Artigo de método

Um modelo de lesão por hipóxia-reoxigenação em cardióides humanos auto-montantes

DOI:

10.3791/70310

⸱

17 de março de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoides cardíacos humanos auto-assembláveis (hCOs) são um sistema emergente para modelar o desenvolvimento e as doenças cardíacas humanas. Aqui, são apresentadas uma metodologia para gerar e prejudicar hCOs com reoxigenação por hipóxia-oxigenação e detalhes dos resultados histológicos e funcionais esperados após a lesão.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sem uma revascularização rápida, a doença cardíaca isquêmica leva à perda irreversível de cardiomiócitos, formação de cicatrizes e diminuição da função cardíaca. A capacidade de modelar lesões por hipóxia-reoxigenação e avaliar possíveis intervenções terapêuticas em tecidos humanos é uma necessidade não atendida. Organoides cardíacos humanos (hCOs) são um sistema modelo emergente, mas o início do trabalho com hCOs pode ser desafiador devido ao seu pequeno tamanho, requisitos para cultura em suspensão e variabilidade na eficiência de diferenciação. Este protocolo oferece um guia amigável para gerar e manter hCOs auto-montados derivados de iPSC humanos; métodos para processar e analisar histologicamente os hCOs; e uma abordagem para ferir hCOs com hipóxia-reoxigenação que imita a fibrose e apoptose observadas na isquemia/reperfusão humana. Esse protocolo fornece orientações para o uso de hCOs como complemento a modelos animais de lesão por isquemia-reperfusão e pode ser usado para identificar e testar fatores que possam impulsionar a recuperação do miocárdio humano.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença cardíaca isquêmica é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, afetando pelo menos 20,5 milhões de pessoas somente nos EstadosUnidos. Sem perfusão adequada, a hipóxia prolongada resulta em morte de cardiomiócitos (MC) e disfunção do miocárdio. A isquemia miocárdica é tratada principalmente com revascularização por meio de intervenção percutânea, terapia trombolítica ou enxerto de bypass da artéria coronária. No entanto, a revascularização é uma faca de dois gumes e pode causar danos adicionais pela liberação de espécies reativas deoxigênio 4,5. Embora as estratégias de reperfusão tenham sido imensamente bem-sucedidas, abordagens para limitar a perda de MC durante insultos isquêmicos ou após a reperfusão têm sido mais difíceis de alcançar. Embora muitas tentativas de salvar tecido infarto sejam eficazes em modelos animais de isquemia-reperfusão, essas mesmas terapias em grande parte não conseguiram alcançar benefício significativo em ensaios em humanos, levantando a necessidade de modelos humanos avaliarem terapêuticas que poupam ou reabastecema CM 6,7,8,9,10,11,12.

Plataformas humanas usadas para modelar lesão cardíaca incluem tecidos primários e sistemas derivados de células-tronco pluripotentes induzidashumanas (hiPSC) 13,14. Como os tecidos primários são limitados pela disponibilidade de amostras, os sistemas hiPSC emergiram como a plataforma humana dominante para modelagem de doenças cardíacas, com as vantagens distintas de serem geneticamente tratáveis e escaláveis 15,16,17,18,19. Culturas tradicionais de cardiomiócitos derivadas de hiPSC (hiPSC-CM) em 2D são limitadas pela imaturidade dos CMs resultantes, pela ausência de arquitetura tecidular complexa e pela incapacidade de reproduzir toda a diversidade celular encontrada no coraçãohumano 15,20. Para resolver essas limitações, os tecidos cardíacos 3D (EHTs) modificados por engenharia têm se tornado cada vez maisadotados 20,21,22,23,24,25,26. As abordagens do EHT incluem a mistura de células cardíacas pré-diferenciadas emesferoides 24 ou a semeadura de células cardíacas diferenciadas em andaimes oumoldes 21,22,27. Embora os EHTs possam modelar melhor interações celulares heterotípicas e tenham maturidade relativamente maior do que culturas 2D, os requisitos para andaimes personalizados ou biorreatores para criar e manter EHTs atualmente limitam sua escalabilidade 21,27,28.

