Cirurgia Estereotáxica em Ratos Bebês e Cuidados Pós-Operatórios

Resumo

A capacidade de expressar vetores virais no cérebro pré-puberal é fundamental para estudar os mecanismos celulares e de circuito para o desenvolvimento cerebral. Aqui, descrevemos um protocolo para realizar cirurgia viral estereotáxica em camundongos bebês nos dias pós-natais 11 ou 12 (P11-P12) e fornecemos diretrizes para o cuidado pós-operatório.

Resumo

Compreender os processos de desenvolvimento, celulares e circuitos ao longo do período pós-natal é crucial para elucidar as complexidades do desenvolvimento cerebral e seu impacto na maturação comportamental e social. A transição do bebê para a vida adulta envolve mudanças neurobiológicas significativas, incluindo poda sináptica e mielinização, que são fundamentais para habilidades cognitivas, regulação emocional e interações sociais. Estudar o desenvolvimento cerebral em camundongos pré-pubertais permite aos pesquisadores identificar períodos críticos que favorecem o crescimento cerebral saudável e estabelecer intervenções oportunas para distúrbios do neurodesenvolvimento. Para dissecar com precisão a função cerebral, a cirurgia estereotáxica tem sido uma técnica fundamental na pesquisa em neurociência, oferecendo precisão incomparável no direcionamento de regiões cerebrais de interesse e permitindo a entrega de agentes virais. Embora cirurgias estereotáxicas em camundongos adultos sejam amplamente implementadas em laboratórios de neurobiologia, existem diretrizes muito limitadas para a realização de cirurgias estereotáxicas em camundongos pré-puberais, bem como cuidados pós-operatórios cruciais para garantir que o bebê possa ser reintroduzido com sucesso à mãe e aos irmãos de ninhada. Aqui, descrevemos um protocolo para cirurgia estereotáxica e injeção viral em camundongos infantes (P11-P12), destacando a administração de anestesia e analgesia, considerações para o cuidado pós-operatório e diferenças em relação à cirurgia estereotáxica em adultos. Esse protocolo pode ser implementado em qualquer região cerebral de interesse atualizando as coordenadas alvo desejadas e pode ser modificado para direcionamento cerebral em estágios posteriores do desenvolvimento pós-natal, como durante o período juvenil (P15-P30). No geral, esse protocolo oferece um ponto de entrada para o estudo do desenvolvimento e função cerebral pós-natal.

Introdução

A infância e a adolescência são períodos pós-natais cruciais para o desenvolvimento cerebral, caracterizados por mielinização, sinaptogênese e poda sináptica, que facilitam o refinamento dos^{circuitos 1,2}. O surgimento de comportamentos sociais, incluindo acasalamento, agressividade e brincadeira social, ocorre durante o período peripuberal (P28-40)³, e é fortemente regulado pelos hormônios esteroides^{circulantes 4,5}. Apesar dos avanços significativos em ferramentas para dissecar a base celular dos comportamentos sociais em adultos, pouco se sabe sobre os mecanismos neurais que sustentam o surgimento de comportamentos sociais ao longo do desenvolvimento pós-natal. As razões para a falta de compreensão dos circuitos sociais em desenvolvimento incluem: 1) desafios associados à realização de cirurgias em camundongos bebês, incluindo equipamentos estereotáxicos não instalados para camundongos mais jovens, 2) equilíbrio entre a segurança e a eficácia da analgesia e anestesia durante a^{cirurgia 6}) e 3) aceitação dos bebês pela barragem após a cirurgia. Além disso, os métodos atuais utilizados para entregar construtos genéticos em pontos pós-natais precoces, como eletroporação^{in utero 7}, injeção viral intracerebroventricular no cérebro⁸ do camundongo neonatal (P0-P10), ou cruzamentos genéticos de driver de recombinase e linha^{responsiva 9}, não são ideais, pois carecem de direcionamento preciso e foco na direcionamento embrionário ou P0.

