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Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos

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DOI:

10.3791/70334

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10 de abril de 2026

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado para coletar amostras de DNA ambiental de cetáceos (eDNA) de embarcações de observação de baleias. A viabilidade para pesquisadores e cientistas cidadãos treinados é priorizada, enquanto condições ambientais, tempo de filtragem, turbidez e logística a bordo definem os limites práticos de sua aplicação.

Resumo

O DNA Ambiental (eDNA) oferece uma abordagem não invasiva para monitorar cetáceos, mas sua aplicação ampla em plataformas operacionais exige fluxos de amostragem padronizados e viáveis. Este estudo descreve um protocolo para coleta de eDNA de cetáceos de embarcações de observação de baleias, projetado para implementação por pesquisadores e cientistas cidadãos treinados sob condições ambientais e logísticas definidas. A abordagem integra coleta de água do mar direcionada por flukeprints, filtração a bordo com filtros autopreservantes e análises moleculares a jusante para apoiar a geração operacionalmente viável de dados em condições reais. O protocolo foi implementado durante campanhas de campo coordenadas realizadas em 2024 em três regiões do Atlântico Norte e do Mar Mediterrâneo (Islândia, Portugal e Itália), abrangendo múltiplos táxons de cetáceos. O desempenho do método foi avaliado usando um ensaio quantitativo de PCR específico para espécie recém-desenvolvido, direcionado ao DNA mitocondrial da baleia-jubarte (Megaptera novaeangliae), demonstrando taxas de detecção consistentes sob condições ambientais e logísticas variáveis. Ao fornecer orientações práticas para implementação em campo e controle de contaminação, esse protocolo apoia o monitoramento de cetáceos reprodutíveis baseados em eDNA e facilita a comparabilidade entre regiões em estudos de biodiversidade marinha.

Introdução

O manejo eficaz da conservação da megafauna marinha, incluindo cetáceos e outras espécies de ampla variedade, é imprescindível para a proteção da biodiversidade. Como predadores de topo e engenheiros de ecossistemas, os cetáceos contribuem para a regulação trófica, o ciclo de nutrientes e a resiliência ecológica em baciasoceânicas 1. No entanto, gerar conhecimento ecológico abrangente para essas espécies altamente móveis continua sendo desafiador e frequentemente depende de programas intensivos em recursos demonitoramento 2. Abordagens convencionais, como amostragem por biópsia, identificação fotográfica, monitoramento acústico passivo, telemetria via satélite e levantamentos aéreos, forneceram insights críticos sobre a ecologia doscetáceos 3,4,5,6,7, mas esses métodos costumam ser caros, logisticamente exigentes, espacialmente limitados ou invasivos, e sujeitos a rigorosa supervisão ética e regulatória 8. Como resultado, a frequência de amostragem, a cobertura geográfica e as oportunidades de participação das partes interessadas são frequentemente limitadas, especialmente para o estudo de espécies de ampla distribuição ou raras.

DNA ambiental (eDNA, definido como material genético liberado por organismos em seu ambiente) surgiu como uma ferramenta poderosa e não invasiva para detectar espécies aquáticas a partir de amostrasde água 9,10. Ensaios de PCR quantitativa específicos para espécie (qPCR) que visam fragmentos de DNA mitocondrial permitem a detecção altamente sensível e específica de táxons marinhos, incluindocetáceos 11,12,14. Além da detecção de presença/ausência, a intensidade relativa do sinal de eDNA e as sequências de DNA-alvo fornecem informações valiosas relacionadas à proximidade, abundância relativa e padrões genéticos em nívelpopulacional 15,16,17,18,19. Além disso, amostras ambientais coletadas próximas a baleias frequentemente contêm DNA de táxons coexistentes, incluindo espécies de presas, simbiontes e parasitas, apoiando associações ecológicas maisamplas 20,21,22. Coletivamente, esses avanços demonstram o potencial das abordagens baseadas em eDNA para complementar métodos tradicionais e expandir o escopo da pesquisa com cetáceos em sistemasmarinhos 23,24.

Apesar dessas vantagens, o monitoramento baseado em eDNA da megafauna marinha enfrenta desafios persistentes relacionados à amostragem representativa, cobertura espacial e reprodutibilidade metodológica, especialmente em sistemas marinhos abertos onde o DNA é rapidamentediluído 25,26 e as espécies-alvo têm extensas áreas de distribuição e ocorrem em baixas densidades. Enfrentar essas restrições requer estruturas de amostragem escaláveis e operacionalmente viáveis que possam ser aplicadas em amplas escalas espaciais e temporais. Iniciativas de ciência cidadã têm se mostrado eficazes na ampliação da coleta de dados ecológicos enquanto promovem o engajamento público na conservação marinha, tornando-se assim uma via promissora para o monitoramento em larga escala baseado em eDNA 27,28,29,30. Embarcações de observação de baleias representam uma plataforma subutilizada, porém altamente adequada, para amostragem de eDNA, oferecendo acesso regular a habitats de cetáceos ao longo das estações e regiões 31,32,33. A indústria global de observação de baleias apoia extensas redesoperacionais 34, e estudos anteriores demonstraram a viabilidade de coletar eDNA de cetáceos de outras plataformas oportunistas, como embarcações comerciais,balsas 35, e por meio de amostragem direcionada integrada com fotoidentificação e observaçõescomportamentais 36,37. A rápida expansão da pesquisa em eDNA levou a uma inovação metodológica substancial, mas a variabilidade biológica entre sistemas marinhos e o ritmo dos avanços tecnológicos complicam os esforços para harmonizar protocolos e garantir a comparabilidade entre estudos. Metodologias de campo padronizadas, porém adaptáveis, são, portanto, essenciais, especialmente para iniciativas multinacionais de monitoramentoem grande escala 38.

A detecção de eDNA é influenciada pelo volume de água filtrada, estratégia de filtragem, material filtrante e tamanho dos poros. Filtrar volumes maiores geralmente aumenta a produção de eDNA e a probabilidade de detecção para alvos vertebrados, incluindocetáceos 39,40,41,42. Em águas produtivas ou turvas, entretanto, a eficiência de filtração pode ser limitada por entupimentos rápidosdo filtro 43,44, exigindo compromissos entre volume alcançável e viabilidadeoperacional 45,46. A amostragem a partir de tremabondas — a perturbação superficial criada pelo traço da cauda de baleia — tem demonstrado consistentemente aumentar a detecção do eDNA dos cetáceos, já que material biológico recentemente liberado está concentrado próximo àsuperfície 24,41,42,47,48. O uso de sistemas de filtros fechados e autopreservantes reduz etapas de manuseio e riscos de contaminação, tornando-os bem adequados para aplicações de ciência cidadã38,42. Além disso, a inclusão de réplicas biológicas e controles rotineiros de campo minimiza falhas de detecção e aumenta a confiabilidade dosdados 49,50,51.