Organoides cardíacos auto-montantes (hCOs), ou cardióides, são um novo e poderoso sistema modelo humano in vitro 20,25,26,29. Os hCOs têm várias vantagens. Primeiro, podem incluir múltiplos tipos celulares, incluindo células endoteliais, fibroblastos e células epicárdicas, sem a necessidade de múltiplos protocolos especializados de diferenciação26, 29, 30. Segundo, a maior parte de sua diferenciação ocorre em cultura por suspensão 3D, tornando necessária a necessidade de moldes especializados ou matrizde tecido 25,26,29,30. Por fim, os hCOs possuem uma morfologia esférica estereotipada com cavidade central, permitindo análises morfológicas. Assim, os hCOs possuem escalabilidade semelhante aos sistemas de cultura 2D, mantendo parte da complexidade tecidular dos EHTs. Os hCOs têm sido usados para testes de toxicidade de medicamentos, modelagem específica de doenças para pacientes e para modelar aspectos do desenvolvimentocardíaco 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 . Embora promissores, os hCOs apresentam várias limitações em comparação aos EHTs, incluindo a incapacidade de medir diretamente a força de saída. Além disso, não há população nativa de células imunes nos modelos descritos de hCO, embora seja possível povoar hCOs com macrófagos. No entanto, os hCOs são um sistema modelo humano emergente e emrápida evolução 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Até o momento, a modelagem de lesão cardíaca com hCOs tem sido limitada. Um modelo de criolesão foi descrito, mas as lesões são altamente variáveis, e a necessidade de ferir individualmente os hCOs limita aescalabilidade 29. Este manuscrito descreve um protocolo amigável para gerar e ferir hCOs auto-montados com lesão por hipóxia-reoxigenação (H/R). Comparado a outros protocolos para geração de hCOs, este protocolo utiliza um meio de diferenciação simplificado e incorpora a estratégia de diferenciação do mesoderma 2D-3D descrita por Hofbauer et al.29. O protocolo para lesão H/R pode ser executado a qualquer momento após o início das hCOs, o que normalmente ocorre por volta do dia 8 (D8) para D11. A duração da Hora/A/R pode ser ajustada entre 6 h e 24 horas para atingir o nível desejado de lesão, variando de perda mínima a quase completa de muco cervical (CM). Além disso, os hCOs desenvolvem estereotipicamente um núcleo colágeno com células Vimentin+ após lesão H/R, que também aumenta em gravidade com a duração H/R. Esse modelo de hCO escalável e de alta capacidade para lesões H/R potencialmente atende à necessidade de modelos humanos desenvolverem e testarem novas vias terapêuticas para promover a recuperação ou regeneração da CM após lesão.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos para manuseio de linhagens celulares humanas devem seguir protocolos locais de biossegurança. Todos os experimentos foram realizados usando a linhagem celular iPSC DU11, derivada de fibroblastos masculinos recém-nascidos saudáveis pela instalação central de iPSC na Universidade Duke.

1. Geração de hCOs

NOTA: Esta seção descreve um protocolo padrão para gerar hCOs a partir de iPSCs (Figura 1). Todas as etapas detalhadas neste protocolo devem ser realizadas em um exaustor de fluxo laminar para garantir a esterilidade. Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia diferenciada.

DiaConcentração de EstoqueConcentração de TrabalhoFator de diluiçãoBase Media
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% de B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
10 mg/mL de Activina A60 ng/mL de Activina A1:167
D15 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% de B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
D25 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% de B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
10 mM ThiazovivinTiazovivina 2 μM1:5000
D35 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% de B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
D45mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% de B27 menos insulina
D6+N/AN/ARPMI-1640, 2% de B27 mais insulina