Aqui, fornecemos um protocolo simples para cirurgia estereotáxica em camundongos bebês (P11-P12) e cuidados pós-operatórios para apoiar a reintegração bem-sucedida com a mãe e os irmãos de ninhada. Esse protocolo utiliza o protocolo estereotáxico atual para camundongos^{adultos 10} e requer apenas pequenas alterações na configuração estereotáxica. Também fornecemos orientações detalhadas sobre cuidados pós-operatórios e sobre anestesia e analgesia bem-sucedidas em camundongos bebês. Selecionamos o momento P11-12 para a cirurgia, pois há um período de incubação de 2 semanas para a expressão viral, permitindo que os camundongos sejam testados in vivo a partir do P24, antes do período peripúbero (P28-40)³. No entanto, esse mesmo protocolo pode ser usado para cirurgia estereotáxica em momentos posteriores. Focamos na amígdala medial em desenvolvimento (MeA), uma subdivisão da amígdala caracterizada por seu papel em um conjunto diversificado de comportamentos^{sociais 11,12}. Investigamos especificamente a subpopulação de MeA que expressa Foxp2 (^{MeA Foxp2})¹³, um fator de transcrição forkhead box, pois já descobrimos anteriormente que essas células são exclusivamente programadas para o processamento in vivo dos sinais sensoriais masculinos em camundongos machos ao longo do desenvolvimento^{pós-natal 14}. Além disso, a subpopulação MeA^Foxp2 precisa modular bidirecionalmente a agressão territorial nos^{machos 14}. No geral, o protocolo atual permite que os neurocientistas administrem com precisão agentes virais em regiões cerebrais alvo em estágios-chave do desenvolvimento pós-natal para estudar as bases celulares e de circuitos dos comportamentos sociais e afiliativos durante a adolescência e a vida adulta.

Protocolo

Esse procedimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do NIEHS e estava de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o uso e cuidado de animais. Equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas, máscara facial, avental descartável, rede para cabelo e protetores para sapatos, foram usados durante toda a cirurgia e na presença de animais.

1. Preparação e ajustes de aparelhos estereotáxicos para camundongos (Figura 1)

1. Prepare o aparelho estereotáxico com acessórios estereotáxicos para camundongos bebês, incluindo um par de abafadores auriculares não rapture, um suporte de cabeça para anestesia a gás modificado e uma barra para o paladar para bebês P12.
2. Higienize todas as ferramentas cirúrgicas com um esterilizador de contas de vidro (250 °C, 30 segundos para ferramentas menores e 1 min para ferramentas maiores). Coloque ferramentas estéreis sobre uma cortina estéril após a esterilização. As ferramentas estéreis devem permanecer no campo estéril durante toda a cirurgia.
3. Coloque outra cortina estéril sobre uma almofada térmica a uma temperatura de ~37 ^°C no equipamento estereotáxico para manter o bebê em temperatura controlada durante todo o procedimento cirúrgico. Monitore a temperatura da almofada térmica durante todo o procedimento cirúrgico.

