Protocolo cirúrgico para uma grande janela craniana reselável que permite registros eletrofisiológicos longitudinais e multimodais da rede de modo padrão do camundongo

Resumo

Este protocolo descreve um método cirúrgico em duas fases para criar uma grande janela craniana revedável e preservadora da dura-máter em camundongos. Essa técnica permite registros eletrofisiológicos crônicos e multimodais a partir de redes transmissas profundas do cérebro, como a Rede de Modos Padrão, ao longo de várias semanas.

Resumo

A rede de modo padrão (DMN) é uma rede cerebral central e em grande escala implicada em uma variedade de funções cognitivas e transtornos neuropsiquiátricos, como o transtorno depressivo maior (TDM). Estudar a dinâmica complexa da DMN em modelos animais oferece insights valiosos sobre sua função tanto em estados saudáveis quanto patológicos. No entanto, realizar registros eletrofisiológicos estáveis, de longo prazo e em grande escala a partir dos múltiplos nós profundos e distribuídos do DMN em camundongos acordados e comportados continua sendo um desafio significativo.

Aqui, é apresentado um novo protocolo cirúrgico em duas fases para criar uma janela craniana grande (4 mm × 7,6 mm), durável e re-selável em camundongos. O procedimento é projetado para preservar a integridade da dura-máter, o que é fundamental para a saúde cerebral a longo prazo e a estabilidade do registro.

Essa janela permite registros longitudinais simultâneos, repetidos e de mais de 1.000 eletrodos combinando microeletrocorticografia em nível superficial (μECoG) com duas sondas intracranianas de alta densidade, proporcionando acesso sem precedentes ao DMN. Essa técnica oferece uma plataforma robusta para interrogação multimodal e multiescala da dinâmica eletrofisiológica em toda a rede ao longo de várias semanas, abrindo novas vias para investigar as mudanças neuroplásicas subjacentes à fisiopatologia dos distúrbios cerebrais e para avaliar os efeitos crônicos de terapêuticas inovadoras.

Introdução

A Rede de Modos Padrão (DMN) foi identificada pela primeira vez em estudos de imagem cerebral humana como uma constelação de regiões consistentemente suprimidas durante tarefas orientadas externamente e que demandam atenção¹. Atualmente, é considerada uma rede fundamental de grande escala que apoia processos cognitivos orientados internamente, como pensamento autorreferencial, memória autobiográfica e planejamento de eventos^{futuros 2,3}. Nos humanos, a DMN canônica compreende um conjunto de regiões centrais anatomicamente conectadas, incluindo o córtex pré-frontal medial (mPFC), córtex cingulado posterior (PCC), lóbulo parietal inferior (IPL) e a formação^{do hipocampo 4}. A disfunção dentro dessa rede é uma característica fundamental de vários transtornos neuropsiquiátricos. No transtorno depressivo maior (TDM), o DMN frequentemente apresenta hiperatividade e padrões alterados de conectividade funcional, que se acredita estarem por trás dos sintomas centrais do TDM, como ruminação e autoimagem^{negativa 5,6}.

Para estudar os mecanismos celulares e de circuitos que causam a disfunção do DMN, modelos animais robustos são indispensáveis. Um DMN homólogo foi identificado de forma confiável em roedores, consistindo em regiões cerebrais comparáveis como o mPFC, córtex cingulado e córtex retrosplenial (RSP), validando assim o camundongo como um modelo relevante para a tradução para investigação^{mecanicista 7,8}. Além disso, o estresse crônico, um fator chave na depressão, demonstrou alterar a conectividade do DMN em roedores de maneira semelhante à observada em pacientes humanos com^{TDM 9}.

Compreender as alterações neuroplásticas que ocorrem em estados de doença ou em resposta a intervenções terapêuticas crônicas requer observação longitudinal da atividade neural, já que uma única sessão de gravação não pode capturar a adaptação dinâmica dos circuitos neurais ao longo do^{tempo 10}. A eletrofisiologia in vivo fornece a resolução temporal em escala de milissegundos necessária para estudar oscilações neurais e sincronia no potencial de campo local (LFP). A LFP exibe o sinal extracelular somado refletindo a atividade sináptica sincronizada das populações neuronais locais, que são os substratos fundamentais da comunicação em^{rede 11,12}. No entanto, realizar registros eletrofisiológicos crônicos em grande escala em camundongos acordados continua sendo tecnicamente exigente. Janelas cranianas crônicas convencionais foram desenvolvidas para imagem óptica em camundongos acordados e permanecem como preparação padrão para esse fim, onde sua pegada típica de um hemisfério único e o revestimento de vidro transparente são ideais para a leitura^{pretendida 13}. No entanto, eles não foram projetados para eletrofisiologia multi-local acordada, de modo que a área de trabalho e a interface óptica impedem a gravação simultânea de alta densidade a partir dos nós bilaterais distribuídos de uma rede como a^{DMN 14}. Implantes crônicos de eletrodo, por sua vez, possibilitam registros longitudinais, mas provocam encapsulamento progressivo de corpos estranhos e cicatrizes gliais ao redor da haste permanentemente posicionada, reduzindo a qualidade do sinal ao longo do^{tempo 15,16}.