Tabela 1: Tabela de mídia de diferenciação. Concentrações de stock, concentrações de trabalho e fator de diluição para cada fator de diferenciação até os dias de diferenciação 0-6. Prepare todas as soluções funcionais frescas no momento da alimentação.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema da diferenciação de hCO. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Manutenção do iPSC
    1. Cubra completamente o fundo de cada poço de uma placa de 12 poços com matriz de membrana basal em proporção 1:100, diluída em meio frio DMEM/F12. Incubar placas tratadas a 37 °C por 1 hora para permitir a polimerização. Se não for usado imediatamente, as placas podem ser seladas com um filme e armazenadas a 4 °C por até 2 semanas e incubadas por pelo menos 60 minutos a 37 °C antes do uso.
  2. Dia de diferenciação -3 (D-3): placagem de iPSCs para diferenciação subsequente
    1. Prepare placas revestidas com matriz de membrana basal conforme descrito no passo 1.1.1.
    2. Aspire o meio de manutenção da cultura iPSC e adicione solução suficiente de descolamento celular para cobrir totalmente as células (~500 μL por poço de uma placa de 12 poços ou 1 mL por poço de uma placa de 6 poços). Incube a 37 °C por 5 minutos.
    3. Adicione um volume igual de meio de manutenção iPSC em cada poço e toque suavemente na placa para ajudar a desprender as células. Incline a placa em sua direção e pipete suavemente para cima e para baixo no fundo do poço para desprender ainda mais as células aderentes, no máximo 3 vezes. Use uma pipeta para mover a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL.
    4. Faça as células de pellet por centrifugação a 300 x g por 3 minutos em temperatura ambiente em uma centrífuga de balde giratório. Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio de manutenção iPSC.
    5. Mova 10 μL da suspensão da célula para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 10 μL de azul Trypan e faça uma pipete para misturar. Adicione 10 μL da mistura iPSC/azul de Tripan ao hemocitometro e conte as células vivas.
    6. Dilua a suspensão celular até uma concentração final de 100.000-200.000 células/mL em meios de manutenção iPSC com inibidor de ROCK (ROCKi). Adicione 1 mL/poço da suspensão da célula a cada poço de uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal.
      NOTA: A densidade de chapasagem antes da diferenciação depende da taxa de crescimento de uma determinada linhagem celular. A densidade do revestimento pode precisar ser ajustada para cada linha iPSC. A concentração de ROCKi pode precisar ser ajustada dependendo da marca/formulação utilizada.
  3. Diferenciação D-2: Trocando mídia para remover o ROCKi
    1. Troque a mídia por 1 mL de mídia de manutenção nova para iPSC, sem ROCKi. As células devem começar a formar pequenas colônias. As colônias devem parecer planas (Figura 2A). Se as células parecerem semelhantes a paralelepípedos, finas ou alongadas, isso é sinal de diferenciação espontânea, e a eficiência de diferenciação pode ser impactada.
  4. Diferenciação D-1: Continuar incubando células sem tratamento.
  5. Diferenciação D0: Início da diferenciação e indução do mesoderme
    1. Usando um microscópio, verifique a densidade celular para garantir uma confluência de 70%-90% (Figura 2B) no momento da diferenciação. Se subconfluente, alimente as células com meio de manutenção iPSC e espere por 24 horas. Se as células estiverem muito confluentes, divida-as como no passo 1.2
    2. Prepare 12 mL por placa de 12 poços de meio induzitivo mesodermique D0 (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 60 ng/mL de activina A no RPMI-1640 com 2% de suplemento B27 menos insulina (RB-)).
    3. Remova o meio existente e substitua por 1 mL/poço de meio de indução mesoderma D0. Observe o momento da troca de mídia.
  6. Diferenciação D1: Especificação do mesoderme cardíaco
    1. Exatamente 24 horas após a adição do meio de indução do mesoderme D0, o meio de troca por meio de especificação do mesoderma cardíaco D1 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico em RB).
  7. Diferenciação D2: formação hCO
    1. Adicione reagente de dissociação celular suficiente para cobrir as células e incube a 37 °C por 5 minutos (Figura 2C). Adicione um volume igual de meio mesodermático cardíaco D2 em cada poço e pipete suavemente para cima e para baixo para liberar as células aderentes. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Faça as células de pellet por centrifugação a 300 x g por 3 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda em 1 mL de meio de especificação cardíaca D2 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico em RB-).
    3. Pegue 10 μL da suspensão da célula e adicione 10 μL de azul de Trippan. Conte células com qualquer método preferido. Diluir células a uma concentração de 100.000 células/mL em meio de especificação cardíaca D2, com 2 μM de tiazovivina. Use 10 mL da suspensão da célula por cada placa de fixação ultra-baixa de 96 poços.
    4. Transfira a suspensão da célula para um reservatório de reagente de tamanho adequado e use uma pipeta multicanal para transferir 100 μL para cada poço de uma placa de 96 poços de acoplamento ultra-baixo, para uma concentração final de 10.000 células/poço.
    5. Para induzir a formação de hCO em cultura por suspensão, centrifuge as placas a 500 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, haverá um grande pellet de células (Figura 2D) – se esse pellet não estiver circunscrito, repita a centrifugação.
      NOTA: Nem todas as células se incorporarão ao hCO, que aparecerá como um pellet celular circunscrito, com células individuais visíveis na microscopia de campo claro. Alguns detritos de célula única na placa ao redor do hCO são normais.
  8. Diferenciação D3: Adição de mídia para diluir o ROCKi
    1. Prepare 10 mL de meio D3 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico em RB-) por placa. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de meio D3 a cada poço, sem remover nenhum meio.
      NOTA: Neste estágio, os hCOs já terão se condensado em um esferóide escuro e bem circunscrito. Células individuais não serão visíveis (Figura 2E).
  9. Diferenciação D4: Troca para mídia D4
    1. Remova 100 μL de meio D3 e substitua por 100 μL de meio D4 (5 μM IWP2 em RB-). Para reduzir o risco de aspiração, incline a placa em direção a você em um ângulo de aproximadamente 45° e segure uma pipeta multicanal em um ângulo de aproximadamente 90° em relação à parede lateral da placa. Coloque a pipeta multicanal firmemente na parede lateral do poço e aspire lentamente 100 μL de meio, verificando intermitentemente as pontas da pipeta em busca de hCOs aspirados.
      NOTA: os hCOs estão em cultura em suspensão, e aspirar hCOs durante a remoção do meio é comum. Para reduzir o risco de aspiração, incline a placa em direção a você em um ângulo de aproximadamente 45° e segure uma pipeta multicanal em um ângulo de aproximadamente 90° em relação à parede lateral da placa. Coloque a pipeta multicanal firmemente na parede lateral do poço e aspire lentamente 100 μL de meio, verificando intermitentemente as pontas da pipeta para hCOs aspirados.
    2. Substitua por 100 μL de meio D4.
  10. Diferenciação D6: mídia de manutenção de hCO
    1. Remova 100 μL do meio D4 e substitua por 100 μL do meio D6+ (RPMI-1640 com suplemento de B27 a 2% (RB+)).
  11. Diferenciação D8
    1. Continue trocando o meio a cada 2 dias, removendo 100 μL e substituindo por 100 μL de meio D6+ fresco. Os hCOs devem crescer, manter as bordas lisas e começar a bater em torno de D6-11 se forem bem diferenciados (Figura 2F). Os hCOs ainda aparecerão como esferoides escuros e bem circunscritos, e células individuais não serão visíveis.

