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Artigo de método

Medição da produção de óxido nítrico em culturas celulares epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas na interface ar-líquido

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DOI:

10.3791/70311

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3 de julho de 2026

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1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para quantificar a produção de óxido nítrico (NO) em culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI), medindo nitrito em secreções apicais usando um ensaio de quimioluminescência baseado em triiodeto.

Resumo

Culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar–líquido (ALI) fornecem um modelo fisiologicamente relevante para estudar a sinalização do óxido nítrico (NO) em células ciliadas. Aqui, descrevemos um protocolo para quantificar a produção de NO medindo nitrito (NO₂⁻), um produto estável de oxidação do NO, em amostras coletadas de células epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas por ALI. Lavagens apicales, meios basais e lisados celulares são coletados e analisados usando um ensaio quimioluminescente à base de triiodeto acoplado a um analisador de óxido nítrico (NOA). Ao ser injetado no vaso de reação, o nitrito é reduzido quimicamente a NO, que é detectado por quimioluminescência baseada em ozônio. A intensidade do sinal é quantificada e convertida em picomoles de nitrito usando uma curva de calibração padrão, e os valores são normalizados para o conteúdo total de proteínas celulares. O desempenho do ensaio é validado usando modulação farmacológica dos níveis de NO. Após tratamento com o NO doador Dietilenetriamina NONOato (DETA-NONOato) e o inibidor da NO sintase N(ω)-Nitro-L-arginina (L-NAME), observamos diferenças significativas nos níveis de nitrito entre condições. O sinal mais robusto e reproduzível é observado em lavagens apical, correspondentes à quantidade de NO liberada pelo epitélio das vias aéreas. Esse método detecta de forma confiável o NO em amostras de epitélios das vias aéreas diferenciadas por ALI, fornecendo uma plataforma in vitro precisa para quantificar a produção de NO e modelar doenças associadas ao metabolismo anormal do NO.

Introdução

Uma característica marcante de várias doenças das vias aéreas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC) e discinesia ciliar primária (DCP), é a homeostase alterada do óxido nítrico (NO), mensurável como alterações nos níveis de NO exalados, que podem variar bastante nessas doenças, sendo elevadas na DPOC easma 1,2, enquanto drasticamente reduzidas na FQ ena DCP 3, 4. Essas doenças frequentemente apresentam anormalidades nos cílios móveis epiteliais das vias aéreas, os principais efetores da depuraçãomucociliar 5. Como o NO e suas vias de sinalização a jusante são reguladores críticos da motilidade ciliar, entender como a produção e sinalização do NO são alteradas nesses contextos é essencial para elucidar os mecanismos da disfunção mucociliar. Assim, um método que permite a detecção precisa da produção e liberação de NO nos epitélios das vias aéreas fornece uma ferramenta valiosa para dissecar a regulação e o papel fisiológico dessa molécula sinalizadora. Tais abordagens são particularmente úteis em ambientes experimentais onde a medição direta do NO é desafiadora devido à sua meia-vida curta e rápida reatividade.

O NO regula a biogênese e a função dos cílios das vias aéreas influenciando a polaridade celular ciliada e o batimento coordenado dos cíliosmóveis 6,7,8. No entanto, os mecanismos que não mantêm homeostase nas vias aéreas permanecem incompletamente compreendidos. Culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI) fornecem um valioso sistema in vitro para investigar esses mecanismos. Atualmente, esse modelo é amplamente utilizado para estudar o impacto de insultos ambientais no epitélio das viasaéreas 9,10,11 e para elucidar a fisiopatologia das doenças das viasaéreas 12. Comparados às culturas submersasconvencionais 13,14, epitélios diferenciados por ALI reproduzem de forma mais fiel a arquitetura e a função da via aérea nativa, incluindo polarização epitelial, diferenciação mucociliar e troca realista gás-líquido, tornando-os especialmente adequados para estudar a liberação apical de NO, sinalização e função ciliar relacionada. Esse sistema é, portanto, muito adequado para experimentos voltados a quantificar metabólitos derivados de NO liberados no lúmen das vias aéreas, especialmente sob condições de diferenciação epitelial ou manipulação farmacológica.

