Um Fluxo de Trabalho para Visualizar a Dinâmica Conformacional de Proteínas a partir de Mapas Crio-EM Usando Asparagina Sintase Humana

Summary

Este protocolo descreve como realizar análise de variabilidade 3D (3DVA) no CryoSPARC e refinamento de variabilidade no Phenix para analisar a heterogeneidade conformacional em dados crio-EM. Usando a asparagina sintetase humana como exemplo, ela descreve como gerar mapas de variabilidade, visualizar componentes principais e refinar modelos atômicos correspondentes.

Abstract

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho abrangente para analisar a heterogeneidade conformacional em dados de microscopia crioeletrônica de partícula única (cryo-EM) utilizando análise de variabilidade 3D (3DVA) no CryoSPARC e refinamento de variabilidade no Phenix. O protocolo descreve como calcular mapas de variabilidade ao longo dos componentes principais derivados de imagens de partículas, visualizar modos principais de variação estrutural e refinar conjuntos correspondentes de modelos atômicos contra referenciais individuais de variabilidade. Os resultados resultantes incluem uma série de mapas de variabilidade 3D, estruturas atômicas multimodelo refinadas representando estados conformacionais discretos e arquivos de visualização adequados para análise estrutural comparativa e geração de filmes. Esse fluxo de trabalho é amplamente aplicável a reconstruções crio-EM na faixa de resolução (tipicamente ~2,0-6,0 Å), onde a heterogeneidade conformacional pode ser interpretada de forma significativa nos níveis da espinha dorsal e da cadeia lateral. É particularmente adequado para capturar movimentos contínuos no domínio, movimentos de dobra da dobradiça e rearranjos locais coordenados que não são facilmente resolvidos apenas por classificação discreta. O uso combinado de mapas de variabilidade e conjuntos de modelos refinados permite a comparação estrutural direta dos extremos conformacionais, apoia análises quantitativas como cálculos de flutuação raiz-media-quadrático (RMSF) e fornece uma estrutura para vincular características estruturais dinâmicas a hipóteses bioquímicas ou funcionais. A asparagina sintetase humana (ASNS) é usada como exemplo para demonstrar a implementação prática do fluxo de trabalho.

Introduction

Caracterizar a heterogeneidade conformacional em estruturas macromoleculares é um aspecto cada vez mais importante da análise de crio-microscopia eletrônica de partícula única (crio-EM). O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho prático para extrair, visualizar e refinar modos dominantes de variabilidade estrutural diretamente a partir de conjuntos de dados crio-EM, utilizando análise tridimensional de variabilidade (3DVA) no CryoSPARC¹ combinada com refinamento de variabilidade no^{Phenix 2}. Este artigo tem como objetivo orientar os leitores a determinar se essa abordagem computacional é adequada para seus dados e a entender os tipos de saídas geradas pelo fluxo de trabalho.

Técnicas experimentais tradicionais (por exemplo, troca hidrogênio-deutério, espectroscopia de RMN, espectrometria de massas) fornecem informações valiosas sobre os movimentos das^{proteínas 3,4,5}, mas frequentemente são limitadas pelo tamanho molecular, requisitos da amostra ou complexidade experimental. Avanços em crio-EM permitiram a determinação de estruturas de alta resolução para sistemas grandes e heterogêneos, possibilitando a análise da variabilidade conformacional dentro de populações de partículas. A análise de variabilidade 3D (3DVA), implementada no CryoSPARC¹, decompõe conjuntos de dados de partículas crio-EM em componentes principais que descrevem modos dominantes e contínuos de variação estrutural. Quando combinada com o refinamento de variabilidade em^{Phenix 2}, essa abordagem produz modelos atômicos correspondentes a posições discretas ao longo de cada componente principal, permitindo visualização e comparação de conformações alternativas derivadas de dados experimentais.

Esse protocolo é mais adequado para conjuntos de dados crio-EM reconstruídos em resolução próxima a atômica intermediária (tipicamente ~2-6 Å). Em resoluções mais altas, o fluxo de trabalho pode capturar rearranjos da espinha dorsal e variabilidade limitada da^{sidechain 6}, enquanto em resoluções mais baixas é mais apropriado para identificar movimentos em nível de domínio ou estrutura^{secundária 2,7}. O método é adequado para capturar modos dominantes e contínuos de movimento que estão amplamente povoados no conjunto de dados, como movimentos de dobradiça, respiração de domínio ou rearranjos coordenados entre domínios ou subunidades. Números adequados de partículas e cobertura angular são essenciais, e a interpretação pode ser limitada em regiões flexíveis ou fracamente resolvidas onde as posições das cadeias laterais permanecem ambíguas. Comparado com estratégias de classificação⁸ focadas ou subclassificação extensiva, o fluxo de trabalho de refinamento da variabilidade 3D representa a heterogeneidade conformacional como trajetórias contínuas, e não classes discretas. Isso torna o método particularmente útil para a análise exploratória de enzimas, máquinas moleculares e complexos multidomínio que se espera amostrem múltiplas conformações.