Desenvolvimento e validação de protocolos
O projetoeWHALE 52 é uma iniciativa transnacional que integra pesquisadores, operadores de observação de baleias e cientistas cidadãos de toda a Europa para monitorar a megafauna marinha usando eDNA. Os esforços de amostragem têm como alvo múltiplos táxons de cetáceos no Atlântico Norte e no Mar Mediterrâneo, utilizando um protocolo central com adaptações específicas para regiões para considerar as condições ambientais e logísticas locais.

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado, do início ao fim, para coleta de eDNA de cetáceos de embarcações de observação de baleias, refinado por meio da análise de 308 amostras de eDNA de água do mar, incluindo duas réplicas por amostra e 21 controles de campo, coletados durante campanhas coordenadas de campo em 2024 na Baía de Skjálfandi (Islândia), Açores (Portugal) e Mar da Ligúria (Itália). O método integra coleta de água do mar direcionada por flukeprints, filtração a bordo usando filtros de eDNA autopreservantes e análises moleculares a jusante.

Este protocolo foi desenvolvido para ser implementado em condições reais de observação de baleias por pesquisadores treinados e cientistas cidadãos, onde a filtragem a bordo pode ser realizada sob condições marítimas calmas a moderadas, sem interromper as atividades de observação de baleias. Sua implementação requer coordenação com organizações participantes (por exemplo, operadores de observação de baleias, organizações sem fins lucrativos, instituições de pesquisa) para definir estratégias de amostragem e objetivos de pesquisa. Embora os parâmetros centrais devam permanecer fixos para garantir reprodutibilidade e comparabilidade de estudos cruzados, ajustes alinhados ao protocolo podem ser necessários em locais com alta turbidez, movimento da embarcação ou restrições de tempo, espaço ou pessoal. Tais adaptações incluem tipo de filtro, volume de água filtrada alcançável e equipamentos auxiliares. Eles devem ser aplicados de forma consistente em cada campanha de amostragem e reportados de forma transparente. Orientações operacionais detalhadas e considerações logísticas são fornecidas nas etapas e discussões do Protocolo para apoiar a qualidade dos dados, transparência e comparabilidade regional.

Projeto do ensaio qPCR
Para avaliar o desempenho do protocolo, foi amplificado o eDNA de baleias-jubarte (Megaptera novaeangliae), uma espécie migratória bem estudada regularmente encontrada na Baía de Skjálfandi (Islândia)53 e presente sazonalmente nosAçores 54, a partir de amostras coletadas em campo. Os fluxos de trabalho de lise, extração e qPCR do DNA foram inicialmente otimizados por meio de um teste em anel interlaboratorial envolvendo quatro laboratórios participantes do projeto eWHALE, melhorando assim a consistência e aplicabilidade entreas 14 instituições.

Para detectar de forma confiável a presença de eDNA de jubarte, foi projetado e validado um ensaio de qPCR específico para MGB (ligador de sulcos menores) direcionado à região mitocondrial ND5 conforme as diretrizesestabelecidas 55 (Tabela 1). Primers de oligonucleotídeos e uma sonda foram gerados usando software para alinhamento e análise de sequênciasde DNA 56, visando maximizar a especificidade da espécie e a eficiência de amplificação (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1). A especificidade do ensaio foi avaliada in vitro usando táxons-alvo e não alvo (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). As concentrações de DNA usadas para gerar curvas padrão qPCR foram quantificadas a partir de um padrão de DNA derivado detecido 42,57,58,59,60. O limite de detecção (LOD) do ensaio, definido como a menor concentração que gera amplificações positivas em 95% das replicações da amostra, foideterminado em 11,61. As detecções de eDNA da jubarte foram avaliadas para amostras de campo estimando a proporção de reações positivas e a intensidade do sinal (ou seja, Limiar do Ciclo, valor de Ct) para cada replicação da amostra em medições triplicadas de qPCR, para levar em conta a variabilidade da amplificação e melhorar a confiabilidade dadetecção 57,60,62. As detecções de espécies foram então verificadas com sequenciamento bidirecional de Sanger, seguido pela confirmação via análiseBLAST 63.

Os dados da qPCR são apresentados como a média ± desvio padrão (SD). A significância estatística entre os grupos foi avaliada usando o teste U de Mann-Whitney não paramétrico e o teste t de duas amostras de Welch. As diferenças foram consideradas significativas em p < 0,05. Todas as análises foram realizadas usando o software de análiseestatística 64.

Protocolo

Ética e conformidade regulatória
Todos os esforços de observação dos cetáceos e a subsequente amostragem de água devem ser realizados de acordo com as regulamentações nacionais e regionais de vida selvagem. Realizar amostras exclusivamente de embarcações autorizadas que operem sob permissões válidas de observação ou pesquisa de baleias. Mantenha distâncias mínimas de aproximação da espécie alvo conforme definido pelas regulamentações locais e evite qualquer manobra destinada exclusivamente a fins de amostragem. Amostras de tecido de baleia usadas para validação de ensaios foram coletadas sob as respectivas permissões regionais e compartilhadas entre parceiros do projeto eWHALE em conformidade com regulamentos nacionais e institucionais.

NOTA: Revise os seguintes documentos antes de qualquer atividade de amostragem e reúna os equipamentos necessários: Tabela de Materiais, Kit de Amostragem de eDNA (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S2), materiais usados para coletar amostras ambientais de DNA (Figura 1) e uma visão geral das etapas de amostragem e do fluxo de trabalho de filtragem a bordo (Figura 2).

1. Preparação da amostragem de eDNA

  1. Prepare materiais de documentação de campo, incluindo fichas de dados de campo e protocolo de campo plastificado (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).
  2. Prepare luvas extras, filtros extras (um filtro por amostra replicada), marcador à prova d'água e um recipiente dedicado para resíduos (Figura 1A).
    NOTA: Use filtros de eDNA autopreservantes fechados (tamanho de poro de 1,2 μm) para minimizar riscos de manuseio econtaminação 65,66.
  3. Prepare um ou mais baldes rígidos, adequados para o tipo de embarcação e configuração a bordo (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S3).
    1. Marque os baldes a 10 L usando um marcador permanente. Prepare vários baldes menores se manusear 10 L for impraticável.
    2. Prenda uma corda firmemente ao balde se o alcance ao mar for limitado.
      NOTA: Use baldes com tampa para minimizar o vazamento quando o movimento do vaso for excessivo (Figura 1B).
    3. Prepare um recipiente secundário de eDNA para combinar volumes menores e uma caixa de transporte adicional para garantir o transporte livre de contaminação dos baldes, se necessário (Figura 1C).
  4. Prepare uma bomba de água peristáltica ou a vácuo portátil (Figura 1D). Carregue totalmente a bomba antes do embarque e desconecte a energia imediatamente antes do uso.
  5. Atribuir funções de amostragem, filtragem e registro de dados antes da partida.
    ATENÇÃO: Use luvas durante todo o manuseio de equipamentos e troque as luvas entre as tarefas.