O procedimento cirúrgico em duas fases descrito aqui aborda diretamente essas limitações. Ele produz uma grande janela craniana reselável fechada entre as sessões por uma membrana passiva de polidimetilsiloxano (PDMS), selante de silicone e uma tampa impressa em 3D que permite a inserção repetida não terminal de grades μECoG para gravações de LFP em mesoescala, juntamente com múltiplas sondas de eletrodos intracranianos de alta densidade para microescala, unidade única com resolução laminar e atividade^{LFP 17,18}. Em contraste com abordagens crônicas anteriores, que dependem de matrizes de eletrodos permanentemente implantadas que acumulam encapsulamento glial dos eletrodos ao longo do tempo ou requerem craniotomias agudas terminais que impedem desenhos longitudinais, a janela descrita aqui preserva uma dura-máter intacta e evita contato permanente com corpos^estranhos 15,16,18 . Além disso, em uma coorte de validação em que a janela craniana foi reaberta três vezes (dias pós-operatórios 0, 21, 22) sem registro eletrofisiológico, a imunorreatividade quantitativa da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e da molécula adaptadora ionizada de ligação ao cálcio 1 (IBA1) não diferia significativamente dos controles não cirúrgicos, sugerindo baixa astrogliose e microgliose sob o esquema de abertura repetida usado aqui. O método é particularmente adequado para registros longitudinais e multi-locais de redes corticais distribuídas, incluindo a DMN, combinadas com acesso laminar de alta densidade por sonda de eletrodos intracranianos a estruturas profundas em camundongos acordados com a cabeça fixa. Suas principais limitações operacionais são a expertise microcirúrgica necessária para a remoção confiável de retalhos ósseos que preservam a dura-máter e sua incompatibilidade com gravações em movimento livre, já que as sondas de eletrodos intracranianos de alta densidade exigem fixação da cabeça.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Conselho Nacional de Experimentação com Animais na Finlândia (número de licença: ESACI/40845/2022) e os experimentos foram realizados em conformidade com a diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção do uso animal para fins científicos, bem como com as diretrizes nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.

NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados dentro de uma capuz cirúrgico de fluxo laminar que foi pré-esterilizada por irradiação ultravioleta (mínimo 15 min) ou por descontaminação completa da superfície com etanol. O gás residual isoflurano é capturado por um sistema de recaptação de carvão ativado montado dentro do capuz. O operador usa uma capa de cabelo descartável, máscara cirúrgica, jaleco de manga longa e luvas de exame de nitrilo de camada única não estéreis (pulverizadas com etanol 80% antes de entrar no capuz). Um recipiente para descarte de objetos cortantes é colocado dentro do capuz para descarte imediato de lâminas de bisturi e agulhas hipodérmicas.

1. Preparação pré-operatória e anestesia

1. Use mouses C57BL/6JRj, com pelo menos 10 semanas de idade e pesando mais de 20 g.
2. Antes da cirurgia, limpe todos os instrumentos em um banho ultrassônico morno. Enxágue, seco e deixe de molho em etanol a 70% por pelo menos 15 minutos.
3. Alternativamente, esterilize os instrumentos com uma breve passagem por um esterilizador de vidro ou infravermelho imediatamente antes do uso. Cortinas estéreis não são usadas. Entre animais consecutivos na mesma sessão, coloque os instrumentos de volta ao banho de etanol por pelo menos 2^{min 19}.
4. Pese cada camundongo individualmente em uma balança calibrada e calcule volumes de medicamentos pré-operatórios.
5. Prepare as membranas estéreis do PDMS com antecedência (realizada uma vez por lote, fora do dia cirúrgico agudo).
   1. Moldar membranas estéreis de PDMS a partir de uma mistura 10:1 de elastomero para agente de cura preparada conforme as instruções do fabricante e folha até uma espessura-alvo de aproximadamente 500 μm, sanduichando a mistura não curada entre duas placas planas de vidro borosilicato, depois cure a 60 °C por pelo menos 2 horas.
   2. Sele as folhas curadas em bolsas de autoclave e esterilize por autoclave a vapor. No capuz cirúrgico pré-esterilizado, use um bisturi estéril #11 e uma pequena régua de aço inoxidável para cortar cada folha em membranas retangulares que correspondam às dimensões da janela craniana.
   3. Armazene as membranas pré-cortadas em material de laboratório estéril (por exemplo, poços individuais de uma placa de cultura celular de 6 poços) até o uso.
6. Realize o controle de qualidade do hardware antes de cada sessão de gravação.
   NOTA: Nenhuma verificação rotineira de impedância é realizada no array μECoG: falhas no fio de referência são facilmente aparentes nas pistas brutas, e o teste de impedância é invocado apenas quando se suspeita de um problema de hardware. As sondas de eletrodo intracraniano de alta densidade incluem diagnósticos de impedância e integridade de cabos integrados acessíveis pela interface gráfica do software de gravação; Execute esses vídeos quando a qualidade do sinal estiver comprovadamente comprometida.