A asparagina sintetase humana (ASNS) é usada como exemplo ilustrativo para demonstrar a implementação do protocolo. ASNS é uma amidotransferase dependente de glutamina composta por dois domínios funcionais conectados por um túnel de amônia^{intramolecular 9,10}. Estudos anteriores sugeriram que mudanças conformacionais envolvendo resíduos como o Arg-142 contribuem para a modulação desse^{túnel 6}. Neste artigo, o ASNS serve exclusivamente como um sistema representativo para demonstrar como o refinamento 3DVA e a variabilidade geram mapas de variabilidade, conjuntos refinados de modelos atômicos e visualizações. A interpretação mecanicista detalhada é relegada às seções de Resultados e Discussão. Embora simulações de dinâmica molecular (MD) sejam frequentemente usadas como uma abordagem complementar para explorar paisagens^{conformacionais 11,12}, a MD não é necessária para este protocolo. Comparações com simulações MD podem ser realizadas como uma análise opcional a jusante, mas o fluxo de trabalho descrito aqui (Figura 1) foca exclusivamente na extração e visualização da heterogeneidade conformacional a partir de dados crio-EM.

Figura 1. Visão geral do fluxo de trabalho. Um mapa crio-EM consensual é reconstruído a partir de dados de partícula única e submetido à análise de variabilidade tridimensional (3DVA) para gerar mapas de variabilidade ao longo dos componentes principais. O refinamento de variabilidade (Phenix.varref) utiliza o modelo atômico de consenso para gerar modelos atômicos correspondentes para visualização e comparação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocol

1. Preparação de dados

1. Geração de mapa EM consensual
   1. Use a microscopia crio-eletrônica de partícula única (crio-EM) para determinar a estrutura 3D consensual do complexo macromolecular.
   2. Vitrifice amostras em crio-redes e capture usando um microscópio eletrônico de transmissão de alta tensão equipado com um detector direto de elétrons.
   3. Processe os filmes coletados para corrigir o movimento induzido pelo feixe, estimar parâmetros de imagem e selecionar imagens de partículas.
   4. Realize classificação iterativa e refinamento das partículas para gerar um mapa EM consensual.
   5. Realize o processamento de dados usando CryoSPARC (v4 ou superior⁾¹³, já que a análise de variabilidade 3D (3DVA) será implementada.
2. Gerar um modelo de consenso
   1. Construa um modelo atômico e o refine em relação ao mapa de consenso. Valide a qualidade refinada do modelo usando critérios padrão
      NOTA: Para ASNS, a estrutura foi determinada usando uma estratégia de seleção de partículas baseada em templates. Um molde derivado da estrutura de raios X do ASNS humano modificado por DON (PDB 6GQ3)⁹foi usado para selecionar eficientemente partículas de alta qualidade no CryoSPARC¹³. Essas partículas passaram por rodadas iterativas de classificação 2D, reconstrução Ab initio e refinamento heterogêneo e não uniforme com simetria C2 imposta, resultando em um mapa consensual de 3,5 Å. O modelo atômico foi gerado usando a estrutura^{cristalina 9} no mapa EM, seguido por refinamento em espaço real em Phenix^14,15 e ajuste manual em Coot¹⁶, produzindo a estrutura ASNS consensual final conforme^{descrito 6}.

2. Realização de análise de variabilidade 3D (3DVA)

1. Use a pilha de partículas e a máscara (não um mapa final refinado) para um refinamento final
   NOTA: Frequentemente, os resultados de um trabalho de refinamento não uniforme são usados para 3DVA.
2. Crie um trabalho de Variabilidade 3D no CryoSPARC. Entrada pilha de partículas e máscara do trabalho de refinamento não uniforme.
3. Defina o número de modos a resolver: número de componentes principais (PCs) em 5.
   NOTA: Como estruturas macromoleculares existem no espaço tridimensional, geralmente são necessários pelo menos três PCs para descrever seus principais modos espaciais de movimento. Para garantir que variações conformacionais adicionais, potencialmente menores, mas funcionalmente relevantes, não fossem negligenciadas, dois PCs adicionais foram incluídos.
4. Defina a resolução do filtro para 4,0 Å e a resolução passa-alta para 20. Deixe todos os outros parâmetros como padrão. Comece o trabalho.
   NOTA: A "resolução do filtro" de 4,0 Å foi definida para corresponder à qualidade geral do conjunto de dados, evitando o sobreajuste a ruídos de alta frequência. Como o mapa de consenso final foi determinado em resolução de 3,5 Å, aplicar uma resolução de filtro um pouco menor (4,0 Å) garantiu que a análise de variabilidade focasse em movimentos estruturais genuínos, e não em ruído próximo ao limite de resolução.
5. Obtenha um conjunto de volumes de variabilidade como saída (Figura 2A)