2. Preparação cirúrgica do camundongo, colocação estereotáxica, nivelamento e craniotomia

1. Meça o peso corporal para fornecer a dose adequada de analgesia.
2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 3%, com uma vazão de oxigênio de 0,9 L/min. Verifique se a respiração do rato diminuiu para ~1 respiração/s e que não há resposta após testar o reflexo de retirada do pedal. Mude o fluxo de isoflurano/oxigênio para o sistema estereotáxico e reduza a concentração de isoflurano para 2%.
   NOTA: A anestesia adequada deve ser confirmada pela ausência de respostas ao reflexo de retirada do pedal a cada 5 minutos durante a duração do procedimento cirúrgico. Observe cuidadosamente o padrão respiratório do rato durante toda a cirurgia. Ajuste a concentração de isoflurano durante toda a cirurgia para que a menor porcentagem seja usada para manter a anestesia profunda e evitar overdose.
3. Monte o rato no aparelho estereotáxico modificado com acessórios estereotáxicos para camundongos bebês. Coloque barras auriculares sem perfuração na lateral da cabeça do mouse e alinhe a régua da barra auricular para que fique equidistante para ambos os lados em relação à régua estereotáxica. Para bebês P11, ajuste a régua estereotáxica em 5 mm.
   NOTA: Bebês no P11 normalmente ainda não têm os olhos abertos, então não é necessário lubrificante ocular. No P12, alguns bebês já têm os olhos abertos. Se os olhos do bebê estiverem abertos, deve ser aplicada pomada oftálmica e reaplicada conforme necessário durante toda a cirurgia.
4. Injete Meloxicam de 5 mg/kg pela via intraescapular subcutânea (s.c.) usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 27 G.
5. Dilua bupivacaína a 0,5% (5 mg/mL) com soro fisiológico para 0,5 mg/mL (1:10) e injete s.c. sob a pele da cabeça (ou seja, 0,05 mL para um bebê de 5 g).
   NOTA: Os passos 2.6 a 3.15 devem ser realizados com luvas estéreis.
6. Realize uma incisão de 1,5 cm com uma pequena tesoura ao longo da linha média da cabeça.
7. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente o tecido mole da superfície do crânio junto com betadina.
8. Coloque um capilar de vidro puxado (~0,8 mm de comprimento) em um suporte de pipeta de vidro. Monte o suporte no braço estereotáxico vertical.
   NOTA: Os passos 2.9 a 3.10 devem ser realizados sob um microscópio dissecante.
9. Nivelar o ângulo antero-posterior da superfície do crânio:
   1. Mova o capilar para a confluência rostral dos seios dorsais (RCS) (Figura 2), conforme descrito em Chan et ^al.15.
   2. Sob um microscópio com ampliação 2x, zero as coordenadas X (Medial-Lateral), Y (Anterior-Posterior) e Z (Dorsal-Ventral) quando o capilar estiver tocando levemente o crânio no ponto RCS usando o console digital do instrumento estereotáxico.
   3. Mova o capilar para lambda (em Y = -7,30 mm) e abaixe o capilar para tocar levemente o crânio (Figura 2).
   4. Verifique o valor das coordenadas Z e nivele o ângulo antero-posterior no equipamento estereotáxico para alterar o ângulo de inclinação da cabeça. Repita os passos 2.9.1 a 2.9.3 até que a diferença no valor da coordenada Z entre RCS e lambda seja <0,02 mm.
10. Nivelar o ângulo medial-lateral da superfície do crânio:
    1. Mova o capilar para o ponto RCS.
    2. Zero as coordenadas X (Medial-Lateral) e Y (Anterior-Posterior) quando o capilar está ligeiramente em contato com o crânio no ponto RCS.
    3. Para nivelar a cabeça usando as coordenadas MeA posterodorsais (MeApd), mova o capilar para X = +2,50 mm, Y = -4,20 mm e zero Z (Dorsal-Ventral) enquanto o capilar toca levemente o crânio.
    4. Mova o capilar para X = -2,50 mm, Y = -4,20 mm no outro hemisfério e abaixe levemente o capilar até tocar o crânio.
    5. Verifique o valor de Z e ajuste o eixo Medial-Lateral no equipamento estereotáxico para alterar o ângulo de inclinação da cabeça. Repita os passos de 2.10.1 a 2.10.4 até que a diferença no valor Z entre os hemisférios direito e esquerdo seja <0,03 mm.
11. Remova o suporte capilar e monte uma microfuradeira com uma broca #75 em um suporte estereotáxico para furadeira no braço estereotáxico vertical.
12. Coloque a ponta da broca acima do ponto RCS, zero as coordenadas X (Medial-Lateral) e Y (Anterior-Posterior). Mova para X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm para atingir o MeApd dos bebês P11.
13. Faça uma craniotomia de 0,5 mm de diâmetro no crânio.
14. Limpe cuidadosamente a superfície do crânio com soro fisiológico estéril usando lenços delicados e cotonetes.
    NOTA: Aplique soro fisiológico estéril regularmente para manter a superfície do crânio hidratada.