A medição precisa da concentração de NO é essencial, pois níveis excessivos e deficientes de NO podem prejudicar a função ciliar. Atualmente, métodos baseados em sondas fluorescentes (por exemplo, diaminofluoresceínas, DAFs) disponíveis para detectar NO são apenas semi-quantitativos e limitados pela sensibilidade ao pH, dependência de oxigênio e falta de especificidade, pois podem reagir com oxidantes e antioxidantes celulares, resultando em mediçõessemi-quantitativas 15. Além disso, sensores eletroquímicos (por exemplo, eletrodos amperométricos sensíveis ao NO) permitem a detecção em tempo real doNO 16, mas podem ser difíceis de implementar em sistemas biológicos complexos devido à ausência de meia-vida curta, interferência da bioincrustação da superfície do eletrodo de espécies redox ativas e dificuldades na manutenção da calibraçãoestável 17. Abordagens alternativas baseadas em quimioluminescência, incluindo a detecção direta de NO em fase gasosa e ensaios redutivos direcionados a diferentes espécies de óxidos de nitrogênio, também foram descritas, mas sua aplicação em culturas epiteliais das vias aéreas permanece inexplorada. Essas limitações destacam a necessidade de métodos sensíveis e quantitativos que possam detectar de forma confiável baixos níveis de espécies derivadas do NO em amostras biológicas de pequeno volume. Para superar essas limitações, estabelecemos um protocolo para quantificar o NO em secreções apicais coletadas de epitélios diferenciados por ALI usando um Analisador de Óxido Nítrico (NOA). O NOA é um detector altamente sensível baseado em quimioluminescência, tradicionalmente usado para medir metabólitos NO em amostras químicas e, mais recentemente, adaptado para a análise de amostras biológicas, incluindo sangue, homogeneados de tecido e supernadantes de culturacelular 7,18,19. O NO é uma molécula sinalizadora altamente reativa, rapidamente oxidada em nitrito nos tecidos sob condições de níveis normais de oxigênio, com uma meia-vida excepcionalmente curta. Assim, o nitrito como produto final da oxidação do NO serve como indicador da produção total de NO em sistemasbiológicos 20,21,22. Esse método sensível e reprodutível de quimioluminescência permite a detecção de nitrito/NO nos níveispicomolares 23,24, tornando-o ideal para medir pequenas alterações em amostras biológicas de baixo volume, como aquelas derivadas de culturas MTEC ALI. No entanto, essa abordagem é mais adequada para condições onde o acúmulo de nitrito reflete a produção recente de NO e pode ser influenciada por fatores como manuseio da amostra, contaminação por nitritos de fundo e estado de diferenciação epitelial. Portanto, controles apropriados e um desenho experimental cuidadoso são necessários para garantir uma interpretação precisa dos resultados.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Maryland (Protocolo # AUP–00004632).

NOTA: O protocolo exige aproximadamente 2 dias para isolamento das células epiteliais traqueais de camundongos (MTEC), seguidos por 7–10 dias para expansão, 5–6 dias para proliferação em inserções transwell, 21 dias para diferenciação (tempo necessário para adquirir células multiciliadas suficientes), 24 horas de tratamento medicamentoso e um dia adicional para coleta de amostra, calibração do NOA, injeções e aquisição de dados.

1. Preparação de mídias e soluções

NOTA: Consulte a Tabela 1 para detalhes sobre os ingredientes da mídia.