figure-protocol-2
Figura 2: Linha do tempo da diferenciação de hCO. Linha do tempo da diferenciação de organoides. (A) Colônias de iPSC 1 dia antes do início da diferenciação (D-1). Note colônias distintas, de aparência plana. (B) iPSCs no dia da iniciação da diferenciação (D0) com confluência de ~90%. (C) Organoide na diferenciação D2 imediatamente após a formação do organoide em uma placa de fixação ultra-baixa de 96 poços. A seta indica um exemplo de cristais IWP2 em forma de agulha. (D) Organoides na diferenciação D3. Note compactação significativa de organoides devido à formação de junção célula-célula; Alguns detritos celulares não incorporados são normais nesse estágio. (E) Organoides na diferenciação D10. (F) A seta indica colônia de iPSC com células alongadas e finas com aparência de paralelepípedo, indicando potencial diferenciação espontânea. Barra de escala = 1000 μm para painéis A-E, barra de escala = 400 μm para painel F. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coleta e fixação de hCOs para imunocoloração

  1. Usando uma pipeta de 1000 μL com a ponta cortada, transfira os hCOs para um tubo microcentrífuga de 1,7 mL. Depois que todos os hCOs forem transferidos, espere que eles afundem no fundo do tubo e remova suavemente o excesso de mídia. Lave os hCOs 1x com PBS, espere alguns segundos para os hCOs descerem para o fundo do tubo e remova suavemente o excesso de PBS.
  2. Fixe hCOs com 4% de PFA por 30 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: Alguns anticorpos podem exigir fixação de acetona ou metanol para desempenho ideal. Consulte as diretrizes do fabricante.

3. Imunocoloração em montagem total

  1. Transfira o número desejado de hCOs fixos para um tubo microcentrífuga de 1,7 mL. Remova a solução fixadora e lave com PBS contendo 0,1% Tween-20 (PBS-T).
    1. Para lavar os hCOs, remova o máximo possível do excesso de fixador. Tenha cuidado para não perturbar os hCOs no fundo do tubo. Adicione ~1 mL de PBS-T e espere alguns segundos para os hCOs descerem até o fundo do tubo antes de passar para a próxima etapa.
  2. Diluir o anticorpo primário até a concentração desejada na solução de coloração (soro neonatal para panturro, 1% DMSO em 0,1% PBS-T). Adicione de 50 a 100 μL de solução primária de anticorpos por tubo de microcentrífuga (ou volume suficiente para cobrir todos os hCOs em cada tubo).
  3. Incube por 24 horas a 4 °C em um shaker/rocker. Remova o excesso de anticorpos primários e então realize três lavagens de 1 hora em PBS-T em temperatura ambiente. Realize uma lavagem final durante a noite em PBS-T a 4 °C para garantir que qualquer excesso de anticorpos seja removido.
  4. Dilua o anticorpo secundário até a concentração desejada na solução de coloração e adicione de 50 a 100 μL de solução de anticorpos por tubo de microcentrífuga (ou volume suficiente para cobrir todos os hCOs de cada tubo).
  5. Incube os hCOs com o anticorpo secundário por 24 horas a 4 °C em uma plataforma de tremor. Remova o excesso de anticorpos secundários e então realize três lavagens de 1 h em PBS-T em temperatura ambiente. Realize uma lavagem final durante a noite em PBS-T a 4 °C para garantir que todo o excesso de anticorpos seja removido.
  6. Para imagens de montagem completa, transfira os hCOs usando uma pipeta de 1000 μL com a ponta cortada para uma lâmina de vidro carregada positivamente. Remova o excesso de PBS-T e adicione algumas gotas de suporte para cobrir os hCOs. Coloque cuidadosamente uma cobertura para achatar os hCOs.
    NOTA: Para preservar a arquitetura 3D do hCO, use uma junta de borracha ou fita dupla face ao redor das bordas do ferrolho para aumentar a altura do deslizamento da tampa. Usar um meio de montagem de limpeza pode ser útil para melhorar a imagem através do hCO, especialmente se os hCOs não estiverem achatados.