2. Fase 1: Preparação animal e implantação da placa de cabeça

1. Preparação animal
   1. Anestesie o camundongo com isoflurano (indução: 4%, manutenção: 1,5−2,5%, vazão de oxigênio de 0,5 L/min). Confirme a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de beliscão do dedo do pé.
   2. Raspe o pelo do topo da cabeça, aproximadamente dos olhos até o pescoço.
   3. Coloque o animal em uma almofada térmica controlada por reação, equipada com um sensor de temperatura interno calibrado para manter a temperatura corporal em 37 °C durante todo o procedimento. Aplique pomada ocular carbomera para evitar o ressecamento da córnea.
   4. Fixe o mouse no quadro estereotáxico usando barras auriculares que não rompam. Ajuste a barra incisiva de modo que o crânio fique plano, com bregma e lambda em altura dorsoventral igual (orientação plana do crânio). Mantenha a anestesia com isoflurano (1,5–2,5%) administrado através de um cone nasal com uma vazão de oxigênio de 0,5 L/min.
   5. Administrar analgésicos pré-operatórios e agentes anti-inflamatórios por meio de injeções subcutâneas (s.c.): Carprofeno (5 mg/kg), Buprenorfina (0,05 mg/kg) e Dexametasona (2 mg/kg).
   6. Desinfete a área raspada com solução de povidona-iodo.
   7. Injete solução de lidocaína-epinefrina (c.e.) como anestésico local sob a pele do couro cabeludo.
2. Exposição ao crânio
   1. Faça uma pequena incisão transversal na linha da orelha (aproximadamente 1 cm).
   2. Aumente progressivamente a incisão estendendo o corte lateralmente ao redor das orelhas e ao longo de cada lado da cabeça em direção aos olhos, mas não ultrapasse o corte até os olhos. Complete a exposição fazendo um corte diagonal de cada lado em direção à linha média, de modo que toda a superfície dorsal do crânio fique exposta.
3. Limpeza do crânio
   1. Limpe meticulosamente o crânio exposto com acetona de grau laboratorial. Mergulhe um cotonete estéril em acetona, elimine o excesso de solvente (evitando o pingo no tecido adjacente) e aplique no osso até que todo o periósteo visível seja removido.
   2. Use acetona pela sua capacidade de dissolver resíduos gordurosos e restos membranosos persistentes na superfície óssea, não como desinfetante.
      NOTA: A remoção completa do periósteo e dos resíduos lipídicos da superfície óssea é fundamental para uma forte adesão da placa da cabeça e do cimento dentário. Como o implante deve suportar as tensões mecânicas geradas pelo camundongo acordado, qualquer periósteo residual ou filme lipídico na interface adesiva óssea torna-se um ponto dominante de falha.
   3. Use uma lâmina microcirúrgica (circular) para remover quaisquer fragmentos periosteis e conjuntivos residuais que o lavado de acetona não tenha dissolvido completamente. Segure-a a aproximadamente 45° da superfície óssea e raspe o crânio com movimentos leves e radiais direcionados para fora da junção bregma–linha média em direção às bordas laterais do osso exposto.
   4. Continue até que toda a superfície óssea exposta tenha sido atravessada pelo menos uma vez e pareça uniformemente limpa e fosca.
   5. Conclua com uma última e breve limpeza usando acetona em um aplicador com ponta de algodão.
4. Marcando o local da craniotomia
   1. Anexe um marcador cirúrgico biocompatível de pele ao braço estereotáxico digital.
   2. Marque uma área retangular de 4 mm × 7,6 mm no crânio em relação à bregma.
      1. Navegue pela ponta do marcador até o bregma e redefina as coordenadas X e Y na leitura digital para zero.
      2. Translade o braço para cada um dos quatro cantos da janela planejada, de modo que o retângulo se estenda 2 mm lateralmente a partir do bregma em ambos os lados, 3 mm rostralmente e 4,6 mm caudalmente, e coloque um único ponto em cada canto.
5. Marque os dois locais de inserção da sonda intracraniana no hemisfério direito.
   1. Marque o local da sonda rostral a 1,66 mm A/P e 1,95 mm M/L a partir da bregma.
   2. Marque o local da sonda caudal em -2,2 mm A/P e 1,9 mm M/L do bregma.
      NOTA: Esses locais são ajustados para atingir regiões específicas de DMN. Os locais de inserção podem ser ajustados para múltiplas regiões diferentes com este protocolo.
   3. Desprenda o marcador do braço estereotáxico.
   4. Segure uma borda reta flexível esterilizada (por exemplo, um cartão plástico fino) contra o crânio e conecte os quatro pontos dos cantos com o marcador para delinear a futura janela craniana como um retângulo contínuo.
6. Aumentando a área de superfície para melhor aderência
   1. Realize todas as etapas seguintes até a seção 4 sob o microscópio binocular.
   2. Grave um padrão cruzado sobre todas as superfícies ósseas expostas fora da área designada da janela usando uma lâmina cirúrgica #11 e produza sulcos rasos, porém definidos, de 0,2 a 0,4 mm de profundidade para formar uma grade uniforme de aproximadamente 1 mm × 1 mm quadrados.
      NOTA: Isso aumentará a área de superfície efetiva e, portanto, a aderência mecânica do adesivo e do cimento dentário sobrejacentes.
   3. Crie um aplicador de cola fina ajustando uma agulha estéril de 30 G na ponta de um cotonete de gola longa e dobrando a agulha em formato de V.
   4. Dispense cola de cianoacrilato em um barco de pesagem plástico descartável e mergulhe o aplicador no reservatório de cola.
   5. Deposite cola sobre cada superfície óssea exposta e gravada, aplicando no máximo um depósito por local para que a cobertura seja completa, mas nunca excessiva. Deixe a cola secar por 7 minutos.
7. Implantação do soquete de referência
   1. Selecione um local de perfuração sobre o cerebelo esquerdo, posicionado para evitar vasos superficiais visíveis.
   2. Monte a broca dentária em um suporte para furadeira no braço estereotáxico.
   3. Perfure o furo piloto em rajadas de 5 a 10 s usando uma rebarba redonda de aço a 20.000–25.000 RPM, retraindo a broca entre as rajadas para inspecionar o local sob o binóculo.
   4. Perfure até que o furo fique mais translúcido, revelando um tom rosa claro, e a dura-máter fica visível através do osso afinado.
   5. Pare de furar imediatamente para evitar penetração dural. Dimensione o orifício final para um diâmetro de aproximadamente 0,5 mm, apenas marginalmente maior que o diâmetro externo do soquete de referência.
   6. Insira o encaixe de referência banhado a ouro no orifício piloto, prenda-o com cola de cianoacrilato e reforce a junção com cimento dentário curável por UV. Cure o cimento dental com uma caneta LED de 405 nm por 1 minuto.
8. Implantação da placa de cabeça
   1. Coloque uma pequena quantidade de cimento dentário curável por UV no ápice do osso rostral exposto (o ponto mais próximo do nariz) para servir como suporte nivelador.
   2. Coloque a placa da cabeça sobre o crânio de modo que uma das bordas repouse sobre o andaime de cimento dentário curado ao redor do soquete de referência (passo 2.7.6), e com a borda oposta apoiada no novo dab de cimento rostral.
   3. Alinhe a placa de cabeça de modo que seu eixo longo fique centralizado na linha média sagital e suas duas alças de fixação se estendam perpendicularmente (90°) ao eixo da linha média. Cure o composto sob luz UV para travar a placa de cabeça no lugar.
   4. Reforçar a estrutura aplicando camadas sucessivas de cimento dentário curável por UV, com aproximadamente 1 mm de espessura depositada ao redor da base da cabeça, circundando o osso gravado e o encaixe de referência, até que um recinto contínuo e selado seja formado ao redor do perímetro da futura janela craniana.
   5. Cure cada incremento separadamente com uma caneta de cura LED de 405 nm por 40 s a uma distância de trabalho de 1–2 cm, garantindo polimerização completa antes de aplicar a próxima camada. Certifique-se de que a parede de cimento finalizada se estenda nivelada com a superfície superior da placa da cabeça e envolva completamente o perímetro do osso exposto sem sobreposição na área marcada da janela.
9. Deixe o rato se recuperar da anestesia. Devolva o rato à gaiola por pelo menos 48 horas.
10. Antes de prosseguir para a seção 3, verifique se o animal voltou a estar dentro de 5% de seu peso corporal pré-operatório e não apresenta sinais de dor na escala de careta^{do camundongo 20}. Se algum desses critérios não for atendido, estenda o período de recuperação até que sejam cumpridos.
    NOTA: Este desenho em etapas com intervalo de recuperação intercirúrgico é fundamental. Ele permite que o animal se recupere do estresse fisiológico e inflamação iniciais antes da craniotomia, o que tem se comprovado melhorar as taxas de sucesso cirúrgico e a saúde a longo prazo do implante; Um mínimo de 48 horas é usado aqui, e um implante craniano em etapas com intervalo de recuperação de vários dias entre a fixação da placa capilópica e a craniotomia demonstrou reduzir a inflamação perioperatória e melhorar a qualidade da preparação^{a longo prazo 14}.