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Figura 1: Materiais de trabalho de campo usados para coletar amostras ambientais de DNA. (A) Kit de ferramentas com filtros de eDNA autopreservantes, recipiente de resíduos, frasco de espremer com água sanitária doméstica diluída (1:10), luvas, ficha técnica de campo e caneta impermeável; (B) exemplos de tipos de baldes para amostragem de eDNA; (C) exemplos de contêineres adicionais de eDNA para transporte e filtragem de grandes volumes e contêiner para transporte de baldes a bordo; (D) exemplos de bombas portáteis para filtração de água. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Diagrama conceitual da amostragem ambiental de DNA a bordo de barcos de observação de baleias. A ilustração descreve etapas guiadas, incluindo coleta de amostras de água e filtração a bordo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Limpeza de equipamentos

  1. Coloque luvas descartáveis antes de limpar.
  2. Prepare uma solução de água sanitária diluindo água sanitária doméstica (5-6% de hipoclorito de sódio) 1:10 com água purificada (~50 mL por viagem).
  3. Aplique a solução espirrando uniformemente em todas as superfícies em baldes, tampas, recipientes e tubos da bomba. Mantenha um tempo mínimo de contato com a água sanitária de 2 a 5 minutos em todas as superfícies.
  4. Enxágue bem com água da torneira 3 vezes (Figura 3).
  5. Seque os materiais ao ar livre em um local seguro e armazene-os em um local seguro e limpo antes do embarque.

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Figura 3: Etapas para limpar equipamentos. (A) Aplicar a solução de água sanitária doméstica diluída (1:10); (B) espalhar uniformemente usando luvas sem DNA; (C) enxague bem três vezes com água da torneira; e (D) repetir o processo para materiais adicionais, se aplicável (por exemplo, recipientes de eDNA). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Coleta de amostras de água

NOTA: Cumpra todas as normas de segurança a bordo de cada embarcação ou plataforma, incluindo o uso de coletes salva-vidas ou macacões de flutuação quando necessário.

  1. Leve todos os materiais a bordo antes da chegada dos passageiros e armazene-os em uma área designada e limpa.
  2. Coordenar o tempo de amostragem e o posicionamento da embarcação com a tripulação da embarcação.
  3. Observe padrões de emergência para antecipar mergulhos de baleias (Figura 4). Coloque luvas novas antes de amostrar.
  4. Colete 20 L de água do mar o mais rápido possível (não mais que um lapso de tempo de 10 minutos) da pegada após o mergulho da baleia, para gerar duas réplicas de amostra de 10 L.
  5. Transporte a água coletada para uma estação de filtragem designada a bordo, usando tampas ou um recipiente esterilizado adicional para evitar derramamento (se necessário).
  6. Registre a identidade da espécie, coordenadas GPS, horário e identificação da réplica da amostra na ficha de dados.
  7. Troque as luvas imediatamente após o relato.

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Figura 4: Sequência de emergência da baleia jubarte. (A) Baleia de baleia; (B) arquear as costas e levantar a cauda antes de mergulhar; (C) padrão de marcas de tremato na superfície após o mergulho da baleia. Atribuição da imagem: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Filtração de eDNA

  1. Abra o saco do filtro e manuseie o filtro apenas pela tomada (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S4).
  2. Insira a entrada no snorkel e conecte o tubo da bomba à saída (Figura 5A,B).
  3. Submerga o snorkel na amostra de água sem submergir a carcaça do filtro (Figura 5C).
  4. Ajuste a bomba (veja a Tabela de Materiais para tipos de bombas) para uma vazão rápida e constante.
  5. Filtre 10 L continuamente enquanto monitora a estabilidade do fluxo (verifique bolhas de ar, rasgos, rasgos ou falhas de vedação).
    NOTA: Encerre a filtração com duração máxima de 45 min.
  6. Inverta o filtro e deixe a bomba funcionar por 30-60 s para remover água residual. Confirme que não há umidade visível no compartimento do filtro.
  7. Desligue a bomba e desconecte o tubo.
  8. Descarte o snorkel no recipiente de resíduos, coloque o filtro no saco original e etiquete-o imediatamente.
  9. Armazene os filtros a bordo em um recipiente rígido fechado ou em uma caixa de resfriamento (se a temperatura ambiente estiver > 20 °C), longe da luz solar direta e das áreas dos passageiros.
  10. Troque as luvas e repita a filtragem para a segunda réplica.

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Figura 5: Etapas para configurar o sistema de filtragem a bordo. (A) conectar a entrada do filtro (parte branca) ao snorkel (tubo); (B) conectar o tubo da bomba à saída do filtro (parte amarela); e (C) imergir parte do snorkel na amostra de água. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Controles negativos de campo e relatórios de dados

  1. Filtre um controle negativo de campo após cada cinco amostras de flukeprint.
  2. Use água sem DNA do alvo imediatamente após retornar à costa e antes da limpeza do equipamento.
  3. Transfira todos os dados para a planilha digital de amostragem de eDNA após cada viagem (Arquivo Suplementar 4).

6. Armazenamento e envio por filtragem

  1. Armazene filtros de eDNA autopreservantes em um recipiente seguro e seco em um ambiente sombreado — ou em uma geladeira se a temperatura ambiente ultrapassar 20 °C — por não mais que 3 meses antes do envio.
  2. Inspecione visualmente os sacos do filtro para ver se há umidade antes do envio.
  3. Rotule e envie filtros em contêineres isolados com bolsas de gelo para o laboratório designado.

7. Análise laboratorial

NOTA: Realize todos os procedimentos laboratoriais em salas dedicadas esterilizadas por UV, com ventilação adequada e bancadas de trabalho separadas para PCRs, usando luvas e roupas de proteção semDNA 55,67,68.

