA (tipicamente 1–2%) ao buffer de bloqueio é necessária para tecidos e/ou marcadores difíceis.
4. Incube as lâminas em RT em uma caixa úmida de coloração por 1 hora, depois lave submergindo-as completamente em um tanque de mergulho cheio de PBS 1X sem RNase por 5 minutos.
5. Prepare a solução primária de coloração de anticorpos em PBS 1X livre de RNase, planejando 100-200 μL por seção de tecido. Diluições padrão de anticorpos variam de 1:50 a 1:200, mas recomenda-se realizar titulações de uma única coloração para identificar o melhor fator de diluição para um determinado anticorpo e/ou tipo de tecido. Vórtices e pulsos giram os anticorpos antes de pipetar para evitar agregados fluorescentes.
6. Retire as lâminas da lavagem e esvaie suavemente o excesso de líquido do canto das caixas de amostra usando um lenço absorvente para evitar diluir a solução de anticorpos.
7. Aplique a solução de anticorpos da mesma forma que a solução bloqueante, formando uma bolha sobre o tecido.
8. Coloque as lâminas horizontalmente em um forno a 37°C e incube por 1 hora. Alternativamente, o Incubate desliza em RT por 3–4 horas em uma caixa úmida. Protocolos padrão de FI já otimizados para o tecido desejado podem ser utilizados. Mantenha lâminas em um ambiente úmido durante a incubação para evitar a desidratação. (por exemplo, use uma toalha de papel úmida no fundo da bandeja de tingimento).
9. Lave as lâminas submergindo em PBS 1X sem RNase por 2 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens. Se necessário para seu painel de coloração, prepare uma solução secundária de anticorpos em PBS 1X sem RNase durante esse período. As diluições padrão de anticorpos variam de 1:500 a 1:1000, mas recomenda-se realizar titulações de coloração única para identificar o melhor fator de diluição para um determinado anticorpo e/ou tipo de tecido.
10. Retire qualquer excesso de PBS das lâminas com uma lâmina absorvente e adicione 100–200 μL de solução secundária de coloração de anticorpos em cada seção de tecido. Coloque as lâminas horizontalmente em um forno a 37°C e incube por 30 minutos. Alternativamente, os slides podem ser tingidos em RT por 1–2 horas em uma caixa úmida.
11. Lave as lâminas submergindo em 1X PBS sem RNase por 2 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
12. Dilua o corante nuclear DAPI até uma concentração final de 0,2 μg·mL⁻¹ em PBS 1X livre de RNase e adicione 100–200 μL a cada seção de tecido.
13. Incube os slides por 10 minutos em RT em uma caixa úmida, depois lave uma vez submergindo em PBS 1X sem RNase e mergulhando brevemente para cima e para baixo.
14. Retire o excesso de líquido das lâminas com uma limpeza absorvente e adicione 20–30 μL de meio de montagem antifade com base aquosa em cada seção. Coloque cuidadosamente uma capa de cobertura no lâmina, minimizando as bolhas, e deixe o meio de montagem curar por 15–30 minutos.
15. Imagine os slides manchados. Para uma explicação mais detalhada das considerações de design de painéis e aquisição de imagem para IBEX, veja os protocolos IBEX originais^{publicados 12,13}.
    Ponto de pausa: Armazene as lâminas montadas no escuro a 4°C por até 3 dias, embora recomendemos proceder imediatamente para garantir a mínima degradação do RNA.