  1. Mídia F–12 da Ham
    1. Prepare a solução dentro de um exaustor de fluxo laminar estéril. Adicione 5 mL de 100× antibióticos penicilina/estreptomicina e 0,5 mL de Anfoterecina B (Fungizone) a 500 mL do meio F12 do Ham em um frasco estéril.
    2. Misture invertendo suavemente a garrafa de 5 a 10 vezes para garantir a mistura completa. Filtre esterilize a solução usando um filtro de 0,22 μm em condições estéreis e armazene a 4 °C.
      ATENÇÃO: Penicilina/estreptomicina e anfotericina B são agentes antimicrobianos que podem causar irritação ou reações alérgicas. Manuseie usando equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas e jaleco.
  2. Solução pronase
    1. Adicione 15 mg de pronase a 10 mL de meio F12 de Ham estéril em um tubo estéril para obter uma solução de pronase a 0,15%. Misture invertendo suavemente ou pipetando para cima e para baixo até que a pronase esteja totalmente dissolvida. Prepare fresco imediatamente antes do uso.
  3. Solução de DNase I
    1. Adicione 5 mg de DNase pancreática crua I a 9 mL do meio F12 de Ham e 1 mL de solução de albumina sérica bovina (BSA) de 10 mg/mL em um tubo estéril para obter uma solução de 0,5 mg/mL de DNase I.
    2. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo até que a DNase I esteja totalmente dissolvida, evitando a formação de bolhas. Uma vez totalmente dissolvida, aliquota a solução em tubos microcentrífugas estéreis de 1 mL e armazene a -20 °C.
  4. Mídia F12 do Ham's com soro bovino fetal (FBS)
    1. Prepare a solução em temperatura ambiente dentro de um exaustor de fluxo laminar estéril. Adicione 10 mL de soro bovino fetal (FBS) a 40 mL do meio F12 de Ham com antibióticos em um tubo cônico estéril para obter 20% de FBS no meio F12.
    2. Misture suavemente invertendo o tubo de 5 a 10 vezes até que a solução fique homogênea. Filtre esterilize a solução usando um filtro de 0,22 μm em condições estéreis e armazene a 4 °C.
  5. Mídia de expansão MTEC
    1. Prepare o meio de expansão MTEC em temperatura ambiente dentro de um exaustor laminar estéril, combinando os componentes listados na Tabela 1 em um frasco estéril.
    2. Misture bem girando ou invertendo suavemente o recipiente até que todos os componentes estejam totalmente combinados. Esterilize a solução com filtro de 0,22 μm sob condições estéreis.
    3. Adicione o inibidor de ROCK Y–27632 (solução de estoque de 5 mM) a uma concentração final de 10 μM e o inibidor de Notch γ–secretase DAPT (solução de 10 mM) a uma concentração final de 5 μM imediatamente antes do uso, e misture suavemente por inversão.
  6. Mídia de proliferação MTEC
    1. Prepare o meio de proliferação MTEC em temperatura ambiente dentro de uma capuza de fluxo laminar estéril combinando os componentes listados na Tabela 1.
    2. Misture cuidadosamente por inversão suave ou giro até que todos os componentes estejam totalmente combinados. Esterilize o meio com filtro usando um filtro de 0,22 μm em condições estéreis.
    3. Imediatamente antes do uso, adicione o inibidor de ROCK Y–27632 (solução padrão de 5 mM) a uma concentração final de 10 μM e ácido retinoico (solução padrão de 5 μM) a uma concentração final de 0,05 μM. Misture suavemente por inversão antes do uso.
  7. Mídia diferenciação MTEC
    1. Prepare o meio de diferenciação MTEC em temperatura ambiente dentro de um exaustor de fluxo laminar estéril combinando os componentes listados na Tabela 1 em um recipiente estéril.
    2. Misture cuidadosamente por inversão suave ou giro até que todos os componentes estejam totalmente combinados. Esterilize o meio com filtro usando um filtro de 0,22 μm em condições estéreis.
    3. Imediatamente antes do uso, adicione ácido retinóico a uma concentração final de 0,05 μM e misture suavemente por inversão.

2. Isolamento de células epiteliais traqueais de camundongos (MTEC)

  1. Eutanasiar três camundongos adultos (de 8 a 20 semanas de idade) por inalação de dióxido de carbono (CO2) em uma câmara de eutanásia aprovada, de acordo com as diretrizes institucionais da IACUC. Confirme a morte antes da coleta do tecido.
  2. Coloque o animal dorsalmente (peito voltado para cima) sobre uma superfície asséptica. Usando pinças limpas, levante suavemente a pele e corte-a com tesoura cirúrgica do lábio inferior até o abdômen para expor a traqueia.
  3. Afaste as glândulas salivares e remova o tecido conjuntivo e o músculo traqueal para expor os anéis da cartilagem. Disseque todo o comprimento da traqueia e coloque-a em uma placa de Petri contendo o médio estéril Ham's F12. Combine três traqueias em um único prato.
  4. Transfira o prato para um exaustor de fluxo laminar e coloque as traqueias em outro prato com o médio F12 do Presunto fresco. Remova qualquer tecido extratraqueal e corte a traqueia longitudinalmente através do lúmen.
  5. Transfira todas as traqueias para um tubo cônico de 50 mL com tampa roscada contendo uma solução estéril de 10 mL de 0,15% de pronase. Incubar a 4 °C por 16–18 horas.