  1. Lise de DNA
    1. Rotule um tubo de reação de 2 mL por filtro.
    2. Coloque o filtro em um frasco Erlenmeyer de 200 mL e descarte a tampa de borracha (Figura 6A).
    3. Usando pinças sem DNA, dobre a membrana (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S5) em um triângulo e transfira-a para o tubo de reação de 2 mL, com a ponta orientada para baixo (Figura 6B-D).
    4. Adicione 380 μL de tampão TES e 20 μL de Proteinase K (veja a Tabela de Materiais) a cada tubo de reação, resultando em 400 μL de tampão de lise (Figura 6E).
    5. Vórtice brevemente e incubar a 56 °C por ≥3 horas com agitação (Figura 6F).
    6. Centrifuge tubos a 18.626 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
      NOTA: Um lisado claro a levemente colorido indica digestão bem-sucedida.
      NOTA: O protocolo pode ser temporariamente interrompido nesta fase se os lisados forem armazenados a -20 °C.
  2. Extração de DNA
    1. Incube os lisados a 56 °C por 10 minutos antes da extração.
    2. Reagentes de extração de pipetas em placas de lavagem e placas de elução, levando em conta controles negativos e erros depipetamento 69 (ver Arquivo Suplementar 1-Tabela Suplementar S1).
    3. Inclua um blank de extração por placa usando o buffer TES.
    4. Transfira 300 μL de lisato para cada poço da placa de ligação. Adicione 300 μL de AL tampão e 300 μL de álcool isopropílico a cada poço. Use múltiplas placas de ligação se o volume total de lisado exceder 300 μL de vórtice e adicione 30 μL de partículas magnéticas para a ligação de ácido nucleico por poço à primeira placa de ligação (Tabela de Materiais).
    5. Cubra a placa de ligação com uma tampa para vareta.
    6. Execute o programa preliminar de captação de DNA para duas placas de ligação (total de 400 μL lisado; veja a Tabela de Materiais e a Figura 7) e o protocolo automatizado de extração em um robô de laboratório baseado em esferas magnéticas.
    7. Descarte os produtos químicos de extração em recipientes de resíduos designados.
    8. Transfira o DNA eluiado para tubos de reação marcados de 1,5 mL e armazene a −20 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser temporariamente interrompido nesta etapa. Etapas adicionais de remoção de inibidores podem ser realizadas neste momento.
  3. qPCR
    1. Prepare e quantifique padrões de DNA de espécies-alvo usando extratos de tecido e um ensaio de dsDNA de alta sensibilidade baseado em fluorescência, conforme as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Gerar uma curva padrão de oito pontos por diluição serial (1:10) começando em 10 ng/μL11,55. Padrões aliquotas anteriores à qPCR para minimizar ciclos de congelamento-descongelamento.
      NOTA: O protocolo pode ser temporariamente interrompido nesta etapa.
    2. Prepare todas as reações qPCR em triplicado usando placas de 96 poços.
    3. Inclua um controle sem molde (água de grau molecular) e um blank de extração por placa qPCR.
    4. Prepare a mistura master de acordo com o Arquivo Suplementar 1-Tabela Suplementar S2 e a Figura 8A.
    5. Em um capuz de carregamento de DNA, adicione os padrões de DNA previamente preparados e 3 μL de extrato de DNA a cada poço contendo a mistura master (Figura 8B).
    6. Sele a placa com um filme de vedação (Figura 8C).
    7. Centrifuge a 3.500 × g por 10 s e carregue no termociclador quantitativo de PCR em tempo real (Figuras 8D,E).
    8. Execute o ensaio em condições otimizadas de ciclagem, especificadas na Tabela 2, e registre os dados usando o software do fabricante (Tabela de Materiais)11.

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Figura 6: Fluxo de trabalho para lise de DNA. (A) Remover a tampa de borracha do filtro de eDNA autopreservante e colocá-la em um frasco de Erlenmeyer; (B) esterilizar dois pares de fórceps com fogo três vezes; (C) dobra a membrana filtrante; (D) inseri-lo em um tubo de 2 mL; (E) adicionar tampão de lise e Proteinase K, e (F) incubar amostras a 56 °C por 3 horas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 7: Materiais e equipamentos usados para extração de DNA. (A) Ligação, lavagem e elução de placas, consumíveis e reagentes para preparação de extração; e (B) o robô de laboratório baseado em esferas magnéticas usado para processamento de amostras. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 8: Fluxo de trabalho para qPCR. (A) Preparar a mistura master em uma sala previamente esterilizada por UV (sob uma capela de trabalho dedicada à preparação de misturas master); (B) carregar padrões, extratos e controles de DNA em uma estação de carregamento de DNA seguindo o padrão mostrado; (C) placa de vedação; (D) centrífuga; (E) carregue no termociclador quantitativo de PCR em tempo real. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Um total de 154 amostras de tremato (308 filtros de eDNA) foram coletadas em 2024 usando esse protocolo otimizado, incluindo 96 filtros na Baía de Skálfandi (Islândia; 9 controles de campo e 76 réplicas de baleia jubarte) obtidos de março a novembro, 151 filtros nos Açores (Portugal; 12 controles de campo e 15 réplicas de baleia jubarte) obtidos em julho e 61 filtros no Mar da Ligúria (Itália; 4 controles de campo) obtidos de maio a outubro. Todas as amostras envolveram a coleta de até 10 L de água do mar (duas réplicas por amostra de pegada fluke) usando filtros de eDNA autopreservantes (Tabela 3). Dois tipos de controles negativos foram coletados durante o trabalho de campo: água purificada filtrada após a limpeza de água sanitária do equipamento e água do mar coletada ao reentrar no(s) porto(s)42. Este último foi intencionalmente filtrado antes da limpeza de água sanitária para avaliar a possível contaminação cruzada com eDNA de cetáceos durante a amostragem. Amostras foram enviadas de cada local de amostragem em dois lotes para a Unidade de Pesquisa em Ecologia Animal Aplicada, Departamento de Zoologia, Universidade de Innsbruck (Áustria) para processamento laboratorial.

Desempenho do ensaio e controle
Um subconjunto de 44 filtros (30 réplicas, incluindo 2 controles de campo da Baía de Skjálfandi, Islândia, e 14 filtros, incluindo 1 controle de campo das águas ao redor da Ilha de Faial e Pico, Açores, Portugal) foi analisado para eDNA da baleia-jubarte (Figura 9). O sinal foi medido em reações qPCR triplicadas. Uma amostra (ou seja, filtro de eDNA) foi considerada positiva, se uma em cada três qPCR se replicar amplificada. O limite de detecção (LOD) do ensaio neste estudo foi calculado como 0,0001 ng/μL (Média de Ct do LOD = 35,8). Nos 41 filtros analisados, 20 (49%) apresentaram amplificações, enquanto 24 (58%) não apresentaram amplificação. As não detecções (sem valor de CT) provavelmente refletem a ausência ou concentrações extremamente baixas de DNA-alvo. As não-detecções compreenderam 5 dos 13 filtros dos Açores (38%) e 19 dos 28 filtros da Islândia (68%). Os blanks de extração foram analisados para DNA de vertebrados marinhos usando o ensaioMarVer3 70 e não mostraram amplificação detectável, indicando que não houve contaminação cruzada durante a extração de DNA. Os controles de campo (NC) e controles qPCR (NT) não apresentaram amplificações, confirmando a ausência de contaminação durante o trabalho de campo e a triagem da qPCR (Tabela 4).