4. Branqueamento por fluoróforo e coloração iterativa de proteínas

1. Submerga os slides em PBS 1X sem RNase até que a cobertura deslize facilmente sem aplicar força. Dependendo de quanto tempo a cobertura está montada, isso pode levar até 16 horas.
2. Enquanto as lâminas estão de molho, prepare uma solução de LiBH₄ de 1 mg·mL^⁻1 em DI H₂O livre de RNase, misturando suavemente até que esteja totalmente dissolvido e espere 10 minutos para ativar. A ativação ocorreu quando bolhas estão presentes na solução e a atividade dura até 4 horas.
   Cuidado: LiBH₄ é reativo à água, evite exposição excessiva de material em pó à umidade e descarte os resíduos adequadamente de acordo.
3. Lave as lâminas uma vez por 2 minutos em PBS 1X sem RNase para remover qualquer resíduo de meio de montagem, depois pipete 100–150 μL da solução_{LiBH 4} em cada tecido. Incube em uma caixa úmida por 15 minutos.
   Nota: Dependendo dos fluoróforos usados para a coloração, esse tempo de incubação pode precisar ser alongado (discutido detalhadamente nos artigos sobre métodos IBEX^)12,13.
4. Lave as lâminas uma vez submergindo em PBS 1X sem RNase e mergulhando para cima e para baixo brevemente.
5. Prossiga para colorir as lâminas com marcadores proteicos adicionais seguindo os passos 3.5-3.15. Não é necessário re-tingir o corante nuclear porque ele não descolore com_{LiBH 4}. Repita a coloração de proteínas, se necessário.
   Ponto de pausa: As lâminas montadas podem ser armazenadas a 4°C durante a noite antes de branquear o último ciclo de proteína/IBEX e prosseguir para o RNA.
6. Imediatamente prossiga para o RNAscope HiPlex após descolorir os fluoróforos do ciclo final. Embora até seis ciclos de IBEX padrão tenham sido realizados sem perda de tecido ou epítopo, não recomendamos exceder três ciclos de coloração proteica para esse protocolo devido ao potencial de diminuição da qualidade dos transcritos de RNA ao longo de períodos mais longos.

5. Preparação de lâmina para RNAscope HiPlex

1. Submerga completamente as lâminas em PBS 1X sem RNase até que o cobertor deslize facilmente sem aplicar força. Dependendo de quanto tempo a cobertura está montada, isso pode levar até 16 horas. Lave uma vez por 2 minutos em 1X PBS sem RNase para remover qualquer resíduo de meio de montagem.
2. Prepare 200 mL de 50% de etanol, 200 mL de 70% de etanol e 400 mL de 100% de etanol.
3. Ligue um forno de hibridização e ajuste para 60°C. Dilua o Reagente de Recuperação de Alvos 10X em um estoque de trabalho 1X em DI_{H 2O}livre de RNase e pré-aqueça colocando-o no forno até a etapa 5.8.
   Nota: A falha em pré-aquecer o reagente de recuperação do alvo a 60°C afetará o registro posterior das imagens dos ciclos separados. O reagente de recuperação do alvo deve permanecer a 60°C durante toda a etapa de recuperação.
4. Imerga os slides em 50% de etanol. Incubar por 5 minutos no tempo de descanso.
5. Remova os slides do etanol 50% e imerga em etanol 70%. Incubar por 5 minutos no tempo de descanso.
6. Remova as lâminas do etanol 70% e imerga em etanol 100%. Incube por 5 minutos em tempo de descanso e repita com etanol fresco 100%.
7. Retire os lâminas do etanol 100% e deixe secar em RT por 5 minutos.
8. Adicione 100–150 μL do Reagente de Recuperação de Alvo 1X a 60°C em cada seção de tecido e coloque as lâminas no forno de hibridização. Incube a 60°C por 1 hora.
9. Remova as lâminas e enxágue mergulhando em DI H2O sem RNase por 15 segundos. Nesse momento, ajuste a temperatura definida no forno para 40°C.
10. Transfira as lâminas para 100% etanol e incube por 5 minutos, depois seque em RT por pelo menos 5 minutos.
11. Aplique Protease III nas lâminas, 1–2 gotas por seção de tecido. Coloque os lâminas no forno de hibridização e incube a 40°C por 30 minutos.
12. Submerga as lâminas em DI H_2Osem RNase e lave mergulhando brevemente para cima e para baixo. Repita com água destilada fresca para um total de 2 lavagens.