3. Isolamento celular e expansão inicial

  1. No dia seguinte, inverta o tubo contendo os tecidos 10–15 vezes para desalojar as células epiteliais e incube a 4 °C por 45 minutos. Pare a reação pronase adicionando 10 mL de mídia de Hams contendo 20% de FBS e misture invertendo 10–15 vezes.
  2. Adicione 10 mL de médio F12 da Ham com FBS a três tubos de 15 mL. Com uma pipeta Pasteur, transfira sequencialmente o tecido traqueal do tubo de 50 mL para o primeiro, segundo e terceiro tubo de 15 mL e inverta 10–15 vezes em cada tubo para desalojar as células epiteliais traqueais. Descarte o tecido após a transferência final.
  3. Combine todo o meio dos três tubos cônicos de 15 mL com o meio do tubo de 50 mL. Centrifuge a 360 × g por 10 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 0,5 mL de solução de 0,5 mg/mL de DNase I. Incube no gelo por 5 minutos.
  4. Centrifuge a 360 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda a pastilha celular em 7–10 mL de meio de expansão MTEC.

4. Expansão e diferenciação do MTEC

  1. Prepare um frasco de cultura celular T75 revestido com colágeno usando 10 mL de colágeno I (rabo de rato) a 50 μg/mL e incube a 37 °C por 16–18 horas. Aspire a solução de colágeno do frasco T75 e lave o frasco três vezes com PBS (1×). Deixe o frasco secar completamente.
  2. Semeie a suspensão celular composta por 7–10 mL de meio de expansão MTEC contendo as células no frasco revestido de colágeno. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 °C e 5% deCO2. Troque o meio de expansão a cada 2 ou 3 dias e monitore o número de células até 70% de confluência.
  3. A 70% de confluência, adicione 1 mL de solução de Accutase e incube por 10–15 minutos a 37 °C para destacar a monocamada celular. Resuspenda as células em 10 mL de meio de proliferação MTEC. Centrifuge a 1057 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
  4. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células no meio de proliferação e conte as células.
  5. Semente 2 × 105 células em volume de 0,5 mL por inserto transwell (diâmetro de membrana de 12 mm, tamanho de poro membrana de 0,4 μm) pré-revestida com colágeno. Adicione 1,5 mL de meio à câmara basal de cada inserto e coloque o transwell na incubadora a 37 °C.
  6. Mude o meio tanto na câmara apical quanto na basal no terceiro dia e permite que as células atinjam 100% de confluência, geralmente até o dia 5 ou 6. Inclua um insert sem células como controle.
  7. Uma vez confluente, lave as células apicalmente com 0,5 mL de meio de diferenciação MTEC. Inicie a interface ar-líquido (ALI) adicionando 0,75 mL de meio de diferenciação apenas à câmara basal, deixando as células na câmara apical expostas ao ar.
  8. A cada 2–3 dias, lave as células da superfície apical com meio diferenciador e substitua o meio basal. Deixe as células se diferenciarem na ALI por 21 dias.

5. Imunomarcação e imagem de células epiteliais ciliadas

  1. Nos dias 7, 14 e 21 da ALI, fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4%.
  2. Realizar imunomarcação de células com anticorpo anti-FoxJ1 para detectar FoxJ1, um fator de transcrição essencial para a ciliogênesemóvel 25,26, e anticorpo antiacetilado α–tubulina para detectar α–tubulina acetilada, um marcador estrutural dos cílios móveis segundo protocolospublicados 27,28,29.
    ATENÇÃO: O PFA é um produto químico perigoso, então use o EPI adequado (no mínimo luvas de nitrilo e jaleco) ao fixar as células.
  3. Adquira imagens das células imunomarcadas por microscopia confocal usando um objetivo de 40× ou 60×. Colete Z pilhas com profundidade de 10 μm com cada passo de 0,5 μm.
  4. Ajuste a potência do laser, ganho do detector e configurações de exposição para evitar saturação do sinal e manter parâmetros de aquisição comparáveis entre amostras.
  5. Quantifique as células FoxJ1–positivas ou tubulina-positivas acetiladas como porcentagem do total de células (DAPI–positivo) por região de interesse (ROI) usando o plugin de contador de células no software de imagem FIJI.
  6. No software GraphPad Prism (v. 10.0), gere gráficos e realiza análises estatísticas usando um teste t de Student bidirecionado após avaliar a distribuição dos dados para normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk.