3. Realização de exibição de variabilidade 3D

1. Crie um trabalho de Exibição de Variabilidade 3D no CryoSPARC para visualizar as mudanças conformacionais contínuas identificadas pelo 3DVA.
2. Insira a pilha de partículas e os volumes de variabilidade gerados pelo trabalho 3DVA.
3. Selecione Simples como modo de saída (veja abaixo).
4. Defina a resolução do filtro em 4.0 e a resolução passa-alta em 20. Deixe todos os outros parâmetros em seus valores padrão. Comece o trabalho.
5. Obtenha 20 mapas de variabilidade como resultado (frame 0 a 19) correspondentes a 5 componentes principais (PC) de 0 a 4 (Figura 2B)
   NOTA: O "modo simples" no programa 3D Variability Display fornece uma visualização direta das mudanças conformacionais ao longo de cada componente principal. Esse modo gera trajetórias lineares entre os estados extremos identificados pela 3DVA, permitindo uma interpretação clara e direta dos movimentos dentro da população de partículas.

4. Preparação de dados para filmes e refinamento de variáveis 3D com Phenix

1. Baixe mapas de variabilidade 3DVA: Baixe os arquivos zip contendo mapas de variabilidade para PCs 0-4 (cinco zips no total) do CryoSPARC.
2. Organizar diretórios: Crie uma pasta pai (por exemplo, 3DVA/). Dentro, crie uma subpasta para cada componente principal (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Mova cada zip para a pasta correspondente e descompacte o conteúdo.
4. Confirme que cada pasta contém 20 mapas de variabilidade (frames 0-19) e repita para comp1-comp4.
   NOTA: Mantenha pastas separadas para cada componente principal para evitar a mistura de quadros entre PCs.

5. Prepare filmes rápidos na UCSF Chimera (Opcional) ¹⁷

1. Abra a ferramenta Série de Volumes: Inicie o Chimera, depois navegue para Ferramentas → Dados de Volume → Série de Volumes. Uma nova janela da Série de Volumes será aberta.
2. Carregue os mapas: Clique em Abrir e selecione os 20 mapas correspondentes a um componente principal (por exemplo, comp0).
3. Ajuste os parâmetros de visualização: Abra o Visualizador de Volume, defina o limite de densidade apropriado e atribua uma cor ao mapa.
   NOTA: Neste exemplo, foi usado azul celeste (Figura 3).
4. Movimento de pré-visualização: Na janela da Série de Volume , defina a direção de Reprodução para Oscilar, depois clique em Reproducir para exibir uma transição contínua do quadro 0 → 19 → 0.
5. Repita para componentes adicionais: Repita os Passos 5.2-5.4 para outros componentes principais conforme necessário.
6. Gerar um arquivo de filme usando entrada de linha de comando: Exportar um filme abrindo a linha de comando do Chimera e executando o Arquivo de Codificação Suplementar 1.
   NOTA: A série mrc por componente e 20 quadros (por exemplo, compX_frame000-019.mrc) são as entradas para o refinamento de variáveis 3D Phenix. Mantenha as pastas de componentes separadas (comp0-comp4) para evitar misturar quadros entre PCs.

6. Geração de modelos por refinamento de variabilidade em phenix

NOTA: Phenix.varref pode ser executado a partir de qualquer diretório, desde que os caminhos completos para os mapas de entrada e modelo estejam especificados. No entanto, para clareza organizacional, recomenda-se realizar o refinamento em um subdiretório dedicado para cada PC.