6. Preparação do reagente RNAscope e hibridização com sonda

1. Prepare as coronhas da sonda RNAscope HiPlex e o diluente da sonda HiPlex, aquecendo-as a 40°C por 10 minutos em forno ou banho-maria.
2. Brevemente faça pulso de spin para todas as ações de sonda 50X. Prepare uma mistura funcional de sonda diluindo cada sonda alvo única a 1X com o Diluente de Sonda RNAscopo. Planeje usar 50–100 μL de mistura de sonda por tecido e misturá-la bem por meio de vórtice antes do uso. O protocolo RNAscope HiPlex pode acomodar até 3 ciclos de 4 sondas (12 sondas no total, indicadas T1-12). Para orientações sobre o projeto da sonda, consulte o protocolo original publicado^{no RNAscope 14}.
3. Coloque os reagentes RNAscope HiPlex Amp 1–3 e HiPlex Fluoro T1-T4 em RT para equilibrar.
4. Pegue as lâminas tratadas com protease III e pipete 50–100 μL da mistura da sonda em cada seção de tecido. Coloque horizontalmente no forno de hibridização e incube por 2 horas a 40°C.
5. Lave os slides submergindo completamente em um buffer de lavagem 1X por 2 minutos. Repita com um tampão fresco para um total de 2 lavagens.
   Ponto de pausa: As lâminas podem ser armazenadas em buffer SSC 5X no RT durante a noite, conforme descrito no protocolo RNAscope do ACD. Se esse ponto de pausa for usado, note que duas lavagens de 2 minutos em buffer de lavagem 1X serão necessárias na manhã seguinte.

7. Amplificação da sonda

Nota: Certifique-se de que todos os reagentes estejam equilibrados a RT antes de aplicar em slides.

1. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Amp1 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
2. Adicione 1 a 2 gotas do reagente HiPlex Amp2 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
3. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Amp3 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 30 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
4. Adicione 1–2 gotas do reagente HiPlex Fluoro T1-T4 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 15 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
5. Adicione 3–4 gotas do reagente HiPlex DAPI em cada seção de tecido e incube por 1 minuto em RT.
6. Remova o DAPI retirando o líquido das lâminas com um lenço absorvente. Adicione imediatamente 100 μL de meio de montagem antidescolorido com base aquosa (pode ser o mesmo usado durante as etapas de coloração IBEX) a cada seção. Coloque cuidadosamente uma cobertura no ferrolho, minimizando as bolhas, e deixe o meio de montagem secar por 15–30 minutos.
7. Prossiga para a imagem de imagem.
   Ponto de pausa: As lâminas montadas podem ser armazenadas no escuro a 4°C por até 3 dias, embora recomendemos agir rapidamente para garantir a mínima degradação do RNA.