3. Fase 2: Criação crônica de janelas cranianas

1. Preparação pré-operatória
   1. Prepare a área cirúrgica e os instrumentos conforme descrito na seção 1.
   2. Reanestesie o camundongo com isoflurano (indução 4%, manutenção 1,5–2,5%)
   3. Posicione o mouse no quadro estereotáxico conforme descrito no passo 2.1.4.
   4. Administrar os medicamentos pré-operatórios nas mesmas doses descritas no passo 2.1, exceto pelo anestésico local lidocaína-epinefrina (a pele do couro cabeludo já foi removida na Fase A, então não é mais aplicável).
2. Perfurando a janela
   1. Comece a afinar o osso com uma broca dentária ao longo do contorno retangular marcado na Fase 1 (passo 2.4). Comece a 25.000 RPM com o dispositivo de perfuração mantido perpendicular (≈ 90 °) à superfície do osso e realize uma ou duas passagens um pouco mais profundas ao longo das bordas retangulares para estabelecer um sulco inicial de corte.
      NOTA: A velocidade inicial da perfuração pode ser ajustada ao nível de experiência do operador.
   2. Furar sulcos (aproximadamente 0,2–0,3 mm de profundidade) no osso e no cimento dentário adjacentes à janela craniana nas duas coordenadas de inserção da sonda marcadas no passo 2.5.
      NOTA: Esses sulcos servem como marcos visuais persistentes que permanecem visíveis após a remoção do retalho ósseo e são usados para reposicionar as sondas intracranianas de forma reprodutiva em sessões eletrofisiológicas subsequentes.
   3. Aplique regularmente durante a perfuração líquido cefalorraquidiano artificial estéril e gelado (ACSF; preparado segundo a receita contendo cefazolina de Goldey et ^al.14) durante toda a perfuração para evitar danos térmicos ao córtex subjacente e minimizar^{sangramentos 14}.
   4. Reduza progressivamente a velocidade da broca para 20.000 RPM à medida que o osso afina e incline a peça para ≈ 45°, permitindo que o operador estabilize a furadeira contra a mão e faça a transição para movimentos mais suaves e controlados.
3. Remoção do retalho ósseo (passo crítico)
   1. Continue perfurando ao longo do perímetro retangular até que o osso dentro do contorno esteja aproximadamente 90% afinado. Não perfure completamente o crânio.
   2. Confirme a espessura óssea restante usando dois testes complementares:
      1. Sob o microscópio binocular, toque suavemente a borda da prateleira de osso afiada com um instrumento rombo. A magnitude da deflexão produzida por uma batida leve fornece uma indicação direta da espessura residual do osso.
      2. Aplique ACSF gelado sobre a janela perfurada e inspecione imediatamente pelos binóculos: nos primeiros 20–30 segundos, antes que o ACSF penetre no osso, a camada de fluido intensifica fortemente o contraste visual, resolvendo os capilares corticais subjacentes onde o osso foi afinado próximo à dura-máter, enquanto regiões de espessura residual permanecem comparativamente opacas sob o líquido. Quando a aba parecer uniformemente translúcida e demonstravelmente flexível, prossiga para o passo 3.3.3.
   3. Troque para o gancho curvo de dura-mátera fina, que termina em uma ponta curvada 90°. Insira a ponta sob a borda do osso afinado com extrema cautela, em um ângulo de aproximadamente 15° em relação à superfície do osso, e deslize o gancho ao longo do perímetro da janela, destacando cuidadosamente a aba óssea do crânio ao redor e do tecido subjacente.
   4. Trabalhe progressivamente de um canto ao outro ao longo dos lados laterais de ambos os lados e, finalmente, avance dos cantos em direção ao centro do retângulo até que todo o perímetro seja separado da dura-máter subjacente.
   5. Não aplique nenhuma pressão para baixo no gancho dura-dura enquanto desliza e evite tocar o cérebro.
      NOTA: Alternar entre cantos diagonalmente opostos em um ângulo raso do gancho distribui o estresse mecânico de forma uniforme ao redor da aba óssea. Essa estratégia previne lesões durais e preserva a saúde a longo prazo do tecido cerebral subjacente.
   6. Não force nenhum movimento se o gancho encontrar resistência focal em qualquer canto. Em vez disso, abaixe a aba e volte ao passo 3.4 para afinar ainda mais a região aderente.
      1. Se ocorrer uma ruptura dural, interrompa o procedimento para o animal (reconhecido por um súbito volume focal, infiltração de líquido com tom rosado ou sangramento arterial vermelho vivo que não desaparece após inundar a cavidade da placa frontal três vezes com ACSF gelado, permitindo que cada lavagem permaneça por 30 segundos).
         NOTA: Um descolamento bem-sucedido é indicado pelo retalho ósseo que se torna uniformemente móvel ao longo de todo o seu perímetro, sem protrusão dural visível e apenas sangramento capilar leve.
   7. Levante cuidadosamente o retalho ósseo que foi destacado com sucesso com o gancho de dura-máter na direção posterior para anterior, aproximadamente 35° acima da superfície do crânio.
   8. Segure a borda levantada com a pinça e balance suavemente para a esquerda e para a direita até que a placa se solte completamente. Se a placa resistir em qualquer canto, abaixe-a de volta à posição e volte ao passo 3.3.4 para afinar a região aderente antes de tentar remoção novamente; Essa resistência indica uma seção do osso localmente subafinada.
   9. Limpe suavemente a área exposta do sangue coagulado com lavagens repetidas de ACSF gelado.
   10. Verifique se a dura-máter está intacta e transparente antes de prosseguir.
       NOTA: O levantamento lento e gradual da borda posterior é essencial para minimizar o risco de lesão nos seios venosos superiores superiores e transversos subjacentes, bem como na superfície cortical.
4. Vedação da janela craniana
   1. Coloque uma única membrana de PDMS estéril pré-fabricada (preparada na seção 1) diretamente sobre a superfície dural assim que o sangramento diminuir. Quando dimensionada corretamente, cobre a janela com precisão e adere passivamente à dura-máter, mantendo-a plana contra o cérebro.
   2. Absorva o ACSF residual do perímetro da janela com um lenço não fibroso.
      NOTA: O pano nunca deve entrar em contato com a dura-mãe exposta, e uma técnica asséptica rigorosa (operador estéril, ferramentas e campo) deve ser mantida durante todo o tempo, pois a janela é reaberta repetidamente, e qualquer contaminação introduzida nessa etapa comprometerá as gravações longitudinais subsequentes.
   3. Prepare o selante de elastômero de silicone de dois componentes conforme as instruções do fabricante e aplique o elastomero misturado em até 30 s após a dispensação para preencher cada fenda entre o gabinete de cimento dentário e a borda interna da placa da cabeça, envolvendo e sobrepondo completamente as bordas da membrana PDMS.
   4. Deixe o elastomero curar por aproximadamente 2 minutos (ou o tempo especificado pelo fabricante). Certifique-se de que a vedação curada seja contínua e à prova de líquidos, mas que permaneça mecanicamente removível no início de cada sessão de gravação.
   5. Fixe uma tampa protetora personalizada impressa em 3D na headplate com uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para proteger a janela entre as sessões de gravação.
   6. Permita que o camundongo se recupere da anestesia e retorne ao camundongo para a sua gaiola para abrigar individualmente, a fim de evitar danos ao implante.