3. Injeção viral

1. Preencha um novo capilar com óleo mineral usando uma agulha flexível microfil.
2. Conecte e aperte o capilar ao injetor de nanolitro.
3. Remova a microfuradeira e monte o injetor de nanolitros no braço estereotáxico vertical.
4. Retire pelo menos o dobro da quantidade de vírus necessária para a cirurgia (aqui, 400 nL) a uma taxa de 10 nL/s.
   NOTA: Qualquer vírus AAV de interesse pode ser usado para injeção viral após aprovação institucional. Neste protocolo, utilizamos AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2,5 E+13 vg/mL, 3 μl/tubo, armazenado a -80 °C e depois transferido para gelo para cirurgia).
5. Mova o capilar para o ponto RCS e zere as coordenadas X e Y.
6. Mova o capilar para a área cerebral alvo de interesse, aqui a MeApd (coordenadas: X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm, Z= -5,08 mm a partir do RCS).
7. Abaixe o capilar até a superfície do crânio, depois zere a coordenada Z.
8. Abra um caminho abaixando o capilar até a profundidade desejada e retirando o capilar do cérebro.
9. Injete ~8 nL de vírus para garantir que o capilar não esteja entupido antes de inserir novamente no cérebro. Se estiver entupido, adicione soro sorológico estéril ao limpador de trabalho e limpe suavemente as laterais e a parte inferior do capilar para eliminar a obstrução.
10. Abaixe o capilar mais uma vez até a profundidade desejada e injete a quantidade viral desejada (neste caso, 150 nL de vírus) a uma taxa de 20 nL/min.
11. Quando terminar, espere 5 minutos antes de retirar lentamente o capilar.
12. Se necessário, repita os passos 3.4-3.11 para injetar o vírus no hemisfério contralateral.
13. Remova o capilar do injetor de nanolitros. Descarte capilares usados e tubos virais em um tubo cônico de 50 mL com 10% de água sanitária.
    NOTA: Laboratórios individuais devem seguir todas as diretrizes de manuseio de resíduos, manejo de derramamentos e conformidade com biossegurança de seu Setor Institucional de Biologia e Biossegurança.
14. Suture a pele com um ponto 7-0 não absorvível. Tente levantar o cabelo ao suturar para que os pontos permaneçam escondidos.
    NOTA: Normalmente, 3-4 pontos são suficientes. Em nossas mãos, um ponto 7-0 funciona melhor para evitar que a mãe rasgue os pontos assim que o bebê for devolvido à gaiola.
15. Limpe a área do ponto com peróxido de hidrogênio a 3%, seguido de soro fisiológico usando cotonetes estéreis.
    NOTA: A cirurgia normalmente dura entre 1 e 2 horas, dependendo do número de vírus injetados. Vírus normalmente exigem no mínimo 2 semanas para a expressão completa.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Retire o bebê da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma gaiola limpa sobre uma bolsa térmica. Para prevenir a desidratação, recomenda-se a injeção de solução salina estéril.
2. Monitore o bebê até que ele esteja móvel.
3. Quando o bebê puder se mover pela gaiola, coloque a represa em uma nova gaiola limpa por ~2 minutos.
4. Coloque o filhote em sua gaiola original ao lado de seus irmãos de ninhada. Limpe cuidadosamente todos os filhotes com material de ninho e cama da gaiola de casa e coloque-os de volta dentro do ninho. Proceda a colocar a represa de volta na gaiola.
5. Monitore a mãe e os bebês de perto. Confirme que a mãe retorna ao ninho e limpa o bebê cirúrgico, mas não puxa os pontos.
6. Se após 1 hora a mãe não aceitar o bebê cirúrgico, use uma mãe de acolhimento. Se uma mãe já demonstrou aceitar filhotes, use essa represa para ninhadas subsequentes (a aceitação após aceitar filhotes na primeira ninhada foi 100%).
7. Vinte e quatro horas após a cirurgia, verifique o local da incisão e administre Meloxicam (5 mg/kg, s.c.).
8. Após o bem-sucedido do cuidado pós-operatório, deixe o rato cirúrgico com a mãe e os irmãos de ninhada até ser desmamado no P21. Remova quaisquer pontos visíveis dentro de 10 a 14 dias após a cirurgia.
   NOTA: Não se esperam diferenças significativas na ingestão de alimentos, peso corporal ou comportamento de locomoção nos camundongos cirúrgicos em comparação com os controles de ninhada.
   Os bebês serão monitorados diariamente por pelo menos 2 dias após a cirurgia e depois pelo menos 2 vezes por semana. Critérios Humanos para o Desfecho: Se o bebê não for ambulatório após 2 horas após a cirurgia, será eutanasiado de forma humana. Se o bebê apresentar diminuição do peso corporal e/ou locomoção após a cirurgia, ele será eutanasiado de forma humana.