Entre os 20 filtros positivos, nove (22%) apresentaram pelo menos um valor de Ct abaixo do limite de detecção do ensaio (LOD; 0,0001 ng/μL) e, portanto, foram classificados como detecções confiáveis. Esses incluíam 4 dos 8 filtros dos Açores (50%) e 5 dos 12 da Islândia (42%). Outros 11 filtros (27%) produziram um ou mais valores Ct acima do LOD, compreendendo 4 filtros dos Açores (50%) e 7 da Islândia (58%), indicando detecções plausíveis (Figura 10). A análise comparativa revelou um valor de limiar médio do ciclo (Ct) marginalmente inferior para os filtros dos Açores (34,7 ± 3,60; n = 8) comparado aos filtros da Islândia (36,9 ± 3,60; n = 10). O teste Mann-Whitney U demonstrou que essa diferença não era estatisticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Dada a relação inversa entre o valor de Ct e a intensidade do sinal de DNA, os resultados indicam concentrações ligeiramente maiores de eDNA alvo da baleia-jubarte nos filtros dos Açores (Figura 11).

Restrições de viabilidade
O número de amostras de tremelas por viagem variava dependendo da duração da viagem e das condições climáticas. Aproximadamente duas a três amostras (resultando em até seis filtros de eDNA) foram coletadas durante missões de 3 horas nos Açores, duas a quatro amostras durante ~8 horas na Itália (resultando em até oito filtros) e uma a duas amostras (produzindo até 4 filtros) durante viagens de 3,2 horas na Islândia. O desempenho de filtração era geralmente alto nos Açores e na Itália. Nos Açores, 10 L de água do mar foram filtrados consistentemente em 10-15 minutos, enquanto na Itália, o mesmo volume foi filtrado em aproximadamente 10 minutos. Na Islândia, os volumes filtrados variaram de 4,5 a 10 L (média = 8,5 L), com um tempo médio de filtragem de ~40 min devido ao frequente entupimento do filtro, provavelmente devido a partículas na água na área de estudo. Especificamente, 10 L foram filtrados com sucesso para 46 dos 98 filtros (47%), volumes entre 7 L e 10 L foram obtidos para 31 filtros (32%) e volumes entre 4 L e 7 L foram obtidos para 21 filtros (21%) (Arquivo Suplementar 1-Tabela Suplementar S3).

O protocolo recomenda a filtragem de um controle negativo de campo após cada cinco amostras flukeprint. No entanto, sob condições operacionais de observação de baleias, isso não pôde ser completamente cumprido no estudo de caso descrito devido a restrições logísticas, incluindo disponibilidade limitada de filtros, restrições de tempo e atrasos no envio. Isso reduziu as razões controle-amostragem alcançáveis para 1:10,7 na Islândia (9/96), 1:12,6 nos Açores (12/151) e 1:15,3 na Itália (4/61). Apesar dessas variações, nenhum controle negativo de campo ou laboratório mostrou amplificação.

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Figura 9: Visão geral dos locais das amostras. Pontos pretos no mapa representam locais onde amostras foram coletadas de uma pegada de tremato de baleia-jubarte na Baía de Skjálfandi (Islândia) e nos Açores. O nome do filtro de eDNA é indicado próximo à região de amostragem correspondente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 10: Detecções de um subconjunto de filtros de eDNA dos Açores e da Islândia. qPCR médias de valores de Ct e força do sinal de DNA para detecções positivas aos Açores e Islândia (pelo menos uma replicação positiva por PCR), com SD e LOD. As barras são coloridas pela intensidade do sinal em relação ao LOD: azul escuro = sinal forte (Ct ≤ 35,8) indica detecções confiáveis, azul claro = sinal fraco (Ct > 35,8) indica detecções plausíveis. As barras de erro SD representam variabilidade entre réplicas de PCR. A linha tracejada vermelha indica o LOD (Ct = 35,8). Valores médios de Ct são mostrados acima de cada barra. Abreviações: Ct = limiar de ciclo; SD = desvio padrão; LOD = limite de detecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 11: Valores médios do limiar do ciclo para detecções de DNA de baleias jubartes nos Açores e na Islândia. Linhas pretas dentro dos box plots indicam a mediana, e quadrados vermelhos representam os valores médios de Ct (SD), enquanto os bigodes representam os valores mínimos e máximos para os Açores e Islândia. O teste Mann-Whitney U demonstrou que essa diferença não era estatisticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Sequencias de primer e sonda para o ensaio qPCR direcionado a ND5. Essas sequências incluem primers diretos e reversos, sequências de sonda MGB (5′-3′), temperatura ótima de recozimento e limite de detecção (LOD) do ensaio. (*) LOD é definida como a menor concentração de DNA (ng/μL) do DNA da espécie-alvo, na qual ≥95% das replicações de PCR geraram amplificação positiva. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Condições de ciclo otimizadas para o ensaio qPCR de eDNA da baleia-jubarte. Essas configurações otimizadas de qPCR são 95°C por 10 minutos (ativação enzimática), depois 40 ciclos a 95°C por 15 s (desnaturação) e 60°C por 90 s (recozimento/extensão). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Visão geral da configuração de amostragem de campo. Visão geral das regiões de amostragem, parceiros de campo, tipos de embarcações, espécies-alvo, períodos de amostragem e réplicas de amostras nos Açores, Islônia e Itália. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: resumo da detecção de qPCR para amostras ambientais e controles. Detecções positivas (destacadas em amarelo), qPCR replicam os valores de Ct e os resultados da detecção são mostrados; As amostras foram classificadas como positivas quando pelo menos uma das réplicas da qPCR mostrou amplificação. "Sem Ct" indica ausência de amplificação, controles negativos não mostraram amplificação, e a série padrão de diluição de M. novaeangliae usada para definir desempenho do ensaio e o LOD está incluída na parte inferior da tabela. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Contém Figuras e Tabelas Suplementares, fornecendo informações adicionais sobre a aplicação do protocolo, incluindo kit de amostragem de eDNA para design de primer , tipos de embarcações para observação de baleias, características do filtro de eDNA autopreservante, volumes de reagentes para extração de DNA e reações qPCR, e variações nas taxas de filtração entre regiões de amostragem. Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Ficha técnica de campo usada durante a amostragem de eDNA de cetáceos. Formulário padronizado para registrar metadados de cruzeiros, observações de cetáceos e informações de amostragem e filtro. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Protocolo de campo passo a passo para amostragem de eDNA de cetáceos a bordo de embarcações de observação de baleias, incluindo limpeza de equipamentos, coleta de água do mar e filtração a bordo, relato de amostras e armazenamento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Modelo de planilha de amostragem de eDNA de cetáceos. Formulário padronizado para registrar informações de amostragem após coleta e filtragem a bordo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Viabilidade operacional e implementação em campo
O protocolo apresentado aqui contribui com um fluxo de trabalho padronizado de eDNA que equilibra a sensibilidade da detecção com restrições do mundo real. Ao integrar amostragem de grande volume, direcionada para flukeprints, filtragem a bordo usando filtros fechados autopreservantes e medidas padronizadas de controle de contaminação, o protocolo fornece uma estrutura reprodutível que pode ser aplicada entre regiões e campanhas de amostragem. Essa abordagem está alinhada com o crescente reconhecimento do eDNA como um complemento econômico e escalável às técnicas convencionais de monitoramento marítimo 9,10,22.