4. Seccionamento e embedding

  1. Após a fixação, cubra os hCOs com 30% de sacarose durante a noite a 4 °C para crioproteção. Usando uma pipeta de 1000 μL com a ponta cortada, transfira o número desejado de hCOs para um molde plástico de 12 mm x 12 mm. Remova cuidadosamente o excesso de solução de sacarose, tomando cuidado para não aspirar os hCOs.
    NOTA: É útil pipetar 30% de sacarose para cima e para baixo na ponta da pipeta antes de transferir, para evitar que os hCOs grudem na lateral da ponta.
  2. Adicione uma pequena gota de OCT, só o suficiente para cobrir os hCOs. Usando uma pinça fina ou uma ponta de pipeta, reposicione delicadamente os hCOs no OCT de modo que não fiquem aglomerados e nenhum hCOs fique próximo às bordas do molde. Certifique-se de que todos os hCOs estejam o mais próximos possível do fundo do molde, com o objetivo de maximizar o número de hCOs encontrados em uma única criossecção.
  3. Congele essa camada inicial de OCT colocando o molde em um cooler de isopor com uma camada de gelo seco no fundo. Espere alguns minutos para o OCT endurecer e então mova o mofo do gelo seco para a bancada. Adicione OCT adicional até que o molde esteja cheio. Espere a primeira camada de OCT derreter completamente antes de voltar para gelo seco.
  4. Armazene hCOs congelados e embutidos a -80 °C até estar pronto para criossecção.
  5. Quando estiver pronto para a separação, alinhe o bloco de hCO o melhor possível e comece a aparar o bloco. Periodicamente, coloque uma seção em um escorregador carregado e inspecione visualmente cada seção em busca de hCOs. Quando os hCOs forem visualizados, mude para seções de 6 μm.
    NOTA: A taxa de rotatividade dos hCOs durante a incorporação e o corte é de pelo menos 10%. Planeje de acordo.

5. Seções de tecido com tunel e imunocoloração

  1. Use uma caneta de papanicolau para desenhar uma borda hidrofóbica ao redor das partes de tecido que precisam ser tingidas. Lave uma vez em PBS 0,1% Tween (PBS-T) para dissolver o OCT.
  2. Adicione um tampão bloqueador (10% soro neonatal para panturrilhos, 1% DMSO, em PBS-T) por 1 hora em temperatura ambiente.
  3. Prepare a solução primária de anticorpos. Comece com a concentração recomendada pelo fabricante para imunofluorescência, mas a concentração pode precisar ser ajustada empiricamente.
    NOTA: Alternativamente, a coloração com TUNEL pode ser realizada neste momento, seguindo o protocolo do fabricante.
  4. Remova o buffer bloqueador do slide. Adicione solução primária suficiente para cobrir as seções de hCO. Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C ou 3 horas a 37 °C. Lave as lâminas 3 vezes por 5 minutos cada em um pote Coplin cheio de PBS-T em temperatura ambiente.
  5. Prepare solução secundária de coloração de anticorpos em tampão bloqueador, incluindo DAPI ou outro marcador pan-nuclear. Adicione solução secundária suficiente para colorir anticorpos para cobrir as seções de hCO. Incubar protegido da luz por 1 hora em temperatura ambiente.
  6. Lave as lâminas 3 vezes por 5 minutos em um pote Coplin cheio de PBS-T em temperatura ambiente. Monte com um coverslip com o meio de montagem desejado.

6. Quantificação da colocalização nuclear com CardioCount

NOTA: CardioCount é um método baseado em aprendizado profundo para pontuar núcleos de CM a partir de imagensde microscopia 40. Originalmente desenvolvido para avaliar o ciclo da muco cervical (CM), o CardioCount tem bom desempenho em múltiplas colorações nucleares, incluindo o TUNEL40.