Resultados

Segurança da combinação de isoflurano, bupivacaína e meloxicam para cirurgias infantis
A segurança do uso de anestesia e analgesia em camundongos bebês permanece^{incerta 6}. Portanto, testamos o uso de uma combinação de anestesia e analgesia em camundongos bebês para determinar a taxa de sobrevivência. Camundongos bebês com P11 (peso corporal = 6,09 ± 0,90 g, o menor peso corporal foi 3,9 g; n=13) foram colocados na câmara de indução para anestesia inicial com 3% de isoflurano em 0,9 L/min de oxigênio. Uma vez que os bebês estavam anestesiados e não respondiam ao reflexo de retirada dos pedais, eram transferidos para o aparelho estereotáxico, e a anestesia com isoflurano era reduzida para 1,5-2% de isoflurano em 0,9 L/min de oxigênio com uma almofada de aquecimento (41,23 ± 2,28 °C). Após a colocação dos bebês no aparelho estereotáxico, foi administrada analgesia interescapular (5 mg/kg de Meloxicam), além de anestesia tópica administrada sob a pele da cabeça (0,05 mg/mL de Bupivacaína). Trinta minutos depois, retiramos os bebês do equipamento estereotáxico e os colocamos em uma gaiola limpa. Observamos uma taxa de sobrevivência de 100% (13/13) 30 minutos após a administração da analgésia. Além disso, não observamos complicações nas 24 e 72 horas após a cirurgia, nem na vida adulta. Esses resultados demonstram que combinar anestesia local com um anti-inflamatório não esteroide é seguro para camundongos bebês e reduz a dor e o sofrimento.

Entrega viral precisa e exata no MeA
Para confirmar a precisão e exatidão da entrega viral durante as cirurgias estereotáxicas do bebê, administramos AAV2-hSyn-DIO-mCherry bilateralmente no MeApd de camundongos machos Foxp2^cre+/- no P11 (Figura 3A). Os camundongos foram então desmamados em P21. No P45, cérebros de camundongos foram coletados para imunohistoquímica e análise de imagem, conforme descrito anteriormente pelo nosso grupo¹⁴ e outros¹⁶ (Figuras 3B,C). Os camundongos foram anestesiados e perfundidos com 30 mL de 1× PBS, seguidos por 30 mL de PFA a 4% a 10 mL/min. Os cérebros foram fixados durante a noite a 4 °C em 4% de PFA, crioprotegidos em 30% de sacarose, inseridos em O.C.T. e seccionados a 50 μm em criostato. A cada terceira seção foi processada para imunohistoquímica, conforme descrito^{anteriormente, 14}. As seções flutuantes foram bloqueadas em 10% de soro de burro normal, incubadas com o anticorpo primário durante a noite, lavadas, incubadas com o anticorpo secundário por 4 horas, lavadas novamente e montadas com meio contendo DAPI antes do coverslip. As seções cerebrais foram coradas com anticorpo Foxp2 e Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L).

Para confirmar a eficiência do alvo, determinamos a coexpressão das células mCherry⁺ e Foxp2⁺ na MeA e observamos sobreposição de 90,2% ± 2,1 entre populações, indicando que a expressão de mCherry é restrita às células Foxp2+ de forma dependente de cre (Figura 3D). Esse resultado destaca a alta eficiência da injeção viral usando esse protocolo. Além disso, investigamos a precisão das injeções virais analisando a porcentagem de células de mCherry+ no MeApd em relação ao total de mCherry em todas as regiões. Observamos que 93,7% ± 1,4 das células de mCherry⁺ estavam localizadas dentro do MeApd, indicando que a expressão espacial do vírus é restrita à nossa região de interesse (Figura 3E).