8. Clivagem dos fluoróforos e hibridização iterativa de RNA

1. Para remover os deslizamentos de cobertura dos slides, deixe de molho em buffer 4X SSC por pelo menos 30 minutos no RT. Lave uma vez submergindo completamente os slides em buffer 4X SSC novo e mergulhando brevemente para cima e para baixo.
2. Abra uma ampola nova de solução de corte e faça um estoque funcional de 10% diluindo com 4X SSC buffer.
3. Coloque as lâminas em uma caixa úmida e adicione 3 a 4 gotas da solução de 10% para clivar. Incube em RT por 15 minutos, depois lave as lâminas submergindo completamente em PBST 0,5% por 2 minutos. Repita com PBST fresco para um total de 2 lavagens.
4. Para prosseguir com o ciclo de imagem 2 do painel de RNAscópio, equilibre o reagente HiPlex Fluoro T5-T8 com RT.
5. Ligue o forno de hibridização e ajuste a temperatura para 40°C.
6. Adicione o reagente HiPlex Fluoro T5-T8 às lâminas e incube no forno de hibridização a 40°C por 15 minutos. Lave os slides submergindo completamente no buffer 1X Wash por 2 minutos. Repita por um total de 2 lavagens.
7. Cuidadosamente esvaie o excesso de líquido das lâminas. Adicione imediatamente 100 μL de meio de montagem em cada seção e coloque cuidadosamente um revestimento no ferrolho. Deixe o meio de montagem secar por 15–30 minutos e depois prossiga para a imagem.
8. Repita os passos 8.1–8.7 com o reagente HiPlex Fluoro T9-T12 por um total de 3 ciclos de RNAscópio, se apropriado. Note que, embora 3 ciclos sejam possíveis com o protocolo RNAscope HiPlex, o tempo adicional necessário para a coloração de proteínas com esse protocolo pode afetar a qualidade do RNA. Portanto, 3 ciclos podem nem sempre ser viáveis, dependendo dos históricos específicos que estão sendo alvoados.

9. Processamento de imagem

1. Processe individualmente os arquivos raw de cada rodada e realize o processamento de imagem usando parâmetros consistentes, incluindo configurações de subtração de fundo, filtros de suavização e tipo de transformação de registro. Os canais devem ser nomeados com um caractere separador consistente (por exemplo, Ciclo 1: CD45 AF532, onde ":" faz a distinção entre ciclo e marcador/fluor).
2. Inicie o software SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) e clique nas extensões Imaris > SimpleITK > registro afim da pilha z usando canal comum.
3. Faça upload de um arquivo de imagem de cada ciclo multiplex e insira o caractere separador para todos os canais nomeados (por exemplo, ":").
4. Selecione o canal a ser usado para o registro de imagens e a imagem fixa à qual todas as outras imagens serão alinhadas. Recomenda-se usar DAPI como marcador fiducial, embora qualquer canal nomeado comum entre todos os ciclos possa ser utilizado.
5. Clique em "Registrar" e depois em "Reamostrar e salvar a imagem combinada".
6. Prossiga para a análise posterior com o software que você preferir. Para mais informações sobre processamento e registro de imagens, consulte o protocolo original^{IBEX 12,13}.

Results

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do Bex-Plex.
Tecidos congelados fixos seccionados em lâminas revestidas com alúmen cromado passam por até 3 ciclos de IBEX padrão, seguidos de até três ciclos de RNAScope HiPlex, nos quais a etapa inicial de recuperação do alvo é realizada a 60°C por 1 hora. Imagens de ciclos separados são então registradas e alinhadas usando um marcador fiducial (por exemplo, DAPI) para criar um conjunto de dados multiplex para análise a jusante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Utilizamos o protocolo descrito acima para perfilar o microambiente tumoral (TME) de um modelo murino de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC ) (Figura 1). Uma linha tumoral isolada de Kras^LSL-G12D/+; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; Camundongos^{Rosa26 YFP/YFP} (KPCY), que desenvolvem espontaneamente câncer de pâncreas e recapitulam muitas das características-chave do PDAC humano, foram injetados subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6⁷. Camundongos portadores de tumores foram então tratados com imunoterapia combinada composta por ^anti-PD1 (i.p. 200 μg•^camundongo-1, RMP1-14) e anti-CTLA-4 (i.p., 200 μg•^camundongo-1, 9H10) administradas no dia 10 após a implantação e continuadas a cada 3 dias até o término do experimento. O anti-CD40 agonístico (i.p., 100 μg•^mouse-1, FGK45) foi administrado como dose única no dia 13 após a implantação. Juntos, chamamos isso de "FPC", como publicado anteriormente7,16. Três tumores por grupo experimental foram coletados 16 dias após a implantação e seções fixas congeladas foram montadas em lâminas revestidas com alúmen cromado para Bex-Plex.