Estudos anteriores de eDNA com cetáceos dependeram principalmente da amostragem de água do mar baseada em transectos de grandes embarcações de pesquisa ou amostragem oportunista de pequeno volume próxima a avistamentos de cetáceos. Abordagens baseadas em transectos permitem ampla cobertura espacial, mas frequentemente capturam sinais de DNA diluídos e temporalmente desacoplados, limitando a detecção de espécies raras outransitórias 71, mesmo quando a amostragem ocorre próxima à superfície, e normalmente requer vasos e infraestrutura especializados 25,37,72. Por outro lado, amostragens em pequenos volumes próximas a baleias emergindo melhoram a especificidade do encontro, mas continuam propensas a falsos negativos devido a volumes limitados de água e práticas de filtraçãoinconsistentes 72,73. Ao direcionar explicitamente as tremabondas e filtrar grandes volumes a bordo, o fluxo de trabalho apresentado aqui aumenta a probabilidade de capturar eDNA de cetáceos de baixa concentração, permanecendo viável sob as restrições de tempo e espaço típicas das operações de observação de baleias. O uso de filtros fechados e autopreservantes minimiza ainda mais os riscos de manuseio e contaminação, eliminando a necessidade de tampões de preservação aplicados em campo e simplificando a logística sob condições restritas a bordo42,66.

Para garantir a comparabilidade entre estudos, os seguintes parâmetros devem permanecer fixos dentro de uma campanha de amostragem: coleta de água do mar diretamente de marcas visíveis de cetáceos; duas réplicas biológicas de 10 L por pegada fluke; o uso de filtros de eDNA autopreservantes é impossível durante a filtração a bordo durante medidas padronizadas de controle de contaminação, incluindo controles negativos regulares de campo em uma frequência mínima definida; e triagem qPCR específica para espécie realizada em triplicado com controles apropriados. Outros parâmetros podem variar sem comprometer o arcabouço metodológico, desde que sejam aplicados de forma consistente e transparente, incluindo equipamentos e manuseio de coleta de água, tamanho dos poros do filtro, tipo de bomba e configuração do tubo, duração da filtração e volume filtrado alcançável sob condições de entupido, logística de amostras a bordo e condições de armazenamento de curto prazo antes do envio. Como muitas etapas de processamento nos estudos de eDNA permanecem variáveis, recomenda-se fortemente o relato rigoroso de todas as amostragens e etapas analíticas.

A viabilidade desse protocolo é maior em estados de mar calmo a moderado (≤ Beaufort 3), com turbidez baixa a moderada, quando a bordo o tempo e o espaço permitem o processamento de dois filtros de eDNA por pegada flukeprint e um volume de água filtrada de 10 L por filtro. Na prática, cientistas treinados podem amostrar até Beaufort 3, mas cientistas cidadãos só devem trabalhar em condições calmas (Beaufort 1-2), devido ao movimento e turbulência das embarcações, apesar de passeios de observação de baleias às vezes operando em Beaufort 3. A filtração deve começar o mais rápido possível após a coleta da água para minimizar a degradação doDNA 47,74. Estratégias de amostragem que minimizam a diluição induzida pela hélice do eDNA da superfície, como a amostragem dos lados de sotavento e inferiores da embarcação, apoiam ainda mais a precisão da mira e detecções confiáveis47. Evitar manobras reversas e impedir que cordas (presas a baldes) entrem em contato com amostras de água do mar reduz ainda mais o risco de contaminação, em conformidade com as melhores práticas de eDNAaquático 38. Dependendo da configuração e logística do navio (por exemplo, altura, movimento e espaço disponível a bordo), duas estratégias de amostragem são suportadas se aplicadas consistentemente: (i) coleta e filtragem independentes de duas réplicas de 10 L usando dois baldes separados, ou (ii) coleta de uma única amostra de água de 20 L transferida para um recipiente estéril selado para transporte seguro a bordo e posteriormente dividida em duas réplicas de 10 L para filtração. Um volume de filtração de 10 L por filtro representa um compromisso prático entre probabilidade de detecção e esforço de filtração em condições de observação de baleias.

Volumes maiores aumentam a probabilidade de captura de eDNA raro ou de baixa concentração, e reduzem falsos negativos comuns em estudos com cetáceos 39,40,75, permanecendo operacionalmente viáveis quando combinados com filtros autopreservantes e poros de grandes dimensões 42. Cargas elevadas de partículas, movimento da embarcação, espaço limitado no convés ou restrições de tempo podem reduzir a eficiência de filtragem e os volumes alcançáveis, limitando assim a aplicabilidade do protocolo. Nesses casos, adaptações alinhadas ao protocolo, como redução de volumes de água ou tamanhos alternativos de poros dos filtros, podem ser necessárias e devem ser aplicadas consistentemente em campanhas de amostragem para manter a comparabilidade dos dados. Duração da viagem, momento dos encontros com baleias e capacidade de filtragem determinam os números de amostras alcançáveis. Em passeios padrão de observação de baleias de 3 horas, uma a duas amostras de tremato (ocasionalmente três) geralmente podem ser concluídas sem interromper as operações ou a experiência de ciência cidadã. Durante expedições mais longas, a capacidade de amostragem escala com o esforço diário de observação de baleias (por exemplo, ~8 horas por dia em nosso estudo de caso na Itália). Na prática, a amostragem de eDNA poderia ser implementada nos três locais durante o pico de atividade turística.