Figura 1: Preparação para cirurgia estereotáxica infantil. (A) Equipamento estereotáxico. (B) Barras auriculares sem ruptura. (C) Suporte de cabeça e barra para anestesia gasosa para bebês P12. (D) Esterilizador de contas. (E) Controlador de almofada térmica. (F) Braço estereotáxico. (G) Injetor de nanolitro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Principais pontos de referência no crânio do camundongo P11. (A) Ilustração esquemática dos principais pontos de referência no crânio do bebê. (B) A cabeça do bebê é fixada por acessórios estereotáxicos especializados que incluem barras auriculares anti-ruptura, um suporte de cabeça para gás modificado e uma barra de pellets para camundongos P12. Abreviação: RCS = Confluência rostral dos seios nasais, SSS = Seo sagital superior, RRV = veias rostral-renas, SOS = Seo olfativo superior. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Expressão viral bilateral direcionada na MeApd após cirurgia estereotáxica infantil. (A) Ilustração esquemática do MeApd (vista coronal). (B) Imagem histológica representativa da expressão bilateral do anticorpo Foxp2 (verde) e das células mCherry⁺ (magenta) em camundongos machos adultos Foxp2^cre+/- adultos. (C) Visão ampliada do MeA tanto a partir de canais fundidos quanto individuais. Setas brancas indicam anticorpos Foxp2 e células mCherry+ co-marcadas. (D) Eficiência da injeção. (E) Precisão da injeção. (D,E) n=3 camundongos, hemisférios esquerdo e direito/rato. Abreviações: MeApd = amígdala medial posterodorsal; MeApv = amígdala medial posteroventral. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Métodos	Prós	Contras	Referência
Eletroporação in utero	Transfecção de plasmídeos maiores	Falta-lhe uma mira precisa, toxicidade, é necessário ser altamente qualificado	Wang, et al., Methods Mol Biol. (2013).
Injeção viral intracerebroventricular	Rápido, fácil, econômico	Falta de mira precisa, risco de infanticídio	Kim, et al., J Vis Exp. (2014).
Microinjeção estereotáxica em P0	Segmentação precisa, menor risco de rejeição materna	Toxicidade celular devido ao vírus, não ideal para estudar os pontos de tempo pós-puberal	Chen, et al., J Vis Exp. (2018).
Cruzamento genético de linhas de recombinase	Não invasiva	Falta mira precisa, é caro	Robertson et al., Nat Neurosci. (2013).

Tabela 1: Resumo dos métodos anteriores usados para estudar o desenvolvimento embrionário e pós-natal celular e de circuitos em roedores.

Discussão

Estudar os mecanismos neurais subjacentes aos comportamentos sociais ao longo do desenvolvimento pós-natal é essencial para entender não apenas seu surgimento, mas também como esses mecanismos podem ser interrompidos por fatores ambientais ou em transtornos neurodesenvolvimentais. Nosso estudo descreve um protocolo detalhado para cirurgia estereotáxica para administrar o vírus de forma precisa e eficiente nos cérebros de camundongos bebês P11-12. Portanto, esse protocolo permite a manipulação, registro e estudo de circuitos de subpopulações neuronais definidas molecularmente antes e depois da puberdade, utilizando uma estratégia viral. Destacamos modificações e cuidados pré e pós-operatórios, bem como uma combinação segura de agentes anestésicos e analgésicos bem tolerados por camundongos bebês.