  1. Para usar o CardioCount, baixe o pacote CardioCount do GitHub ou importe para o Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Versão 1 roda em um ambiente Python 3.
  2. Exporte imagens para quantificação como arquivos individuais de 512 x 512 pixels .tif com canais vermelho, azul e verde fundidos, onde o canal vermelho é um marcador nuclear CM, azul um marcador nuclear geral e verde um marcador nuclear em ciclo (ou seja, Ki67) ou marcador apoptótico (ou seja, TUNEL). Crie uma pasta pai no Google Drive para esse experimento e envie tiffs mesclados como uma subpasta.
    NOTA: CardioCount foi treinado com colorações nucleares que preenchem o núcleo. Marcadores de ciclismo mais pontuados, como Aurora B ou PH3, podem não ser compatíveis com o CardioCount.
  3. Abra o caderno CardioCount no Google CoLab. Execute a Célula 1.1 para verificar o acesso da unidade de processamento gráfico (GPU). Execute o Cell 1.2 para conectar o CoLab Notebook ao Google Drive.
  4. Execute o Cell 1.3 para carregar o CardioCount e Dependências no Google Colab. Edite o kfile para ler o nome do caminho onde a pasta PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries foi salva quando baixou.
  5. Na Célula 2.0, edite base_folder para ler o nome do caminho da pasta pai que contém a subpasta de imagens a serem analisadas. Execute a Célula 2.0 para vincular essa pasta ao CoLab.
  6. Na Célula 2.1.1, edite orig_image_folder para corresponder ao nome da pasta contendo imagens para análise. Edite channel_to_remove para ler verde e editar new_image_folder para nomear a subpasta sob base_folder onde todas as imagens com o canal verde removido (vermelho/azul) serão salvas. Repita essa etapa para remover o canal vermelho, certificando-se de editar new_image_folder para distinguir a subpasta que contém imagens com o canal vermelho removido (verde/azul).
  7. Na Célula 2.1.2, corte as imagens para imagens de 512 x 512 para as imagens vermelhas/azuis. Certifique-se de que o uncropped_image_folder corresponda ao nome new_image_folder criado na etapa 6.6. Para imagens vermelhas/azuis. Nomeie destination_image_folder para designar a subpasta onde imagens cortadas, vermelha/azul serão salvas. Repita essa etapa para cortar as imagens verde/azul. Por fim, repita essa etapa para cortar os tiffs fundidos originais de 3 canais, alojados em base_folder.
  8. Execute a Célula 2.2 para gerar mapas de probabilidade. Nome data_specific_folder o nome das imagens vermelha/azul e verde/azul geradas em destination_image_folder a partir da Célula 2.1.2. Para model_dir, insira o caminho do arquivo para uma pasta que contenha modelos de segmentação. Para segmentar núcleos vermelhos, use o modelo erg_rb_opt e insira 200 para a época. Renomeie probmap_directory_name para designar a pasta onde os mapas de probabilidade vermelho/azul serão salvos. Repita essa etapa para imagens verde/azul. Para segmentar núcleos verdes, use o modelo edu_mouse_bg_opt e insira 100 para a época.
  9. Na Célula 2.3.1, mapas de objetos serão criados com base nos mapas de probabilidade gerados no passo 6.8. A input_folder será nomeada a partir do destination_image_folder da Célula 2.1.2 que contém imagens de mapas de probabilidade vermelho/azul geradas na Célula 2.1.2. Nomeie os output_folder onde imagens vermelhas/azuis com limite serão armazenadas. Defina o limiar para o nível de confiança da segmentação nuclear (faixa de 0,0-1,0). Run Cell 2.3.1. Repita essa etapa para imagens verde/azul.
    NOTA: Os limiares para o nível de confiança sobre os núcleos dependerão do conjunto de dados. Comece com um limiar de 0,9 e ajuste mais alto se for muito flexível e mais baixo se muito rigoroso, com base na inspeção aleatória dos mapas de probabilidade.
  10. Na Célula 2.3.2, o número de células nos mapas de objetos gerados no passo 6.10 será contado e exportado para um arquivo .csv. O count_folder será nomeado em homenagem ao output_folder da Célula 2.3.1, onde imagens vermelhas/azuis com limite são salvas. Para excluir objetos que toquem a borda de uma imagem, certifique-se de que ignore_border_cells leia Verdadeiro. Renomeie csv_path para o nome do caminho da base_folder onde todas as subpastas estão armazenadas. Edite o nome do csv para refletir as contagens de objetos vermelho/azul. Repita essa etapa para imagens azuis/verdes.
  11. Na Célula 2.4, núcleos verde/vermelho duplamente positivos serão contados. Renomeie img_folder para o nome da subpasta gerada no passo 6.8 que contém imagens recortadas de 3 canais. Renomear childcell_folder para o output_folder da Célula 2.3.1, onde imagens vermelhas/azuis com limite são salvas. Renomear parentcell_folder para a output_folder a partir da Célula 2.3.1, onde imagens verde/azul com limite são salvas. Renomeie dest_folder para designar a pasta onde os mapas duplos positivos de objetos serão salvos. Renomeie csv_path para designar o nome do caminho e o nome do arquivo para a base_folder onde todas as subpastas são armazenadas e edite o nome csv para refletir contagens de objetos duplos positivos.
  12. Verifique a segmentação precisa comparando as contagens de vermelho, verde e positivo duplo geradas por imagem com a imagem bruta.
    1. Se o CardioCount superestima consistentemente o número de núcleos em uma imagem em relação ao que um revisor cego contaria, repita o passo 6.9 com um limiar de confiança mais alto e repita os passos 6.10-6.11. Se o CardioCount subestima o número de núcleos em uma imagem em relação ao que um revisor cego contaria, repita o passo 6.9 com um limiar de confiança mais baixo e repita os passos 6.10-6.11.
  13. Soma todas as contagens de cada hCO para núcleos vermelhos, verdes e núcleos duplos positivos. Calcule os núcleos em % de ciclo como (núcleos duplamente positivos / núcleos vermelhos totais de CM) x 100 para cada organoide.