4. Cuidados pós-operatórios e habituação

1. Monitore de perto a saúde do camundongo por pelo menos 2 dias após a cirurgia. Administre analgésicos adicionais (s.c.) por 2 dias após a cirurgia se o camundongo apresentar sinais de dor, com base na escala de careta^{do camundongo 20}.
2. Permita que o camundongo se recupere sem ser perturbado por pelo menos 4 dias após a cirurgia. Depois, inicie um período de habituação de 5 dias de duração incremental: 5 minutos no dia 1, seguido por 15, 30, 45 e 60 minutos nos dias 2, 3, 4 e 5, respectivamente, para acostumar o mouse ao manuseio e à plataforma de gravação de fixação da cabeça.
   NOTA: Edema tecidular pós-craniotomia e inflamação local podem persistir por até duas^{semanas e 21}. Quando o cronograma experimental permite, um período de recuperação estendido antes da primeira sessão de gravação é aconselhável. Antes da primeira sessão de gravação, verifique se a janela craniana está clara e livre de opacidade ou tecido fibroso sob o microscópio binocular, e que o peso e o comportamento do animal são normais.

5. Procedimento para registros eletrofisiológicos longitudinais

1. Colocando o animal na plataforma de gravação
   1. Coloque o mouse na plataforma de gravação e guie as grampos de fixação da cabeça do rato. Certifique-se de que a altura tenha sido pré-ajustada para preservar a postura natural do animal em pé durante a fixação da cabeça.
      NOTA: Se o mouse resistir persistentemente à fixação da cabeça, não force o procedimento. Retorne o animal à sua gaiola de origem e estenda a fase de habituação (seção 4) por mais uma ou duas sessões antes de tentar novamente a fixação.
   2. Aperte os parafusos de trava do grampo.
   3. Deixe a lâmina microcirúrgica circular de molho em etanol 80% imediatamente antes do uso.
   4. Insira a lâmina entre a tampa impressa em 3D e a superfície superior da placa frontal, mantendo a lâmina quase paralela à superfície da placa frontal. Nunca avance a lâmina além da borda interna da abertura da placa da cabeça, para evitar risco de contato com o cérebro.
      NOTA: A tampa é intencionalmente impressa em resina transparente para que a profundidade da lâmina permaneça visível em toda a extensão.
   5. Avance ao redor da tampa com movimentos suaves de movimento da esquerda para a direita que clivam a camada adesiva de forma incremental.
   6. Use pinças finas de dissecação para levantar a tampa e descarte-a quando estiver totalmente liberada.
   7. Segure a borda externa do selo de elastomero de silício e levante-o lentamente do lado caudal em direção ao lado rostral. O selo do elastomero e a membrana subjacente do PDMS se desprendem juntos como uma única unidade, expondo uma dura-máter intacta.
   8. Mantenha o cérebro úmido aplicando algumas gotas de ACSF.
2. Posicionamento dos dispositivos de gravação
   1. Monte a matriz μECoG em um braço articulado com base magnética; ajuste o mostrador de atrito do braço com base na experiência do operador, com operadores experientes preferindo uma configuração de baixo atrito que preserve o controle de motores finos durante o posicionamento.
   2. Guie a matriz de modo que sua face do eletrodo fique perpendicular (90°) à superfície cortical ao longo da borda direita da janela craniana; Uma vez posicionado satisfatoriamente, aperte o mostrador de fricção para fixar o braço.
   3. Use uma ferramenta pontiaguda de silicone para bater suavemente o cabo flat flat da matriz para baixo na superfície superior da headplate, de modo que o cabo encaixe em conformidade com a headplate e a matriz em si fique plana contra a dura-máter, onde o ACSF residual fornece adesão passiva. Como a janela craniana é dimensionada para acomodar o arranjo de duas subgrades em uma única orientação, o alinhamento grosseiro é facilmente detectável.
   4. Faça ajustes finos finais com a ferramenta de silicone, empurrando o array lateralmente até que a linha média sagital fique claramente centralizada dentro do array semitransparente.
      NOTA: A grade translúcida μECoG expõe o seio sagital como um sinal anatômico inequívoco que permanece visível através da matriz, permitindo que o mesmo deslocamento lateral seja reproduzido em sessões longitudinais. O array está posicionado para cobrir bilateralmente o córtex cingulado anterior (ACC) em sua metade rostral e o córtex retrosplenial (RSP) bilateralmente em sua metade caudal, abrangendo os nós DMN visados neste estudo. Um pacote de análise de código aberto (ephy_spatial_fidelity-toolkit, disponível no https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) quantifica a desviação de posicionamento na grade de sessão para sessão a partir de gravações conservadoras.
   5. Conecte o fio de referência μECoG ao soquete de referência banhado a ouro implantado no passo 2.7.
      NOTA: Como uma verificação opcional de controle de qualidade pré-sessão, adquira uma breve gravação com as sondas e a matriz submersas em um tubo cônico de 50 mL de ACSF para confirmar que a gaiola de Faraday está atenuando efetivamente a interferência eletromagnética ambiental antes de prosseguir com a gravação in vivo .