Um componente fundamental e desafiador da cirurgia estereotáxica infantil é reintroduzir com sucesso o bebê em sua gaiola de origem com sua mãe e irmãos de ninhada. Para garantir o cuidado adequado do bebê após a reintrodução à gaiola, a mãe deve buscar e escovar o bebê (sem supercuidar), e quaisquer sinais de possível negligência devem ser monitorados de perto. Devido à incisão e pontos do bebê, a mãe pode sobrecobrar a área da cabeça, podendo resultar no rasgão e remoção dos pontos. Isso seria prejudicial e, por isso, monitorar o comportamento da mãe em relação ao bebê após a cirurgia é fundamental para garantir a sobrevivência. Para aumentar a aceitação do bebê após a cirurgia, recomendamos o uso de água peróxida de hidrogênio e soro fisiológico após a sutura para limpar qualquer resíduo de sangue remanescente da pele e pelo, além de usar suturas mais finas (7-0) do que as usadas em adultos (5-0). Essas duas estratégias resultaram na aceitação da mãe de camundongos bebês pós-cirúrgicas.

Além disso, nosso estudo fornece orientações sobre o uso seguro de anestesia e analgesia em cirurgias infantis. Isso é fundamental, pois recém-nascidos e camundongos bebês não suportam as dosagens de analgesia e anestesia tão bem quanto os adultos, o que pode levar a efeitos colaterais respiratórios e cardíacos^{prejudiciais 6}. Observamos que isoflurano, uma anestesia oral, e a combinação de analgesia meloxicam e bupivacaína, administradas subcutaneamente (intracuspular e sob a pele da cabeça, respectivamente), foram bem tolerados pelos bebês e resultaram em sobrevivência a longo prazo. Além disso, já mostramos anteriormente que o procedimento cirúrgico estereotáxico em camundongos bebês levou a tempos de investigação semelhantes para conspecípicos em camundongos juvenis 2 semanas após a cirurgia, em comparação com controles de idade compatível que não passaram por^{cirurgia 14}. Portanto, esses resultados indicam recuperação suficiente e ausência de déficits motores evidentes após a cirurgia em camundongos bebês. Vale ressaltar que não medimos a oxigenação do sangue durante toda a cirurgia. Os níveis de oxigênio no sangue devem ser monitorados com um oxímetro de pulso para prevenir^{hipóxia 17}.

Outro componente crítico desse protocolo é o uso do sistema de coordenadas estereotáxicas baseado na lambda e no RCS na linha média^{sagital 15}. O RCS é um marco definido pela junção do seio sagital superior e da junção do seio olfatório superior ao longo da linha média sagital. Este ponto de referência demonstrou apresentar variabilidade posicional consistentemente menor do que outros marcos dorsais após o alinhamento global da cabeça. Isso ocorre porque o aumento da distância de separação entre RCS/lambda, em comparação com bregma/lambda, aumenta a estabilidade e reprodutibilidade da angulação horizontal^{interanimal 15}.

Métodos anteriores para estudar o desenvolvimento neuronal focaram em estratégias virais em pontos de tempo embrionários e P0, ou em cruzamentos genéticos para células de mapeamento do destino de interesse (Tabela 1). Técnicas como eletroporação in utero e injeções virais intracerebroventriculares carecem de alvo preciso. Realizar injeções virais direcionadas em P0¹⁸ resolve esse problema ao injetar precisamente um construto viral em uma região de interesse. No entanto, construtos virais podem se tornar citotóxicos após várias semanas, levando à morte celular. Portanto, injetar um construto viral no cérebro do recém-nascido para estudos puberais longitudinais que possam continuar na vida adulta pode não ser o ideal. Portanto, nossa abordagem, na qual a injeção viral ocorre uma semana e meia após o nascimento, reduz o risco de toxicidade celular durante a puberdade.