7. Lesão por hipóxia-reoxigenação

  1. Prepare meios para hipóxia (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mMNaH 2PO4, 1,3 mMMgSO 4, 0,5 mMMgCl 2, 0,9 mMCaCl 2, 20 mM lactato de sódio e 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. Para um frasco de cultura celular, transfira 5 mL de meio de hipóxia por placa de hCO de 96 poços. Coloque o frasco de cultura celular dentro da câmara de hipóxia e lave com gás anóxico (5% CO2, 95%N2) por 3 minutos. Incube a 37 °C por pelo menos 1 hora antes de iniciar a hipóxia.
  3. Remova toda a mídia dos hCOs. Comece removendo ~150 μL com uma pipeta multicanal de todos os poços. Depois, utilize uma pipeta de 200 μL para remover cuidadosamente o material restante dos poços individuais, sem perturbar os hCOs.
    NOTA: A remoção de todo o meio de todos os poços é fundamental para alcançar danos reprodutíveis.
  4. Adicione 50 μL de meio de hipóxia em cada poço. Coloque a placa de hCO na câmara de hipóxia e lave com gás anóxico (5% CO2, 95%N2) por 3 minutos. Coloque a câmara de hipóxia na incubadora a 37 °C por 6 horas.
  5. Para iniciar a reoxigenação, remova os hCOs da câmara de hipóxia e alimente 150 μL de meio RB+ pré-aquecido. Permita pelo menos 3 horas de reoxigenação a 37 °C antes de realizar ensaios a jusante.

8. Ensaio de liberação de lactato desidrogenase

  1. Colete 20 μL de meios de poços de hCOs lesionados e não lesionados no momento desejado após iniciar a reperfusão. Diluir 1:10 em 180 μL de tampão de armazenamento de LDH (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10% de glicerol, 1% de BSA). Armazene a -20 °C até estar pronto para realizar o ensaio. Pipete várias vezes para misturar mídia antes da coleta
  2. Descongelar mídia congelada. Adicione 45 μL de buffer de armazenamento LDH a um poço de uma placa de 96 poços de parede preta, com fundo transparente, para cada amostra de meio a ser analisada. Adicione 5 μL de meio diluído 1:10 em cada poço para uma diluição final de 1:100. Prepare o Reagente de Detecção de LDH misturando 50 μL de Mistura de Enzimas de Detecção de LDH e 0,25 μL de Substrato de Redutase para cada amostra a ser analisada.
  3. Adicione 50 μL de Reagente de Detecção de LDH a cada poço contendo meio diluído 1:100. Incube em temperatura ambiente, protegido da luz, por 60 minutos. Ensaio para sinal bioluminescente em um leitor de placas compatível.

9. Imagem de cálcio

  1. Prepare solução de coloração de cálcio com RPMI-1640 sem fenol vermelho, 0,04% plurônico e Cal520-AM de 5 μM. Proteja as amostras da luz.
  2. Remova 100 μL de meio de cada poço destinado à imagem de cálcio. Adicione 100 μL de solução colorante de cálcio e incube a 37 °C, protegido da luz, por 30 minutos.
  3. Remova 100 μL de meio de cada poço com corante de cálcio e substitua por 100 μL de RPMI-1640 sem fenol vermelho. Incube por 30 minutos a 1 hora a 37 °C para permitir a lavagem do corante.
  4. Usando um microscópio com capacidade de imagem/fluxo contínuo, coloque a placa de fixação ultra-baixa de 96 poços na posição de trabalho. Com um objetivo 10x, identifique a base de um hCO e fique atento a transitórios Cal520.
  5. Capture registros de 30 s de transientes de cálcio em temperatura ambiente. Se usar um microscópio confocal, não será possível visualizar através de todo o hCO. Selecione um plano focal próximo à base do hCO, onde os contornos celulares sejam visíveis durante os transientes de cálcio.