6. Tratamento medicamentoso da epitélia diferenciada das vias aéreas

  1. No dia 21 da ALI, prepare o meio de diferenciação (3 mL para células em três inserções) em um tubo estéril em temperatura ambiente.
  2. Adicione 7,5 μL de dietileno triamina–NONOato ou DETA/NO de uma solução estocada de 100 mM (preparada em 10 mM de NaOH) ao meio de diferenciação para alcançar a concentração final de 250 μM em 3 mL. Misture suavemente por inversão e use imediatamente.
  3. Adicione 750 μL da solução final a cada uma das três câmaras basais de células diferenciadas e incube por 24 horas a 37 °C.
  4. Prepare 1 mM de Nω-Nitro-L-Arginina Éster Metílico (L–NAME) adicionando 30 μL da solução original L-NAME de 100 mM (preparada em DMSO) ao meio diferenciador MTEC, totalizando um volume de 3 mL.
  5. Adicione 750 μL da solução final em cada uma das três câmaras basais e incube por 24 horas a 37 °C.
  6. Adicione apenas 30 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) (grupo não tratado) a 3 mL de meio basal (1% v/v).
  7. Adicione 750 μL da solução final na câmara basal de três inserts (não tratados).

7. Coleta de amostras

NOTA: Para a análise de NOA, é necessário agrupar amostras de mídia, lavagem apical e lisado celular de três inserções.

  1. No dia 22 da ALI, colete amostras dos epitélios diferenciadores das vias aéreas começando com 750 μL de meio basal de cada um dos três insertos por grupo experimental.
  2. Coletar meios basais incubados em inserções sem células para servir como controle em branco, considerando possível contaminação externa por nitritos.
  3. Agrupe o meio basal de três inserts e armazene imediatamente a -20 °C até a injeção no NOA.
  4. Para coletar o nitrito/NO presente no muco apical do epitélio, adicione 50 μL de PBS (1×) tampão pré-aquecido (estéril, aliquotado e congelado) sobre as células de cada inserto e incube por 30 minutos a 37 °C.
    NOTA: Durante os 30 minutos de incubação das células com PBS para coletar lavagem apical, PBS também pode ser adicionado na câmara basal para manter a hidratação em ambos os lados das células.
  5. Colete o PBS contendo o muco sobre o epitélio.
  6. Agrupe as lavagens de PBS de três inserts para obter cerca de 150 μL de muco apical/PBS de cada condição experimental, o que será suficiente para duas injeções de NOA.
  7. Armazene as amostras de lavagem apical a -20 °C até o uso adicional.
  8. Armazene também o buffer de lavagem PBS para uso como controle em branco durante as injeções de NOA.
  9. Lave os lados apical e basal das células em três inserções com 500 μL de PBS pré-aquecido duas vezes.
  10. Adicione 500 μL de solução de Accutase apicalmente e incube por 15–20 minutos até que as células se desprendam completamente das membranas.
  11. Uma vez totalmente descolada, adicione meio RPMI-1640 sem soro às células (na proporção de meio 3:1 para Accutase).
  12. Agrupe as células destacadas dos três inserts em um único tubo.
  13. Gire as células a 3000 × g por 5 minutos a 4 °C.
  14. Resuspenda o pellet celular em 50 μL de solução de lise (buffer RIPA + Halt 1× coquetel inibidor de protease) e incube no gelo por 45 minutos.
  15. Centrifuge o lisado a 14.800 × g por 20 minutos a 4 °C e colete o sobrenadante.
  16. Use 3 μL de lisado de célula inteira para determinar a concentração de proteína por meio do ensaio de Ácido Bicinchonínico (BCA).
  17. Dilua a solução de lisado restante 1:1 no buffer RIPA para obter volume suficiente para duas injeções de NOA de 50 μL.
  18. Armazene os lisados a -80 °C até injetar no NOA a -20 °C.
  19. Armazene o buffer RIPA usado para resuspender o pellet celular a -20 °C para ser usado como blank e controle de contaminação para amostras de lisato.