Figura 2: Resultados representativos IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(A) A coloração combinada de IBEX e RNAscope em seções tumorais de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC ) demonstra co-detecção de alvos de proteínas e RNA e alinhamento dos canais de fluorescência. Barra de balança, 10 μm. (B) Quantificação dos compartimentos imunes das células T (CD3+ CD11b-), macrófagos (CD11b+ CD68+) e mieloides (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) com base na intensidade dos canais de marcadores proteicos. Os gráficos mostram a densidade celular média para cada tipo celular por grupo de tratamento, n=3 tumores. (C) Quantificação das células expressoras de transcritos Pdl1 e Il10 nos compartimentos imunes previamente identificados por proteínas. Os gráficos mostram a densidade celular média por grupo de tratamento, n=3 tumores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Um ciclo de coloração proteica foi realizado em três tumores tratados por FPC e três tumores tratados com isotipo para avaliar os efeitos sobre células da linhagem mieloide entre os grupos de tratamento. Sete parâmetros foram adquiridos, embora aqui nos concentremos em três marcadores de interesse: CD11b, Ly6G e CD68 (Figura 2A). Após a aquisição da imagem, os fluoróforos da coloração proteica foram branqueados e uma rodada de RNAscópio foi realizada usando sondas contra Il10 e Pdl1 (Figura 2A). As imagens separadas foram então alinhadas usando DAPI como fiduciário (Figura 2A). A intensidade média quantitativa de fluorescência de CD11b, CD68, Ly6G e CD3 revelou uma tendência para menos macrófagos e células mieloides em tumores tratados com FPC em relação aos controles (Figura 2B). Comparações quantitativas foram realizadas em todas as amostras, e os dados são apresentados como valores médios. Além disso, o número de células expressando Pdl1, Il10 ou uma combinação de ambos os transcritos nos compartimentos macrófago e mieloide apresentou tendência de queda com o tratamento FPC em comparação com os controles (Figura 2C). Esses resultados indicam uma possível redução nas populações celulares imunossupressoras após o tratamento, consistente com as respostas biológicas esperadas.

Figura 3: Otimização das condições de recuperação de alvos para preservação nuclear.
(A) Imagem representativa de um tecido após a coleta do alvo RT mostrando inchaço nuclear e morfologia indistinta. Exemplos de tamanhos nucleares são indicados por contornos amarelos. Barra de escala, 40 μm. (B) Imagem representativa de um tecido após a recuperação modificada do alvo mostrando melhora na morfologia nuclear com condições de temperatura ajustadas. Exemplos de tamanho nuclear indicados por contornos amarelos. Barra de escala, 40 μm. (C) Volume nuclear médio determinado por segmentação baseada em DAPI em tecidos que passaram por recuperação de alvo RT (não pré-aquecida), recuperação de alvo pré-aquecido a 60°C, ou sob condições padrão de FI sem recuperação de alvo. Barras de gráfico indicam média e barras de erro mostram desvio padrão. P < 0,0001 por ANOVA unidirecional comum (asteriscos indicam limiar de significância estatística); n= 1639 células por condição. (D) Mapas de calor que representam as pontuações de correlação entre três imagens antes e depois do alinhamento da imagem. As pontuações de correlação são mostradas para um registro bem-sucedido e um registro que não se alinhou devido a diferenças em nível nuclear.

Importante destacar que, quando o Bex-Plex foi realizado sem a recuperação modificada do alvo descrita, os núcleos apareceram ampliados com bordas indistintas em comparação com os núcleos de um tecido onde a recuperação do alvo modificado foi realizada corretamente (Figuras 3A e B). O uso do regente de recuperação de alvos em temperatura ambiente levou a um aumento de 33% no volume nuclear médio baseado na coloração DAPI em comparação com a recuperação de alvo realizada usando reagente pré-aquecido a 60°C (Figura 3C). Medições de volume nuclear foram obtidas a partir de campos representativos entre amostras usando segmentação baseada em DAPI. Além disso, quando essa etapa foi realizada a 60°C usando reagente de recuperação pré-aquecido, o volume nuclear médio não diferia significativamente do volume nuclear médio após a coloração padrão de FI (Figura 3C). Como o DAPI é o parâmetro mais eficaz para usar como referência para alinhamento de imagem, essa comparação (Figura 3) destaca a importância crítica dos parâmetros modificados de recuperação para preservar a morfologia nuclear. O registro correto da imagem é indicado por uma correlação de alinhamento próxima de 1, indicando similaridade entre imagens de diferentes ciclos (Figura 3D, antes vs bem-sucedido).