   6. Posicione a sonda caudal de eletrodo intracraniano de alta densidade em um braço micromanipulador orientado perpendicular (≈ 90°) à superfície cerebral e a sonda rostral de eletrodo intracraniano de alta densidade em um segundo braço inclinado a 50°.
   7. No microscópio binocular, avance cada sonda até aproximadamente 1 mm acima da dura-máter e alinhe o eixo Y de cada sonda com o sulco guia gravado correspondente, fresado na etapa 3.2.4.
   8. Registre por anotação escrita ou por fotografia através do binóculo, onde a grade de eletrodos μECoG fica imediatamente ao lado do ponto de entrada planejado de cada sonda.
      NOTA: Quando a cirurgia é realizada corretamente e não há edema cortical, o espaçamento entre a borda óssea e a matriz μECoG é mínimo, tornando a seleção do ponto de entrada inequívoca. Para máxima precisão espacial em sessões longitudinais, capture uma fotografia do córtex exposto com o arranjo no local e identifique um vaso pial distinto dentro da região estreita entre a borda óssea e o arranjo μECoG. Esta imagem, anotada com o vaso de referência e sua posição relativa aos pads μECoG, serve como um mapa de referência sessão a sessão para reproduzir o mesmo ponto de entrada nos dias de gravação subsequentes.
   9. Retrair cada sonda para cima em aproximadamente 15 mm assim que a correspondência sonda-pad for registrada para proteger a frágil haste do eletrodo durante a punção dural.
   10. Fabrice a ferramenta de punção dural fixando uma agulha hipodérmica estéril de 30 G na ponta de um aplicador com ponta de algodão e dobrando a ponta da agulha a 90° com pinças finas sem dentes.
   11. Guie lentamente a ferramenta de perfuração sobre a headplate. Olhando pelo binóculo, conte as almofadas de eletrodos em μECoG para alinhar a ferramenta com a coordenada de entrada registrada. Abaixe a ponta dobrada até a superfície dural de modo que a ponta de corte se aproxime da dura-máter a 90°, enquanto o eixo da ferramenta fique paralelo ao eixo longo das costas do rato.
   12. Avance a ponta aproximadamente 1 mm abaixo do plano dural e retraia. Espera-se um pequeno sangramento transitório na perfuração; Seque com o canto torcido de um lenço não fibroso.
   13. Abaixe cada sonda de eletrodo intracraniano de alta densidade até a superfície dural sob observação binocular contínua imediatamente após a perfuração. Se a perfuração for colocada com precisão, a sonda desliza pela perfuração suavemente, sem desvio do haste.
   14. Desça cada sonda gradualmente até a profundidade alvo de 5 mm abaixo da dura-máter em uma velocidade controlada de aproximadamente 0,1 mm/s ou^{mais lenta 22}.
   15. Deixe as sondas se estabilizarem mecanicamente por 10 minutos antes de iniciar a aquisição dos dados.
       NOTA: A pequena perfuração dural criada pela agulha de 30 G se fecha sozinha em minutos; portanto, a inserção da sonda deve seguir a perfuração sem demora.
3. Aquisição de dados
   1. Comece a aquisição de dados.
      NOTA: Os sinais μECoG são amplificados por quatro headstages digitais de 128 canais conectados via cabos de interface SPI a uma placa de aquisição de código aberto, enquanto as duas sondas de eletrodos intracranianos de alta densidade são adquiridas por meio de um módulo dedicado de aquisição de sonda de alta densidade, alojado em um chassi modular de instrumentação, ao lado de módulos multifuncionais de entrada/saída e aquisição de dados para sincronização e sinalização digital. Um clock mestre TTL comum é gerado pela placa de aquisição μECoG de código aberto e distribuído como uma linha de sincronização de hardware para o chassi de aquisição da sonda (via seu módulo multifuncional de E/S), de modo que os dois fluxos de aquisição compartilhem uma base de tempo alinhada à amostra. Todos os fluxos de dados são registrados de forma síncrona através da interface gráfica do sistema de aquisição; modelos completos de hardware e números de catálogo estão listados na Tabela de Materiais.
   2. Ao final da sessão de gravação, dispense 0,5 mL de ACSF nas grades μECoG, depois retraia cada sonda de eletrodo intracraniano de alta densidade na mesma velocidade usada para a inserção (≈6 mm/min) e remova cuidadosamente o conjunto de μECoG.
   3. Limpe as sondas e o array deixando de molho por 45 minutos em uma solução enzimática de detergente fresco preparada de 1% (v/v).
   4. Após o banho em detergente enzimático, enxágue os eletrodos com três mergulhos sequenciais em água purificada por osmose reversa, usando um novo tubo para cada enxágue.
   5. Substitua a membrana do PDMS por uma folha estéril nova, como no passo 3.4.1.
   6. Reaplique o selante de elastomero (passo 3.4.3–3.4.4) e fixe uma nova tampa protetora impressa em 3D (passo 3.4.5).
   7. Deixe o conjunto re-vedado secar ao ar por 5 minutos antes de devolver o rato à gaiola. O procedimento pode ser repetido por várias sessões de gravação ao longo de várias semanas.