Sucesso na amplificação do eDNA e controle de contaminação
Amostras ambientais, especialmente aquelas coletadas em águas ricas em nutrientes, podem conter inibidores de PCR capazes de suprimir a amplificação e gerar falsosnegativos 76. Embora nenhuma inibição tenha sido detectada em análises anteriores de amostras islandesas dentro do mesmo projeto42, a inclusão de uma etapa de remoção de inibidores garantiu sucesso consistente na amplificação (veja Tabela de Materiais) e está alinhada com as recomendações de melhores práticas para fluxos de trabalho de eDNAaquático 14,55.

Desempenho consistente na detecção de qPCR em diferentes regiões indica que o protocolo captura de forma confiável o eDNA de cetáceos sob diversas condições ambientais. Pequenas variações de Ct provavelmente refletem diferenças regionais em temperatura, turbidez e produtividade, que influenciam a liberação, degradação e dispersão do eDNA75,76. O limite de detecção do ensaio (0,0001 ng/μL) está dentro da faixa de sensibilidade relatada para outros ensaios validados de cetáceos desenvolvidos no projetoeWHALE 14,11,42. As taxas de detecção foram consistentes com investigações previamente publicadas baseadas em flukefootprint, ressaltando a influência do comportamento da espécie e da frequência de emergência no sucesso da detecção 41,42,47. Padrões de DNA derivado de tecidos foram usados para quantificação de qPCR, refletindo uma prática comum em pesquisas de eDNAmarinho 57,72,77,78,79. Embora essa abordagem possa introduzir variância na quantificaçãoabsoluta 11,61,80,81,82,83, especialmente para amostras ambientais de baixa concentração e heterogêneas 84,85, ela reflete a complexidade amostral do mundoreal 55,86. O uso de padrões sintéticos pode melhorar a reprodutibilidade quantitativa e a comparabilidade entre estudos, sendo recomendado para aplicaçõesfuturas 11,87.

Fontes potenciais de contaminação incluem transferência cruzada de amostras, bem como a introdução de DNA humano ou ambiental não alvo durante as etapas de manuseio, o que pode levar a detecções falsamentepositivas. O controle rigoroso da contaminação é essencial em todo o processamento de campo e laboratório, especialmente nas condições restritas típicas das operações de ciência cidadã. Trocas rotineiras de luvas, uso de equipamentos sem DNA, sistemas de filtragem fechados, treinamento padronizado, inclusão rotineira de controles de campo e laboratório, documentação de potenciais eventos de contaminação e validação de ensaios seguindo os frameworks estabelecidos são fundamentais para garantir a confiabilidade dos dados e a detecçãode espécies 11,31,49,51,55,89 . Embora o uso de plástico seja uma limitação inevitável da amostragem molecular baseada em campo, o consumo foi minimizado sempre que possível, e materiais de filtração parcialmente biodegradáveis foram usados66.

Limitações, escalabilidade e implicações futuras
O entupimento do filtro continua sendo uma restrição chave em ambientes turvos ou produtivos, como a Baía de Skjálfandi (Islândia), onde a matéria orgânica suspensa e a densidade de plâncton provavelmente reduziram a eficiência defiltração em 43,90. Registrar a duração da filtração, indicadores de entupimento do filtro, como redução do fluxo, bolhas de ar visíveis no filtro ou tensão da bomba, e limitar o tempo de filtragem a aproximadamente 45 minutos por réplica apoiam a interpretação e comparação a jusante. O uso de um dispositivo flutuante esterilizado para suspender o filtro ou sacos de filtragem alimentados por gravidade pode potencialmente reduzir o tempo de manuseio durante a filtragem, embora este último possa ser incompatível com filtros de eDNA autopreservantes e grandes volumes (≥1 L)91. Filtros de poro maiores (≥ 5 μm) podem melhorar ainda mais as taxas de filtragem, embora a eficiência de detecção específica do táxon deva ser avaliada durante a amostragem piloto para eDNA decetáceos 45,92.

Considerações-chave antes da amostragem em escala total incluem: priorizar a filtração a bordo em vez do processamento retardado, manter volumes consistentes de água e configuração do filtro, realizar amostragem piloto para otimizar a filtração sob condições locais e alinhar o esforço de amostragem com a capacidade do navio e a duração da viagem. Ferramentas digitais de entrada de dados que possibilitam registro estruturado e de campo por cientistas cidadãos são recomendadas para aplicaçõesfuturas 93.

A aplicação bem-sucedida desse fluxo de trabalho do início ao fim demonstra robustez sob restrições operacionais, ao mesmo tempo em que destaca limitações relacionadas a espaço, tempo, clima e riscos de contaminação inerentes aos contextos da ciência cidadã10,94. Apesar dessas limitações, embarcações de observação de baleias representam uma plataforma poderosa e subutilizada para o monitoramento de cetáceos de eDNA quando treinamento padronizado e supervisão sãofornecidos 31,32,42,95. A integração desse fluxo de trabalho com ferramentas estabelecidas de monitoramento de cetáceos, como identificação foto, acústica passiva e amostragem por biópsia, pode conectar detecções genéticas a dados comportamentais e demográficos. Embora este estudo foque na detecção baseada em qPCR específica para espécies, aplicações futuras podem integrar metabarcoding de DNA ou análises genéticas populacionais, expandindo ainda mais o valor ecológico e de conservação do monitoramento do eDNA dos cetáceos.

À medida que as abordagens baseadas em eDNA continuam a prosperar, esse fluxo de trabalho fornece uma base escalável para integrar o monitoramento genético em programas existentes de observação e conservação marinha, especialmente em hotspots de cetáceos e ecossistemas sensíveis.

Divulgações

Belén García Ovide é fundadora e diretora executiva da Ocean Missions, uma organização sem fins lucrativos focada na conservação dos oceanos e sediada em Húsavík, no nordeste da Islândia. A Ocean Missions coordena amostragens de embarcações de observação de baleias na Islândia, bem como de embarcações de expedição ao Ártico. Ela também atua como representante da North Sailing, uma empresa de observação de baleias em Húsavík, dentro do projeto eWHALE. Essas afiliações não influenciaram o desenho do estudo, coleta de dados, análise ou interpretação dos resultados.

Agradecimentos

Gostaríamos de reconhecer todas as pessoas envolvidas no trabalho de campo e de laboratório, a saber:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot e Isabell Österle, que participaram de amostras coletadas na Baía de Skjálfandi, Islândia; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet nos Açores (Portugal); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson na Áustria; e iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri para coleta de dados no Santuário de Pelagos (Itália).