A implementação bem-sucedida do protocolo é indicada pela morfologia nuclear preservada, sinal forte e específico de RNA, e alinhamento preciso dos canais de proteínas e RNA. Em contraste, desfechos subótimos podem incluir distorção nuclear, sinal fraco ou difuso de RNA e desalinhamento entre ciclos de imagem (Figura 3D, antes vs falha). Como mostrado na Figura 3C, a morfologia nuclear deve ser mantida ao longo de todo o protocolo e será aparente tanto qualitativamente quanto quantitativamente. Antes da implementação do Bex-Plex, os usuários devem verificar a verdade fundamental sobre seus tecidos de interesse por meio de coloração separada de proteínas e RNA. Isso não apenas garante uma coloração otimizada de proteínas e RNA para os tecidos-alvo, mas também fornece padrões espaciais relevantes que devem ser mantidos quando combinados para o Bex-Plex. Por exemplo, CD11b colocaliza tanto CD68 quanto Ly6G e mostra coloração localizada na membrana celular (Figura 2A). Isso é esperado, já que CD11b é um marcador de células pan-mieloides e CD68 e Ly6G são marcadores para os subconjuntos de macrófagos e mieloides neutrófilos. A detecção bem-sucedida de RNA é caracterizada por sinais pontuados distintos localizados em células individuais, enquanto resultados subótimos podem se apresentar como coloração fraca ou difusa. O sinal da sonda de RNA deve mostrar localização dentro e ao redor do núcleo, dependendo da função do transcrito. Marcadores proteicos estruturais como a vimentina poderiam ser incluídos para melhorar a resolução celular da localização de transcritos, revelando membranas celulares em tecidos complexos. Espera-se que amostras negativas ou controle mostrem coloração de fundo mínima e nenhum sinal inespecífico da sonda, confirmando a especificidade tanto da detecção de proteínas quanto de RNA.

Discussion

O fluxo de trabalho Bex-Plex integra a plataforma iterativa de coloração proteica, IBEX, com hibridização in situ por RNAscope para permitir a detecção simultânea de proteínas e transcritos de RNA em resolução de célula única. O objetivo principal deste protocolo é fornecer um método reprodutível para análise espacial integrada da expressão de proteínas e RNA em tecidos intactos. A capacidade de medir tanto a expressão de proteínas quanto de RNA no mesmo tecido já apresentou desafios técnicos: altos custos, etapas complexas de recuperação de antígenos, capacidade limitada de multiplexação, limitações de resolução (não célula única), amplificação não linear de sinais e extensos pipelines de bioinformática para processamento a ^{jusante 17, 18, 19}. Comparado a abordagens existentes, como imunofluorescência multiplex, coloração OPAL/TSA e plataformas de transcriptômica espacial, o Bex-Plex permite detecção simultânea reprodutível, quantitativa e de alto complexo, preservando o contexto espacial e a morfologia nuclear para um alinhamento preciso da imagem. Além disso, o Bex-Plex pode ser realizado em um ambiente de laboratório padrão e gera dados com resolução de célula única que é simples de processar. Aproveitar esse protocolo para obter uma compreensão abrangente das interações célula-célula em diversos contextos teciduais, como no microambiente tumoral, será essencial para desenvolver imunoterapias mais eficazes e melhorar os resultados dos pacientes em diferentes estados de doença.