Resultados

Uma cirurgia bem-sucedida resulta em uma janela clara e transparente sobre o córtex, com vasculatura visível e sinais mínimos de inflamação ou infecção. Essa clareza pode ser mantida por mais de 21 dias (Figura 1), possibilitando estudos longitudinais de longo prazo. A robustez do implante é demonstrada por sua capacidade de permanecer estável mesmo durante um paradigma crônico de administração de corticosterona por 21 dias, um modelo comum para induzir esta...

Discussão

Este relatório detalha um protocolo cirúrgico em duas fases, preservador da dura-máter, que oferece um método confiável e altamente eficaz para criar uma janela craniana grande, crônica e re-selável em camundongos. A importância dessa técnica vai além do tamanho da janela. Sua principal vantagem é a capacidade de interrogação simultânea e em múltiplas escalas de redes cerebrais em larga escala ao longo de escalas longitudinais de tempo. Ao combinar grades de superfície μECoG (fornecendo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
& micro; Matriz ECoG & mdash; 512 canais personalizados (2 e vezes 256 ch)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Embalagem: IH256. Dois 16 vezes; 16 sub-grades (cada uma com 3,3 mm e vezes 3,5 mm); 200 & mu; m pitch; 80 & mu; diâmetro do eletrodo m. Gravações DMN em nível superficial.
Braço micromanipulador esquerdo de 3 eixos	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	504926	10 & mu; resolução m; display digital; Usado para posicionamento da placa/sonda durante a cirurgia
Tampa protetora impressa em 3D	Interno (Anycubic Photon Mono 4K)	N/A	Design personalizado; impressa em resina UV Anycubic High Clear; Arquivo STL disponível em https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Acetona (grau laboratorial)	Sigma-Aldrich	179973	Degrasamento da superfície do crânio e remoção do periósteo antes da aplicação do adesivo
Gancho Adson Dura 5 mm (Gancho Dura fino)	gSource	gS 25.2570	Usado para descolar a placa óssea da dura-máter ao longo do perímetro; Fabricado com fio fino de tungstênio ou similar
Resina UV Anycubic High Clear	Anycubic	STMGCL-102B	Resina fotopolimérica usada com impressora Anycubic Photon Mono 4K para tampas protetoras impressas em 3D
Anycubic Photon Mono impressora de resina 3D	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Usado para imprimir tampas de janelas protetoras a partir da Anycubic High Clear Resin
Lavagem & Lavagem de Resina UV Anycubic Máquina de Cura 2.0	Anycubic	285-550	Lavagem pós-impressão e cura UV de tampas impressas em 3D
Braço articulado com base magnética (× 2)	Ferramentas Haas	09-0535	Costumava manter e micrometer; Sub-redes ECoG posicionadas na superfície cortical durante as gravações
LCR artificial (aCSF)	Preparação interna	N/A (Internamente)	receita de aCSF: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM de D-Glicose; oxigenar com 95% de O2 / 5% CO2 imediatamente após a preparação. Números de catálogo listados separadamente.
Lâmina microcirúrgica romba (bisturi circular)	Iogen	374769	Usado para raspagem da superfície do crânio e remoção de capas
Buprenorfina (Temgesica)	Indivíduo	BE-112515	analgésico opioide; 0,05 mg/kg s.c. pré-operatório
Mouses C57BL/6JRj	Janvier Labs		Masculino ou feminino; mínimo 10 semanas de idade, >20 g de peso corporal no momento da cirurgia
Diidratado de Cloreto de Cálcio (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM; MW 147.02; 0,29 g/L. Preparado como Ca × 100 ações. Componente da aCSF interna.
Carprofeno (Rimadyl)	Zoetis Saúde Animal	RXRIM-INJ 	Analgésico AINE; 5 mg/kg de s.c. pré-operatório
Corticosterona	Sigma-Aldrich	C2505	Dissolvido em água potável para um modelo de estresse crônico/depressão de 21 dias
Cotonete	Fisherbrand	22-363-157	Serve como cabo para dispositivo de durapunção 30 G e para desengraxar a superfície do crânio com acetona
Cola de cianoacrilato — Loctite 401	Adesivos Henkel	Loctite 401	Cianoacrilato de viscosidade fina; Usado para priming da superfície do crânio, fixação de placas de cabeça e tampas
Broca dentária & mdash; Foredom K.1070	Antepassado	K.1070	Broca rotativa de eixo flexível; Usado para afinamento de craniotomia e perfuração de furos piloto
Dexametasona	Dopharma	1DEX004	anti-inflamatório corticosteroide; 2 mg/kg de s.c. pré-operatório
D-Glicose	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM; MW 180.20; 1,80 g/L. Preparado como glicose e tempos; 100 ações. Componente da aCSF interna.
Broca de Aço Bur redonda 1/007W	Hager & Meisinger	18089	Usado para o local de referência e a janela craniana
Etanol 80% (v/v) - A12t diluto	Berner	13221132	Imersão pré-operatória de instrumentos cirúrgicos e capuz laminar cirúrgico para esterilização