Esta pesquisa foi financiada pela Biodiversa+, a Parceria Europeia para a Biodiversidade no âmbito do chamado conjunto BiodivProtect para propostas de pesquisa 2021-2022, cofinanciada pela Comissão Europeia (GA nº 101052342) e com as organizações financiadoras: 1) Centro Islandês de Pesquisa (RANNÍS), (Bolsa nº 229030), 2) Ministério das Universidades e Pesquisa (MUR), a partir da conta especial FIRST e IGRUE relacionada à parceria europeia Biodiversa+ Call 2021 - projeto eWHALE, 3) o Fundo Austríaco de Ciência (FWF) [doi: 10.55776/I6389] e o fundo de publicações da Universidade de Innsbruck.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtros alternativos de eDNA: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 & micro; M tamanho de poros. Exigir buffers de preservação de eDNA  
AW1, AW2, buffers AEQiagen   19081, 19072, 19077Soluções tampão usadas para purificação de DNA durante a extração
Solução de água sanitária (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerPersonalizadoDescontaminação da superfície. Todas as etapas dos processos laboratoriais
BaldesLojas de barcos, equipamentos de pesca, AmazonRígido. Borracha ou plástico duro (≥ 10 L). Uma ou mais, dependendo da configuração de amostragem e da logística a bordo
Reagente de limpeza, PCR & nbsp expresso;ExoSAP-IT75001.1.EAPreparação de produtos PCR para sequenciamento Sanger
Caixa de resfriamentoHabitaçãoRecipiente rígido isolado ou saco de resfriamento
Luvas descartáveis, tamanhos Grande (L) e Médio (M),
Sem pó		Kimberly-Clark43431, 55090Luvas descartáveis de nitrilo ou látex, caixa de 100 unidades. Quantidade necessária: 1 caixa a cada 10 - 15 viagens
Padrões de DNA (3 & mu; L) NAPersonalizadoDiluição serial derivada de tecido de DNA (8 pontos, 10 ng/& micro; L) de baleia-jubarte. Calibração em qPCR
Roupas de laboratório seguras para DNAFalano, PP-Geral081-2900Todas as etapas dos processos laboratoriais.
Contêiner de eDNALojas de moradias ou ferragensNATampo, durável, transparente (≥ 10 L). 
Placa de elução, tampa da vareta, placas de lavagem, placa de ligaçãoQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Plásticos usados para extração de DNA  
Etanol (8:10)Aguente, o ISO do ACS soouVáriosEsterilização no banco. Todas as etapas do laboratório
Fichas de dados de campo
Ensaio de alta sensibilidade baseado em fluorescênciaThermo Fisher ScientificQ32851Ensaio de Alta Sensibilidade de Qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA)
Centrífuga de alta velocidade (24.000 rpm)Hettich Zentrifugen Separa o sobrenadante contendo DNA dos detritos. Lise de DNA
Bolsas de geloLojas de abrigoResfriamento das amostras dentro de contêineres de transporte
Espoletas IPC diretas e reversasTecnologias Integradas de DNANAProduto personalizado usado para amplificação do DNA da espécie-alvo
Sondas qPCR IPC PrimeTimeTecnologias Integradas de DNANAProduto personalizado usado para amplificação do DNA da espécie-alvo
Exaustor de fluxo laminar  Produtos do Laboratório KendroVFS1206Ambiente estéril para preparações de reagentes na preparação qPCR
Protocolo de campo ilustrado laminado  Personalizado
Buffer de liseQiagen79216Buffer de lise DNeasy AL. Alternativa ao TES Buffer + Proteinase K
Conta magnética e traço; Robô de DNA baseadoCabeça PCR KingFisher Apex 965400910Software: BindIx PC 
Partículas magnéticas para ligação a ácidos nucleicos (30 & micro; L)Qiagen67563Partículas MagAttrait. Facilita a ligação do DNA a esferas magnéticas na extração de DNA
Master mix (5 & mu; L)EMM, Tecnologias de Vida4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
Centrífuga Mini Giradora de Placas  LabnetC1000Filtrar gotículas líquidas e condensação de PCR e microplacas
Kit de Remoção de Inibidores de PCR OneStep-96Pesquisa ZYMOD6035Purificação e remoção de contaminantes em extratos de eDNA  
Placas de PCRBio-RadHSP9601Poço Hard-Shell 96
Pipetas + pontas estéreis filtradasPipettes: BIOHIT, Dicas de filtro: Biozym Safe  Dicas para Selar   ProfissionalVáriosPipetas manuais ou eletrônicas podem ser usadas em vários volumes máximos
Centrífuga de Centrifugação de Placas  NANARemove bolhas antes do qPCR 
Proteinase KAvantor VWRA4392.0010Digere proteínas para ajudar a liberar DNA durante a lise
Água purificadaMilliQNAÁgua livre de RNase, usada para controles negativos e solução de limpeza  
Tubos de reação (2 mL)Eppendorf30120094Lise de DNA
Termocicladora quantitativa de PCR em tempo realAnalytikjenaNAPlataforma QTower 3G. Amplifica e quantifica o DNA em tempo real
CordasBarcos, lojas de ferragens, portos de pescaNAMaterial resistente (por exemplo, polietileno ou corda trançada). Comprimento pelo menos duas vezes a altura da embarcação
Filme de vedação, adesivo, ópticoBio-RadMSB1001Microselo 'B'. Selar a placa PRC antes da PCR
Filtros de eDNA autopreservantesSmith-Root 11579-251.2 & micro; M tamanho de poros. Quantidade por campanha de amostragem: conforme necessário
Contêiner de transporteLaboratórios, farmácias, AmazonVáriosIsolamento de isopor
Software para alinhamento e análise de sequências biológicasBio EditVersão 7Editor e Programa de Análise de Alinhamento de Sequências Biológicas Amigável para Windows 95/98/NT
Espremer garrafaLaboratórios, farmáciasVáriosRecheado com água sanitária doméstica (1:10)
Software de análise estatísticaEquipe do R Studio. (2023)Versão 4.2.1
Luvas esterilizadas sem DNASempercare  edição79712Todas as etapas dos processos laboratoriais.
Buffer TESProduto personalizado, equivalente ao buffer de lise DNeasy
Recipiente de resíduos tóxicosDescarte seguro de resíduos perigosos. Todos os passos
Lâmpada UV  SterilAIREsterilização em exaustor para preparação de qPCR
Vortex-genie 2 misturador de vórtices  Thermo Fisher Scientific50728002Homogeneiza e mistura reagentes. Análise de DNA, extração
Contêiner de resíduosLojas de abrigoPequeno recipiente rígido
Bomba d'água (peristáltica/vácuo)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Bombas portáteis
Marcador à prova d'águaVários

Referências

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

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