Nosso método é realizado em tecidos fixos embutidos em OCT e segue o fluxo de trabalho padrão IBEX sem modificações, seguido por um protocolo RNAscope HiPlex levemente alterado. Uma diferença fundamental é a etapa de recuperação de alvo no início do fluxo de trabalho de hibridização de RNA: em vez dos 99°C do fabricante por 5 minutos, a coleta é realizada a 60°C por 1 hora. Esse ajuste preserva a arquitetura nuclear, que é fundamental para o alinhamento preciso da imagem entre ciclos de proteínas e RNA. Passos críticos deste protocolo incluem manter uma temperatura consistente de recuperação do alvo, branqueamento eficiente por fluoróforo usando LiBH₄ e minimização da degradação do RNA por meio de processamento rápido e uso de reagentes livres de RNase. É fundamental garantir o uso de reagentes de recuperação de alvos pré-aquecidos a 60°C; Não fazer isso pode causar inchaço nuclear mesmo com a etapa de incubação alterada.

Embora tenha sido demonstrado que 15 minutos de incubação com_{LiBH 4} sejam suficientes para inativar muitos fluoróforos comumente usados, recomenda-se verificar individualmente esse processo para cada ciclo proteico antes de executar todo o protocolo Bex-Plex. Nas publicações iniciais do IBEX, é bem caracterizado que nem todos os fluoróforos compatíveis com IBEX são igualmente^{branqueáveis 12}. Além disso, nosso laboratório observou que alguns marcadores estruturais de alta abundância, como a vimentina, podem exigir um tempo de descolorimento mais longo. Confirmar que as combinações de fluoróforo e marcador utilizadas irão descolorir adequadamente deve evitar o vazamento de sinais residuais em ciclos subsequentes de proteínas e RNA. A página da Comunidade IBEX possui excelentes recursos para design de painéis compatíveis com IBEX e tem a intenção específica de reduzir a carga sobre novos usuários indicando eficácia de anticorpos e clareamento por fluoróforo^{multiplicado por 20}. Além disso, a coloração iterativa e o branqueamento não devem afetar a qualidade dos transcritos de RNA, porém é importante completar os ciclos das proteínas o mais rápido possível e usar reagentes livres de RNAse para minimizar qualquer degradação do RNA que possa ocorrer ao longo do tempo. A falha em fazer isso afetará a hibridização da sonda e levará à diminuição do sinal para quaisquer ciclos de RNAscópio realizados, especialmente para transcritos de baixa abundância. Problemas comuns encontrados durante o protocolo incluem sinal fraco de RNA, branqueamento incompleto por fluoróforo e desalinhamento entre ciclos de imagem, que podem ser mitigados por meio da otimização das condições de coloração e parâmetros de imagem.

É imprescindível limitar o tempo entre a coloração proteica e a hibridização com sonda de RNA a menos de 5 dias. Ao realizar Bex-Plex em múltiplas lâminas, é altamente recomendável processar uma lâmina por vez para reduzir a variabilidade na degradação do RNA. Da mesma forma, limite o tempo entre a hibridização da sonda e a obtenção de imagens. Embora tenhamos conseguido fazer imagens até 3 dias após a amplificação, não é recomendado um armazenamento mais longo. Se houver sinal reduzido após múltiplos ciclos de coloração ou hibridização, pode ser necessário aumentar a velocidade ao longo de todo o protocolo. Idealmente, recomendamos trabalhar o mais rápido possível, pois atrasos reduzem a integridade do RNA e podem diminuir a amplificação. Outras abordagens incluem reduzir o número de ciclos de proteínas realizados para se encaixar mais facilmente nas restrições de linha do tempo do protocolo ou mudar o design do painel de sondas de RNA para incluir alvos de maior abundância. Antes de combinar IBEX e RNAscope, valide separadamente os painéis de anticorpos e de sonda para cada ciclo para determinar a qualidade esperada do sinal para cada ciclo. Em caso de inchaço nuclear após a recuperação do alvo, é possível que o reagente de recuperação do alvo não tenha sido pré-aquecido adequadamente. Certifique-se de que o reagente de recuperação não seja deixado esfriar depois de diluído e pré-aquecido a 60^°C e que a temperatura permaneça constante durante a incubação de 1 hora na lâmina. Por fim, se o registro e alinhamento da imagem falharem na ausência de inchaço nuclear, isso significa que houve um descompasso nos parâmetros de aquisição da imagem, como profundidade de bits, tamanho do voxel ou posição Z ao longo dos ciclos. No caso desses erros, pode ser necessário repetir o protocolo com ajustes nessas configurações para que sejam consistentes. Essas estratégias de solução de problemas são essenciais para garantir reprodutibilidade e consistência entre experimentos.