8. Calibração do NOA e injeções de amostras

  1. Prepare o reagente triiodeto dissolvendo 400 mg de iodeto de potássio e 250 mg de iodo em 28 mL de ácido acético glacial e 8 mL de água ultrapura.
  2. Realize a preparação do reagente triiodeto em uma exaustão química usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas e proteção ocular).
    ATENÇÃO: Iodo e ácido acético glacial são perigosos e podem causar irritação e corrosão na pele e nos olhos.
  3. Armazene em temperatura ambiente e use dentro de 2 semanas após o preparo.
  4. Prepare 1 mM de solução de estoque de nitrito de sódio em água sem nitritos.
  5. Armazene a solução original a -20 °C até o uso.
  6. Prepare novos padrões de trabalho (0,125–4,0 μM) em PBS imediatamente antes das injeções.
    NOTA: Para calibração do NOA, use PBS estéril e com tampa firme para minimizar a contaminação por nitritos.
  7. Ligue o gás transportador de nitrogênio (N2) e inicie o fluxo de gás pelo sistema.
  8. Monte o recipiente de purga de vidro e adicione 4 mL de reagente triiodeto no recipiente com 20 μL de espuma anti-espuma diluída 1:10.
  9. Tape firmemente com um septo preso pelo tampa para garantir uma vedação hermética.
  10. Despeje 10 mL de hidróxido de sódio (NaOH) no sifão de NaOH.
  11. Na tela do instrumento NOA (nCLD 88), selecione Medição, selecione Gás e Fogo.
  12. Ajuste o instrumento para MR2:50,00, correspondente a uma faixa de medição entre 0 e 50 partes por bilhão de NO, e selecione Rápido para ajuste do filtro.
  13. Ajuste a pressão do gás nitrogênio até que a pressão do reator se estabilize entre 27–29 psi (186–200 kPa).
  14. Abra o software de gráficos eDAQ no computador conectado ao NOA.
  15. Ajuste a faixa de aquisição para 10/s e a tensão para 10 V.
  16. Navegue até Configuração > Configurações de Canal, selecione Canal 1.
  17. Defina a escala de exibição para 2:1 no software NOA.
  18. Inicie a aquisição de dados no instrumento da NOA e no software.
  19. Monitore a linha de base até que ela estabilize.
  20. Injete 10 μL de PBS através do septo no vaso de purga usando uma seringa Hamilton para confirmar a estabilidade basal.
  21. Registre o sinal quimioluminescente de cada injeção.
  22. Injete 10 μL do padrão de nitrito de 0,125 μM no recipiente de purga.
  23. Repita duas vezes para cada padrão de nitrito, para obter medições duplicadas que serão posteriormente promediadas.
  24. Anote cada injeção na aba de Comentários (por exemplo, 10 μL 0,5 μM nitrito).
  25. Limpe a seringa em um papel sem fiapos e enxágue 3 a 4 vezes com água estéril sem nitrito para remover o excesso de triiodeto.
  26. Repita essa etapa de limpeza após cada injeção.
  27. Permita que o sinal retorne ao nível de base entre as injeções (20–30 s).
  28. Abra a janela de Análise de Fluxo .
  29. Revise os valores de altura e tempo de pico para cada injeção na tabela de análise.
  30. Destaque cada pico e ajuste a seleção para calcular a área sob a curva (AUC).
  31. Alterne o display de S para C para ativar o modo de calibração.
  32. Insira as quantidades conhecidas de nitrito para cada padrão na coluna Quantidade .
  33. Clique no botão Curva de Calibração para gerar a curva padrão.
  34. Verifique se a curva de calibração atende aos critérios de aceitação (R2 ≥ 0,99).
  35. Descongelar amostras biológicas anteriormente coletadas de culturas ALI no gelo.
  36. Injete 50 μL de meio sem células em branco no vaso de purga.
  37. Injete 50 μL de cada amostra de meio basal no vaso de purga.
  38. Registre o sinal de quimioluminescência para cada injeção.
  39. Realize injeções duplicadas (50 μL cada) para cada amostra.
    NOTA: As injeções de 50 μL resultam na formação frequente de bolhas. Para limitar esse problema, substitua regularmente o reagente triiodeto por antiespuma no vaso de purga.
  40. Anote cada amostra na aba de Comentários antes da injeção.
  41. Injete 50 μL de PBS sem células (blank apical) no vaso de purga.
  42. Injetar amostras de lavagem apical (duas injeções de 50 μL por amostra) e registrar os picos correspondentes de sinal.
  43. Injetar o buffer RIPA duas vezes, seguido por amostras de lisado (duas injeções de 50 μL por amostra) e registrar os picos de sinal correspondentes.
    NOTA: Sempre permita que o traço quimioluminescente volte à linha de base e se estabilize. Espere 20–30 segundos, então injete a próxima amostra.
  44. Ao final das injeções de amostras, abra a janela de Análise de Fluxo .
  45. Destaque cada pico amostral para calcular a área sob a curva (AUC).
  46. Determine as concentrações de nitrito para cada amostra usando a curva de calibração gerada a partir de soluções padrão.

