Caracterização da Ataxia Induzida por Tumor em um modelo de camundongo vestibular Schwannoma

Resumo

Desenvolvemos um painel de ensaios comportamentais para estudar a ataxia induzida por tumores e avaliar terapias que preservam a função neurológica em um modelo murino de schwannoma vestibular.

Resumo

A schwannomatose relacionada a NF2 (NF2-SWN) é uma síndrome de predisposição tumoral autossômica dominante causada por mutações germinativas no gene supressor tumoral NF2. A doença é caracterizada pelo desenvolvimento de schwannomas vestibulares bilaterais (SVV), que aumentam progressivamente e resultam em perda auditiva, desequilíbrio e ataxia — sintomas que afetam profundamente a qualidade de vida dos pacientes. Atualmente, não há tratamentos farmacológicos aprovados pela FDA disponíveis. Entre os déficits neurológicos, a ataxia continua sendo uma manifestação particularmente debilitante, porém pouco estudada, em grande parte devido à falta de modelos pré-clínicos robustos para sua avaliação. Neste estudo, desenvolvemos um conjunto de ensaios comportamentais para avaliar sistematicamente a ataxia induzida por tumores em um modelo camundongo ortotópico de perda auditiva e ataxia associadas ao VS. Esses testes permitem a medição quantitativa de déficits de equilíbrio e coordenação motora decorrentes da carga tumoral. Esta plataforma experimental possibilita estudos mecanicistas de disfunção cerebelosa induzida por tumores e fornece uma ferramenta valiosa para avaliação pré-clínica de estratégias terapêuticas. Ao integrar avaliações comportamentais com biologia tumoral e testes auditivos, essa abordagem facilita a caracterização tanto dos efeitos do tratamento supressor quanto neuroprotetor. Em última análise, esses ensaios oferecem uma estrutura versátil que também pode ser aplicada a outros distúrbios neurológicos caracterizados por ataxia, expandindo sua utilidade além do NF2-SWN.

Introdução

A schwannomatose relacionada a NF2 (NF2-SWN) é uma síndrome rara e hereditária de predisposição tumoral, causada por mutações no gene supressor de tumor NF2, que codifica a proteína citoesquelética merlin¹. A perda da função Merlin interrompe as vias de sinalização que regulam a proliferação celular, adesão e sobrevivência, predispondo indivíduos afetados ao desenvolvimento de múltiplos tumores benignos do sistema nervoso. A marca registrada do NF2-SWN é a formação de esclonomas vestibulares bilaterais (VSs) - tumores não malignos derivados de células de Schwann que surgem ao longo dos nervos vestibulococleares. Esses tumores aumentam progressivamente, comprimindo estruturas neurais adjacentes e levando à perda auditiva neurosensorial, zumbido e disfunção do nervo^{facial 2}.

Pacientes com SVs bilaterais frequentemente sofrem danos progressivos ao nervo vestibular e ao aparelho vestibular do ouvido interno, resultando em disfunção vestibular debilitante manifestada como desequilíbrio crônico, ataxia e instabilidade da marcha, que prejudicam severamente a mobilidade e a qualidade^{de vida 3}. O grau de disfunção vestibular frequentemente está correlacionado com a carga tumoral e o envolvimento nervoso. Esses sintomas frequentemente persistem mesmo após esforços de controle tumoral ou preservação auditiva, sugerindo mecanismos neurobiológicos complexos além da compressão^{mecânica 4,5}. Embora ferramentas clínicas como inventários de deficiência de tontura, análise da marcha, testes de reflexo vestíbulo-ocular (VOR) e posturografia sejam usados para quantificar a deterioração vestibular, os mecanismos subjacentes da ataxia induzida por tumores continuam sendo pouco^{compreendidos 3}. Apesar dos avanços no entendimento molecular e da introdução de terapias direcionadas como o bevacizumabe, ainda não existe um tratamento aprovado pela FDA que preserve de forma confiável tanto a função auditiva quanto o de equilíbrio em pacientes com NF2-SWN. O manejo dos sintomas vestibulares permanece em grande parte de apoio, destacando uma grande necessidade clínica não atendida.

Uma grande barreira para melhorar o manejo clínico da ataxia associada ao VS é a falta de modelos pré-clínicos que reproduzam fielmente os déficits de coordenação vestibular e motora observados nos pacientes. A maioria dos modelos animais existentes de SV foca no crescimento tumoral ou perda auditiva, sem recapitular as características prejuízos de equilíbrio e coordenação. Além disso, ensaios comportamentais padronizados para avaliar objetivamente ataxia e disfunção vestibular em ambientes pré-clínicos não estão bem estabelecidos. Essa lacuna dificulta a investigação mecanicista e limita a avaliação de terapias candidatas voltadas para preservar a função vestibular.