Os dados gerados pelo Bex-Plex permitem uma visão aprofundada da paisagem espacial dos tecidos em um nível até então inalcançável. No entanto, uma limitação importante desse protocolo é o fato de que o número total de ciclos iterativos de proteínas possíveis é menor do que com IBEX isoladamente, devido à degradação gradual do RNA ao longo do tempo. Embora até 6 ciclos de IBEX padrão tenham sido realizados, não recomendamos exceder 3 ciclos de coloração proteica para Bex-Plex. Mesmo assim, o protocolo acomoda o número máximo de ciclos de RNAscópio e esse nível de profundidade de multiplex é suficiente para a maioria das aplicações.

Limitações adicionais incluem variabilidade entre tipos de tecido e possíveis artefatos de autofluorescência ou coloração que podem afetar a interpretação do sinal. Tecidos mais frágeis podem sustentar menos ciclos e diferentes tipos de tecido podem ter características únicas que afetam a coloração. Essas limitações podem ser avaliadas por meio de colorações de ciclo único de proteína ou RNA e abordadas antes da execução do Bex-Plex. A secção em lâminas revestidas com alúmen de cromo melhora substancialmente a adesão do tecido e a integridade estrutural, mas a autofluorescência é considerada para todas as técnicas baseadas em imunofluorescência. Além disso, atualmente o protocolo não foi validado em FFPE ou amostras clínicas humanas e exigirá otimização adicional para tais aplicações. No entanto, dado que IBEX e RNAscope são predominantemente realizados em tecidos embutidos em parafina fixada em formol (FFPE), é viável que o Bex-Plex possa se expandir para esses tipos de amostras. A implementação bem-sucedida exigirá otimização adicional para a recuperação de antígenos e, potencialmente, etapas de coleta de alvos para preservar a qualidade do RNA.

No geral, o Bex-Plex oferece um método simples, econômico e amplamente acessível para análises espaciais de alto complexo. Esse método é particularmente adequado para aplicações como análise de microambientes tumorais, perfilamento de células imunes e mapeamento espacial de interações de sinalização. Essa visão integrada aprimora a capacidade de investigar mecanismos de regulação imunológica, heterogeneidade tumoral e resposta terapêutica em uma ampla gama de modelos experimentais. O Bex-Plex será inestimável para contextos onde é necessário estudar a diafonia que ocorre entre células em tecidos intactos, como no microambiente tumoral ou em outros tecidos durante inflamação e homeostase. Em particular, a capacidade de resolver a dinâmica espacial da sinalização de citocinas por meio de sondagem dos transcritos de moléculas de vida curta em conjunto com marcadores fenotípicos de proteínas proporcionará uma compreensão mais profunda das interações celulares entre estados de doença. Melhorias futuras podem incluir aumento da capacidade de multiplexação, integração com pipelines automatizados de análise de imagens e adaptação para amostras clínicas de biópsia, expandindo o fluxo de trabalho para incluir tecidos FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeabilization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retrieval reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023