1. Copie o arquivo final refinado do modelo de consenso para o subdiretório correspondente a cada PC.
2. De dentro de cada subdiretório, execute Phenix.varref pela linha de comando usando a seguinte sintaxe:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolução=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Defina a resolução para 4,0 Å para corresponder à resolução efetiva dos mapas 3DVA
4. Defina nproc para o número de processadores disponíveis (20 neste exemplo, mas isso pode variar dependendo dos recursos computacionais disponíveis)
5. Defina models_per_map para 50 modelos (padrão).
   NOTA: Para cada mapa, 50 modelos são gerados com restrições ajustadas à resolução dos dados 3DVA. O modelo mais adequado para cada mapa é automaticamente mantido. O arquivo de saída resultante contém 20 modelos refinados correspondentes aos 20 mapas de variabilidade. A saída consiste em um conjunto PDB contendo 20 modelos refinados, juntamente com arquivos de mapas individuais.
6. Não aplique sharpening adicional do mapa durante o refinamento da variabilidade. Use os mapas de variabilidade gerados pelo CryoSPARC (filtrados em 4,0 Å) diretamente como entradas para phenix.varref.

7. Visualização

1. Abra o pacote PDB no ChimeraX¹⁸ para carregar todos os 20 modelos refinados simultaneamente.
2. Use o painel Modelos para exibir seletivamente quadros individuais ou modelos específicos de interesse para comparação e análise (Figura 4). Alternativamente, cada modelo refinado também pode ser aberto individualmente no ChimeraX ou Chimera.

8. Preparação de dados para análise

NOTA: Executar a sintaxe acima gera um pacote PDB contendo modelos de 20 variáveis e cada mapa individual. Para a maioria das análises, apenas dois modelos — correspondentes ao quadro 0 e ao quadro 19 — são necessários, pois eles representam os dois estados conformacionais extremos ao longo do componente principal (PC) selecionado.

1. Abra o pacote PDB no ChimeraX, selecione modelo 1.1 (quadro 0) e modelo 1.20 (quadro 19) e salve cada modelo como um arquivo PDB separado (Figura 4).
2. Edite os arquivos PDB resultantes para isolar os resíduos de interesse. Isso pode ser feito manualmente ou usando o Phenix.pdb.tools.
3. Compare os dois arquivos PDB modificados para identificar mudanças conformacionais na backbone ou sidechains.
4. Para comparar os dois modelos PDB, sobreponha-se as estruturas modificadas usando a função MatchMaker em Chimera.
   NOTA: Para alinhamento confiável, o MatchMaker normalmente requer pelo menos 10-15 resíduos sobrepostos. No nosso caso, apenas 6 resíduos foram analisados; no entanto, a superposição bem-sucedida foi alcançada aproveitando a natureza homodimérica do ASNS — enquanto apenas 6 resíduos permaneciam na cadeia A, a cadeia B permanecia intacta e servia como referência para o alinhamento.

Results

Esta seção apresenta resultados representativos gerados pelo fluxo de trabalho de análise de variabilidade 3D (3DVA) e refinamento de variabilidade, além de fornecer orientações sobre sua interpretação. A asparagina sintetase humana (ASNS) é usada como um conjunto de dados ilustrativo para demonstrar resultados bem-sucedidos, artefatos comuns e análises comparativas possibilitadas pelo protocolo. O conjunto completo de mapas de variabilidade derivados da 3DVA e os modelos refinados correspondentes gerados a partir dos co...

Discussion

Etapas críticas do protocolo e pontos de decisão
O uso eficaz desse protocolo depende de várias etapas importantes do fluxo de trabalho. A qualidade da pilha de partículas e da máscara usada para o refinamento crio-EM final é crítica, já que a análise de variabilidade 3D (3DVA) opera diretamente nessas entradas, em vez de em um mapa pós-processado. A seleção do número de componentes principais (PCs) deve refletir o tamanho do conjunto de dados e a complexidade esperad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	Software para processamento crio-EM
Phenix v1.24+	Consórcio Phenix	https://phenix-online.org	Software para refinamento de variabilidade
UCSF Chimera	Recursos para Biocomputação, Visualização e Informática, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Software para Visualização Molecular
UCSF ChimeraX	Recursos para Biocomputação, Visualização e Informática, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software para Visualização Molecular
CPPTRAJ	Suíte de software de dinâmica molecular AMBER	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Ferramentas Python para cálculo de RMSF
Linux (sistema baseado em GPU montado internamente)
Caixa da Estação de Trabalho	Supermicro	https://www.supermicro.com	Gabinete de estação de trabalho: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	CPU: XEON E5-2690V3 x2
Placa-mãe	Supermicro	https://www.supermicro.com	Placa-mãe: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Placa-Mãe X10DAI-O
Memória	Crucial	https://www.crucial.com	Memória: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC Registrado. Memória de Servidor de 288 pinos CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Disco rígido	Western Digital	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE, disco rígido corporativo de 4TB
CONTROLADOR DE RAID	Lógica LSI	https://www.broadcom.com	CONTROLADOR RAID: LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i Kit
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Placa de vídeo Quadro M6000 com 24 GB de memória GDDR5