9. Coleta, normalização e análise de dados

  1. Exporte os dados, incluindo altura de pico (V), área sob a curva (V.s) e área média sob a curva, a partir da função de Análise de Fluxo no software eDAQ para um arquivo Excel. O arquivo exportado irá tabular a altura (V) versus o tempo(s) dos traços de sinal para todo o experimento NOA.
  2. Determine os picomoles (pmol) de nitrito injetados no NOA multiplicando a concentração de nitrito (μM) pelo volume de injeção (μL).
  3. Faça a média dos picomoles (pmol) de nitrito medidos nos controles (mídia livre de células, tampão de lavagem PBS ou tampão RIPA).
  4. Subtraia os valores de controle correspondentes do PMOL medido em cada injeção de amostra de 50 μL.
  5. Determine o total de picomoles (pmol) de nitrito em cada amostra multiplicando o pmol medido na porção injetada da amostra pelo volume total exato coletado. Use 750 μL para o meio, 150 μL para a lavagem apical e cerca de 90–100 μL para o lisado.
  6. Além disso, apenas para lisados, multiplique o pmol total de nitrito por 2 para considerar o fator de diluição.
  7. Normalize o pmol de nitrito obtido para cada amostra dividindo esses valores pela quantidade total de proteína (μg) presente no lisado da amostra correspondente, obtida anteriormente pelo ensaio BCA.
  8. Faça a média dos níveis de nitrito (pmol/μg) de injeções duplicadas para cada amostra.
  9. Plote os níveis normalizados de nitrito (pmol/μg de proteína total) para cada amostra usando o software GraphPad Prism.
  10. Avalie a distribuição dos dados para normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk.
  11. Realize uma análise estatística usando um teste t dos alunos de duas caudas.

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Resultados

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os níveis de óxido nítrico (NO) em culturas de células epiteliais traqueais de camundongos (MTEC) diferenciadas na interface ar–líquido (ALI). As células primárias são isoladas e diferenciadas de acordo com protocolosestabelecidos 27,28. Ao longo de 21 dias na ALI, as células são diferenciadas em um epitélio pseudoestratificado das vias aéreas contendo célulascil...

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Discussão

Células multi-ciliadas dentro do epitélio das vias aéreas são críticas para a síntese e sinalização de NO, o que por sua vez é essencial para regular o batimento ciliar, a limpeza mucociliar e a homeostase das viasaéreas 6,7,8. O NO é uma molécula altamente reativa e até pequenas mudanças nos níveis de NO estão associadas a doenças das viasaéreas

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Mark T. Gladwin (Reitor e Professor da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland) pela orientação sobre o desenho do estudo. Também agradecemos ao Núcleo de Microscopia Confocal da Escola de Medicina da Universidade de Maryland (Baltimore, MD) pelo acesso aos recursos de microscopia confocal. Esse trabalho foi apoiado pela bolsa 5R01HL168775 do National Institutes of Health (NIH) à Dra. Paola Corti.

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Materiais

```html
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248diluted 1:2000 for immunostaining
50 mL Centrifuge tube filter (0.22 µm)CellTreat229710Para preparação de soluções estéreis
500 mL Filter unitsThermoFisher Scientific566-0020Para preparação de mídia estéril
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovine Pituitary ExtractThermoFisher Scientific13028014
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
Cholera toxinSigmaC8052
Collagen IThermoFisher ScientificA1048301
Confocal MicroscopeNikonW1 Spinning disk Ti2 inverted microscope with Hamamatsu sCMOS camera
Corning Transwell insertsSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 mediaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Halt 1X Protease inhibitor cocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765054
Insulin solutionSigmaI0516
Isoproterenol hydrochlorideSigmaI6504
Keratinocyte Serum-free mediaThermoFisher Scientific17005042
Murine Epidermal growth factorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphate buffer saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Retinoic acidSigmaR2625
Rho kinase inhibitor (Y-27632 hydrochloride)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA bufferSigmaR0278
RPMI-1640 mediaThermoFisher Scientific11875093
Sodium nitrite SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylated tubulin antibody (mouse)SigmaT6793diluted 1:200 for immunostaining
α-FoxJ1 antibody (mouse)ThermoFisher Scientific14-9965-80diluted 1:200 for immunostaining
α-mouseCy3 secondary antibodyThermoFisher ScientificA10521diluted 1:1000 for immunostaining
γ-secretase inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942
```

Referências

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