10. Análise de transientes de cálcio (Figura 3)

  1. A análise de transientes de cálcio pode ser realizada usando uma variedade de softwares de análise de picos. Abaixo estão instruções para análise usando o plugin SpikyImageJ 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Adicione cinco regiões de interesse (ROIs) de 2 x 2 pixels ao Gerenciador de ROI em células visíveis em cada hCO. Tome cuidado para não sobrepor ROIs com núcleos ou limites celulares, pois o movimento do hCO pode afetar a análise de transientes.
  3. Em Analisar > Conjunto de Medições, selecione Intensidade Cinza Média. No gerenciador de ROI, selecione Multi-Measure para capturar a Intensidade Cinza Média em todos os ROIs e todos os quadros da gravação.
  4. Salve um arquivo .csv contendo a Intensidade Cinza Média para todos os ROIs. Salve todas as posições de retorno de investimento de cada imagem para referência posterior.
  5. Em uma nova planilha, adicione uma coluna para o(s) Tempo(s). Calcule o tempo em cada quadro dividindo os 30 s pelo número total de quadros e depois multiplicando pelo número de quadros. Salve isso como um .csv editado.
  6. Abra o arquivo .csv editado em Fiji e abra o Spiky Plugin. Em Opções de Análise, selecione os parâmetros de análise desejados.
  7. Tempo(s) de plotagem no eixo X, e Intensidade Cinza Média para ROI #1 no eixo Y. Selecione Analisar Picos e confirme a anotação correta da linha de base, início/fim do pico e amplitude do pico. Se o número errado de picos for identificado, altere os parâmetros nas Opções de Análise, incluindo a amplitude mínima do pico desde a linha de base, e inicie o limiar de pico até que a identificação do pico seja bem-sucedida.
  8. Salve todos os arquivos intermediários. Batimentos por minuto (bpm) podem ser calculados dividindo 60 pela média do(s) Intervalo(s) de pico a pico para cada ROI.
  9. Repita a análise acima para todos os ROIs por hCO.

figure-protocol-3
Figura 3: Análise de transientes de cálcio. (A) A caixa vermelha indica o botão que abre o menu suspenso para escolher parâmetros de análise. (B) A caixa vermelha indica o botão para representar o Tempo (s) versus Intensidade Cinza Média a partir de um ROI dentro de um hCO representativo não lesionado. (C) A caixa vermelha indica o botão para selecionar análise de picos. (D) Análise representativa de traços e picos de transientes de cálcio de um hCO não lesionado. Triângulos vermelhos indicam o máximo do pico, quadrados rosas representam a inclinação máxima para o movimento ascendente e descendente, a caixa verde indica o início do pico e a caixa azul indica a linha base. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguindo o protocolo acima, deverá resultar em hCOs bem formados que começam a bater entre os dias de diferenciação 7-12 (D7-12). À medida que os hCOs amadurecem após o dia 25, é possível que contrações espontâneas deixem de ser visíveis sem estimulação elétrica. A lesão H/R pode ser realizada a qualquer momento após os hCOs começarem a bater – normalmente realizamos lesão em hCOs de 15 dias (D15) ou mais tarde.

Confirmação da lesão
Assim c...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui está apresentado um protocolo passo a passo para gerar e lesionar hCOs auto-montantes com H/R. Doenças cardíacas iscêmicas são caracterizadas por remodelação fisiopatológica, incluindo morte de cardiomiócitos, remodelação fibrótica, disfunção elétrica e declínio funcional. Essas perturbações são observadas no sistema modelo de hCO, incluindo aumento dos CMs de TUNEL+ , aumento da liberação de LDH, aumento da área de Vimentin+ e alterações no manuseamento do cál...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado por R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) e pelo programa de Treinamento de Cientistas Médicos da Universidade Duke T32 5T32GM145449-03 (LP).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de AccutaseSigma-AldrichA6964-500ML
Anticorpo anti-cardíaco Troponina TAbcamEPR20266
Suplemento de B-27 (50X), sem soroGibco17504044
Suplemento de B-27, menos insulinaGibcoA1895602
Leitor de placas BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabPMID: 38984052
Linha celular (Homo sapiens, masculino) - Linha iPSC DU11Núcleo de Células-Tronco da Universidade Duke
Lâminas de microscópio carregadas, vidro brancoVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRTecnologias STEMCELL5888
Microplacas de fixação Corning 96-Well Clear Ultra Low FixationFisher7007
Reservatórios de Pipetagem DescartáveisVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
Microscópio Fluorescente EVOSEVOS
Matriz de Membrana Basal com Fator de Crescimento Reduzido Geltrex, livre de LDEV, qualificada para células-troncoGibcoA1413302
Activina Humana: Uma Proteína RecombinantePEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2Tecnologias STEMCELL72124
Ácido L-Ascórbico (Cristalino/ACS Certificado)Fisher ScientificA61-100
Anti-Vimentina para camundongosDSHBAMF-17b
mTeSR PlusTecnologias STEMCELL100-0276
Placas de Cultura Celular Multipoço – 12 poçoVWR10062-894
F-127 PlurônicoSigma-AldrichP2443
ReLeSRTecnologias STEMCELL100-0483
RPMI 1640 MédioGibco11875119
RPMI 1640 Médio, sem fenólico vermelhoGibco11835-030
TiazovivinaTecnologias STEMCELL72254
Composto Tecido-Tecido O.C.T.SAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Microscópio Confocal Zeiss Spinning DiskZeiss

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Artigos relacionados