Aqui, relatamos o desenvolvimento de um modelo de camundongo VS que apresenta fenótipos mensuráveis de ataxia, juntamente com um painel de ensaios comportamentais especificamente projetados para quantificar a ataxia induzida por tumores. Esse modelo oferece uma plataforma muito necessária para investigar os mecanismos subjacentes à disfunção vestibular associada ao VS e para avaliar a eficácia de intervenções terapêuticas voltadas para restaurar o equilíbrio, a coordenação e a função neurológica geral em pacientes com NF2-SWN.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do General Brigham de Massachusetts (MGB).

1. Modelo animal

1. Inocular células Nf2^-/- (células murinas Nf2^-/- que expressam o gene repórter da luciferase Gaussia, Gluc) em camundongos C57/FVB imunocompetentes. Usando um dispositivo de injeção estereotáxica (Figura 1A), injete cada camundongo com 1 μL de 2.500 células tumorais na região CPA do hemisfério^{direito 4,6}.
2. Use tanto camundongos machos quanto fêmeas (proporção 1:1) entre 8 e 12 semanas de idade para garantir poder estatístico suficiente e examinar possíveis diferenças relacionadas ao sexo. Camundongos domésticos em grupos de 4 por gaiola durante um ciclo de 12 horas de luz/escuro, com comida e água disponíveis ad libitum.
   NOTA: Considerando que os schwannomas se desenvolvem nos nervos vestibulares dos pacientes, empregamos o modelo do ângulo cerebelopontino (CPA). O modelo CPA recapitula o microambiente intracraniano dos VSs.
3. Grupo simulado: Para avaliar os efeitos da cirurgia animal e da implantação de células tumorais na ataxia, inclua um grupo de cirurgia simulada, no qual camundongos passaram por cirurgia simulada e injeção de soro fisiológico na região da CPA.
4. Inclua um grupo de camundongos sem tumores como controle.
5. Para monitorar a progressão tumoral, utilize células ^Nf2-/- que expressem o gene repórter da Gaussia luciferase (Gluc) e meça a Gluc plasmático a cada 3 dias após a implantação.
6. Brevemente, colete 13 μL de sangue nos tubos EDTA para evitar a coagulação. Transfira a amostra de sangue para uma placa de 96 poços e meça a atividade da Glúcia conforme descrito^{anteriormente} 6,7,8,9.