Apesar das vantagens da nossa abordagem, várias considerações permanecem. Primeiro, as coordenadas cerebrais usadas em camundongos bebês precisam ser modificadas em relação às usadas em adultos. Por exemplo, em camundongos bebês P11, usamos as seguintes coordenadas para atingir o MeApd: X= +2,03 mm, Y= -4,20 mm, Z= -5,08 mm; enquanto as coordenadas usadas em adultos são X= +2,15 mm, Y= -5,00 mm, Z= -5,10 mm. Infelizmente, há menos referências de atlas cerebral para camundongos^{pré-pubertais 19} do que para camundongos adultos (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org e atlas.brain-map.org)^20,21. Portanto, para alcançar com sucesso o direcionamento viral correto em outras regiões cerebrais além do MeA, os pesquisadores precisarão obter uma estimativa informada das coordenadas e realizar testes de coordenadas. Segundo, o tempo de incubação dos AAVs precisa ser considerado. O tempo ideal de incubação para a expressão in vivo de AAV é de pelo menos 2-3 semanas. Considerando que, em nosso protocolo, a cirurgia estereotáxica é realizada em camundongos bebês no P11, os pesquisadores só poderão começar a testar camundongos após a cirurgia no P25, após o período ótimo de incubação do AAV.

No geral, esse protocolo fornece diretrizes detalhadas para que os pesquisadores possam atingir regiões cerebrais de interesse com alta precisão em camundongos bebês usando vetores virais. Essa abordagem é altamente vantajosa, pois é extremamente flexível: qualquer construção AAV comercial ou personalizada pode ser injetada. Assim, permite estudar subpopulações celulares de interesse definidas molecularmente e seus circuitos anatômicos, dinâmica neuronal e papel celular antes e depois da puberdade durante uma janela de tempo crítica alinhada com o surgimento de comportamentos sociais. Além disso, essa abordagem é bem-sucedida para atingir não apenas a amígdala, como mostrado aqui, mas também outras estruturas subcorticais, como o hipotálamo e regiões corticais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Broca #75	Cidade da Broca de Perfuração	10WS75-850FL
Agulha de 27 G	Covetrus	60757
Peróxido de hidrogênio a 3%	Swan	NDC 0809-0871-43
32% de paraformaldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherry	Addgene	50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) Anti-Coelho IgG (H+L)	Pesquisa Imunológica Jackson	711-545-152
Balanço Analítico	Sartorius	1102--15
Betadine	Farmácia Avrio	NDC 67618-155-15
Bupivacaína	Hospira	NDC 0409-1163-18
Criostato	Leica	CM1950
Microscópio Dissecador	Zeiss	2149-629
Pomada para os olhos	Veterinária Dechra	Puralube
Mídia de Montagem Fluoromount com DAPI	Thermo Fisher Scientific	00-4959-52
Anticorpo Foxp2 (1:1000)	Anticorpos Atlas/Bio Cosmo	HPA000382
Foxp2cre+/-	O Laboratório Jackson	30541
Suporte para Cabeça e Barra de Paladar para Anestesia a Gás para Filhotes P12	Instrumentos David Kopf	1934-C
Esterilizador de Contas de Vidro	Fisher Scientific	10-000-632
Capilar de Vidro	Instrumentos de Precisão Mundial	504949
Suporte para Pipeta de Vidro	Instrumentos David Kopf	1975-1.2-A
Bolsa térmica	Kent Scientific  Corporation	RT-0520
Isoflurano	Piramal Cuidados Críticos	NDC 66794-017-10
Meloxicam	Suprimentos Veterinários Pivetal	NDC 46066-937-13
Micro Broca	Instrumentos David Kopf	Modelo 1911 Drill
Agulha Flexível Microfil	Instrumentos de Precisão Mundial	MF28G67-5
Lâminas de microscópio	Thermo Fisher Scientific	12-550-15
Óleo Mineral	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Injetor de Nanolitros	Instrumentos de Precisão Mundial	NANOLITER2020
Sutura Não Absorvível	Cirurgia AD	S-N718SP13
Barras auriculares não-rapture	Instrumentos David Kopf	1921-A
Soro de Burro Normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Complexo O.C.T.	Sakura	4583
Equipamento Estereotáxico	Instrumentos David Kopf	1900
Cotonete Estéril	ULINE	S-21102
Drape Estéril	Descartáveis do Hospital Busse	696
Soro fisiológico estéril	Hospira	NDC 0409-1966-02
Água Estéril	Hospira	NDC 0409-4887-24
Sacarose	Fisher Chemical	S5-500
Seringa	Fisher Scientific	50-252-2568