2. Testes de ataxia

1. Realize os quatro ensaios comportamentais em uma sequência fixa para minimizar a variabilidade entre os animais. Realize os testes na seguinte ordem: (1) teste de abraçadamento dos membros posteriores, (2) teste de borda, (3) avaliação da marcha e (4) avaliação da cifose. Permita um intervalo mínimo de descanso de 2 a 5 minutos entre os testes, retornando o rato à gaiola de origem. Monitore o animal durante os períodos de descanso e prossiga para o próximo teste apenas quando o comportamento exploratório normal recomecer. Interrompa o teste se forem observados sinais de estresse excessivo ou fadiga. Complete o conjunto completo de quatro ensaios de ataxia para uma coorte de 10 camundongos em aproximadamente 45-60 minutos, incluindo intervalos de repouso entre os testes.
2. Teste de aperto dos membros posteriores
   NOTA: O teste de abraçamento dos membros posteriores avalia coordenação neuromuscular, tônus motor e controle postural em camundongos. Ratos com ataxia apresentam retração dos membros posteriores ou agarrões em direção ao abdômen, refletindo coordenação motora prejudicada e regulação do tônus^{muscular 5}.
   1. Segure o rato suavemente pela base da cauda, garantindo uma pegada segura e leve para evitar desconforto. Apoie o animal brevemente na tampa ou na mão da gaiola antes de levantar para reduzir a resposta de susto.
   2. Levante o rato lentamente para que ele fique suspenso no ar, com o corpo totalmente estendido e livre de obstáculos. Mantenha o rato pelo menos 10 cm acima da gaiola ou superfície de teste.
   3. Mantenha a posição suspensa por aproximadamente 10 segundos e observe a posição dos membros posteriores e da cauda sem girar ou balançar o animal.
   4. Avalie a postura dos membros posteriores conforme descrito abaixo.
      1. Identifique a postura normal quando ambos os membros posteriores se estendem para fora e para longe do abdômen.
      2. Identifique postura anormal quando um ou ambos os membros retraem em direção ao abdômen ou se cruzam um sobre o outro, indicando o aperto dos membros posteriores associado a ataxia ou comprometimento neurológico.
   5. Grave o comportamento usando um sistema de pontuação pré-definido ou capture um vídeo curto para análise post-hoc cega.
      NOTA: Limite cada teste a ≤10 s para minimizar o estresse.
3. Teste de borda
   NOTA: O teste de borda avalia equilíbrio, coordenação e controle motor fino em camundongos. Ela mede a capacidade do animal de caminhar por uma saliência estreita e descer com segurança até a gaiola da casa sem perder o equilíbrio. Camundongos com disfunção cerebelosa ou ataxia vestibular normalmente apresentam escorregões, quedas ou postura instável durante essa^{tarefa 5}.
   1. Coloque a gaiola em uma superfície estável e plana, à altura do banco (~1 m).
   2. Conecte uma extremidade da gaiola de teste (Figura 1C) à caixa de alojamento (Figura 1D), garantindo que não haja espaço vertical ou obstrução entre as gaiolas para permitir que o camundongo desça suavemente e naturalmente para dentro de sua gaiola de origem (Figura 1B) sem pular ou cair.
   3. Posicione uma câmera de vídeo em um tripé voltado para a saliência em um ângulo de 30°-45° para capturar tanto o movimento lateral quanto a descida.
   4. Ajuste a iluminação para minimizar o brilho e garantir visibilidade clara dos membros e da cauda do rato.
   5. Levante o rato suavemente pela base do rabo e apoie seu corpo com a outra mão. Coloque o rato no centro da saliência para que todas as quatro patas fiquem na superfície. Solte a cauda somente quando o mouse parecer equilibrado e alerta.
   6. Permita que o rato ande livremente pela saliência sem necessidade de solicitação externa. Grave o rato por pelo menos 10 segundos ou até ele descer para dentro da gaiola.
   7. Observe sua capacidade de se equilibrar na saliência sem escorregar e de caminhar ao longo da saliência em direção à gaiola ou plataforma.
   8. Realize três tentativas independentes por mouse, com intervalo de descanso de ~2 minutos entre as tentativas. Limpe a superfície da borda entre os animais usando etanol 70% para remover sinais de cheiro.
   9. Realize todos os testes em um ambiente silencioso, com iluminação consistente e mínimo de ruído ou vibração de fundo. Evite repetir o teste excessivamente no mesmo dia, pois a fadiga e os efeitos de aprendizagem podem influenciar o desempenho.
4. Avaliação da marcha
   NOTA: O teste de avaliação da marcha avalia coordenação locomotora, padrão de passada e estabilidade postural em camundongos em movimento livre. Camundongos com ataxia frequentemente apresentam passo encurtado, movimentos instáveis e posicionamento irregular das patas, indicando déficits de coordenação e controle^{de equilíbrio 5}.
   1. Alinhe uma pista reta e plana com papel de cópia branco (8,5 × 11 polegadas). Coloque a gaiola de casa na ponta do papel para incentivar o rato a andar sobre o papel.
   2. Revestir levemente as patas dianteiras e traseiras com duas cores contrastantes (por exemplo, azul para as patas dianteiras, vermelho para as traseiras) usando uma almofada de tinta não tóxica (Figura 1E).
   3. Coloque o mouse na extremidade inicial da pista e permita que ele ande livremente sobre o papel sem necessidade externa.
   4. Observe e meça os seguintes parâmetros:
      Comprimento da passada: a distância entre posições sucessivas da mesma pata.
      Largura da base: a distância lateral entre as pegadas traseiras esquerda e direita.
   5. Realize de duas a três corridas por mouse, permitindo descanso entre os testes.
      NOTA: Use tinta não tóxica e de secagem rápida e certifique-se de que apenas as almofadas das patas estejam revestidas. Substitua o papel após cada teste para evitar borrar. Aplique tinta com moderação para evitar desfocar pegadas, pois tinta excessiva reduz a precisão das medições de passada.
5. Avaliação da cifose
   NOTA: A avaliação de cifose avalia o alinhamento da coluna vertebral e as anomalias posturais durante a locomoção natural. Camundongos com disfunção neurológica ou muscular frequentemente apresentam curvatura dorsal persistente ou curvatura da coluna⁵.
   1. Coloque o rato sobre uma superfície e permita que ele ande ou explore livremente por alguns segundos. Evite assustar o animal, pois movimentos bruscos podem alterar temporariamente a postura.
   2. Grave um vídeo curto na vista lateral para documentar a curvatura do tronco.
   3. Observe a postura do camundongo durante a caminhada, focando no alinhamento da coluna e na curvatura do tronco conforme descrito abaixo.
      1. Identifique a postura normal quando o camundongo mantém as costas retas ou levemente arqueadas, com movimentos corporais suaves.
      2. Identifique postura anormal quando o camundongo apresenta cifose, caracterizada por coluna anormalmente curvada ou curvada, tronco rígido e flexibilidade reduzida durante a marcha.

3. Análise do teste de ataxia

NOTA: Realize toda a pontuação comportamental por um observador cego para a atribuição experimental de grupo para minimizar o viés do observador.

1. Pontuação em testes de borda
   1. Dê uma pontuação 3 se o rato andar suavemente pela borda, manter o equilíbrio e descer para dentro da gaiola sem escorregar.
   2. Atribua uma pontuação de 2 se o camundongo apresentar leve prejuízo, como hesitação ou um pequeno escorregão da pata, mas se recuperar e descer com segurança.
   3. Atribua uma pontuação de 1 se o rato apresentar comprometimento moderado, incluindo escorregões frequentes, postura agachada, uso excessivo da cauda para equilíbrio ou queda retardada.
   4. Dê uma pontuação 0 se o rato apresentar deficiência severa, não conseguir se equilibrar, cair da beirada ou se recusar a se mover.
2. Pontuação do teste de aperto dos membros posteriores
   1. Atribua uma pontuação 3 se o mouse apresentar consistentemente os membros traseiros abertos para fora sem evidências de agarramento.
   2. Atribua uma pontuação 2 se o camundongo apresentar deficiência leve, como retração intermitente de um membro posterior.
   3. Atribua uma pontuação de 1 se o camundongo apresentar comprometimento moderado, caracterizado por retração parcial de ambos os membros posteriores mantidos próximos ao abdômen.
   4. Atribua uma pontuação de 0 se o camundongo apresentar comprometimento severo, com ambos os membros posteriores firmemente agarrados contra o abdômen durante a maior parte do período de observação.
3. Pontuação da marcha
   1. Dê uma pontuação 3 se o mouse andar com um passo firme e coordenado e se mover em linhas retas.
   2. Atribua uma pontuação de 2 se o camundongo apresentar prejuízo leve, como andar devagar com leve instabilidade ou desvio lateral, mancar para um lado ou seguir caminhos largos e circulares.
   3. Atribua uma pontuação de 1 se o camundongo apresentar comprometimento moderado, incluindo distúrbio claro na marcha, andar usando apenas duas ou três patas, arrastar parte do corpo ou se mover em círculos apertados.
   4. Atribua uma pontuação 0 se o camundongo apresentar deficiência severa, não conseguir andar de forma eficaz, permanecer imóvel ou apresentar movimentos descontrolados de rolamento para o lado.
4. Pontuação por cifose
   1. Atribua uma pontuação 3 se o mouse permanecer deitado, reto para trás, tanto durante o descanso quanto durante a caminhada.
   2. Atribua uma pontuação de 2 se o camundongo apresentar leve comprometimento, com uma leve curvatura das costas em repouso que se endireita durante o movimento.
   3. Atribua uma pontuação de 1 se o camundongo apresentar comprometimento moderado, com as costas moderadamente curvadas em repouso que permanecem curvas durante a caminhada.
   4. Atribua uma pontuação de 0 se o mouse apresentar comprometimento severo, com costas fortemente curvadas durante todo o período de observação, o que restringe o movimento normal.

4. Avaliação de confiabilidade entre avaliadores

1. Treine observadores usando vídeos representativos de exemplo antes da pontuação formal para padronizar a interpretação dos critérios de pontuação.
2. Para minimizar o viés do observador, avalie todos os testes comportamentais de forma independente por dois observadores treinados, cegos ao grupo de tratamento e ao ponto de tempo experimental.
3. Quantifique a confiabilidade entre avaliadores para cada ensaio comportamental usando o coeficiente kappa de Cohen. Interprete os valores de kappa da seguinte forma: <0,40, mal acordo; 0,40-0,60, acordo moderado; 0,60-0,80, acordo substancial; e >0,80, quase perfeita concordância.
4. Resolver quaisquer discrepâncias de pontuação por meio da revisão conjunta dos vídeos gravados e alcançar uma pontuação^{consensual 5}.

Resultados

Crescimento tumoral CPA causa ataxia no modelo de camundongos VS

Para avaliar a ataxia induzida por tumores, estabelecemos duas coortes experimentais. Primeiro, para avaliar os efeitos da cirurgia animal e da implantação de células tumorais na ataxia, os camundongos passaram por cirurgia simulada e injeção de soro fisiológico na região da CPA. Os sintomas de ataxia em camundongos do grupo simulado foram comparados com os de camundongos controle não operados. Na segunda coorte,...

Discussão

Os ensaios comportamentais descritos aqui fornecem uma estrutura robusta e quantitativa para avaliar déficits de ataxia e coordenação motora em modelos murinos de SV e distúrbios vestibulares relacionados. Adaptados a partir de protocolos estabelecidos para modelos de doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington e as ataxias^{espinocerebelares 10}, esses testes são bem adequados para caracterizar a disfunção vestibular indu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro bovino fetal	ThermoFisher	A5670701
Luminômetro Microplate GloMax 96	Promega	GM3000
Base de procedimento azul McKesson	McKesson	75402
Suplemento de crescimento celular de Schwann	ScienCell	1752