Aparelho de Evacuação de Gás	Ciências da Vida RWD	R546W	Elimina gases anestésicos da área cirúrgica
Soquete de referência banhado a ouro	DigiKey	310-13-102-41-001000	Implantado sobre o cerebelo esquerdo; serve como terra/referência do ECoG
Limpeza Ultrassônica GRANT & mdash; Modelo 17002A	Instrumentos GRANT	17002A	EAN: 4064343191654. Banho ultrassônico com água quente; usado com o TICKOPUR TR 3 para limpeza de instrumentos
Bolsa térmica e mdash; Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	Mantém a temperatura corporal em 37 °C; C durante a anestesia
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-017-25	Anestésico inalável; indução 4%, manutenção 1,5 e NDASH; 2.5%
Kimtech Science, Lenços Precisos (Tecido não fibroso)	KIMBERLY CLARK	7552	Usado com ponta pontiaguda para secar o ACSF residual e auxiliar na adesão da membrana do PDMS à dura-máter
Selante Elastômero Estéril Kwik-Cast	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	KWIK-CAST-s	Modelo: KWIK-CAST-S. silicone biocompatível; usado para criar vedação removível ao redor da membrana PDMS.
Caneta de cura UV LED 405 nm	CureUV	514424-405	Usado para curar cimento dentário ativado por UV (C-Ram total) durante a implantação
Solução de lidocaína-epinefrina	Orion Pharma	05 10 31	Anestésico local; injeção de s.c. sob a pele do couro cabeludo
Sulfato de Magnésio heptahidratado (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM; MW 246,48; 0,25 g/L. Preparado como Mg &tempos; 100 ações. Componente da aCSF interna.
Placa de metal e mdash; Neurotar Modelo 13	Neurotar	Modelo 13	Placa de titânio; abertura redonda de 11 mm de diâmetro; fixado ao crânio com cianoacrilato e cimento dentário
Adaptador headstage NeuroNexus )	NeuroNexus	IH256 personalizado 64 e vezes; 4 Molex	Placa adaptadora personalizada; sanduíches cada um & micro; Subgrade ECoG entre dois headstages Intan RHD 128-ch
Sonda Neuropixels 1.0 com tampa metálica (e os tempos; 2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 locais de gravação; Haste de 10 mm. Uma sonda mira na coluna hipocampal-talâmico-visual, a outra na coluna mPFC
Chassi NI PXIe-1083	Instrumentos Nacionais	PXIe-1083	Chassi PXI Express de 9 ranhuras que abriga módulo Neuropixels e placas NI DAQ
NI PXIe-3839 módulo multifuncional de E/S	Instrumentos Nacionais	PXIe-3839	Instalado no chassi NI PXIe-1083; usado para sincronização e E/S auxiliar
DAQ multifuncional NI PXIe-6363	Instrumentos Nacionais	PXIe-6363	Instalado no chassi NI PXIe-1083; E/S analógica e digital para sincronização
Nova Microcinerator -  Esterilizador Infravermelho	Argos Tech	S3022	Usado para esterilização rápida de qualquer instrumento que possa tocar tecidos cerebrais expostos
Microscópio binocular estéreo Olympus SZ51	Olympus	SZ51	Visualização cirúrgica; Usado durante as etapas de craniotomia e implantação
Quadro de Aquisição Open Ephys (One Box, 1ª geração)	Open Ephys	OEPS-9029	Recebe µ Fluxos de dados ECoG via SPI; Hardware de código aberto. Veja open-ephys.org
Interface gráfica aberta do Ephys	Open Ephys	N/A (código aberto)	Software gratuito e de código aberto para aquisição de eletrofisiologia. Disponível em: open-ephys.org
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM; MW 74.55; 0,22 g/L. Componente do aCSF interno.
Dihidrogênio fosfato de potássio (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1,25 mM; MW 136.09; 0,17 g/L. Componente do aCSF interno (Klebs & times; 10 ações).
Solução de povidona-iodo (BETADINE)	Takeda	45 70 28	Desinfetante tópico para preparação cirúrgica no campo
Módulo de aquisição PXIe	Neuropixels	PXIE_1000	módulo em formato PXI para aquisição de dados Neuropixels 1.0; instalado no chassi NI PXIe-1083
Conector de soquete de referência	DigiKey	342-10-102-00-591000	Conector correspondente para o soquete de referência acima; confirme o número da peça com a DigiKey
RHD 128 canais (e horários; 4)	Tecnologias Intan	RHD 128	Dois headstages por µ Subgrade ECoG; confirmar modelo (por exemplo, RHD2132 ou RHD2164)
Cabo de interface RHD SPI, 0,9 m	Tecnologias Intan / Open Ephys	C3203	Cabo SPI padrão conectando headstages RHD à caixa de aquisição Open Ephys
Bomba de Ar RWD	Ciências da Vida RWD	R510-29	Fornece fluxo de ar através do circuito anestésico
Vaporizador de Anestesia Animal RWD	Ciências da Vida RWD	R5835	Vaporizador de isoflurano de precisão para indução e manutenção da anestesia
Lâmina do Bisturi #11	Swann Morton	SM0103	Usado para gravar padrões cruzados na superfície do crânio para melhorar a aderência adesiva
Aparador de pelos para pequenos animais - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	Usado para aparar o couro cabeludo do animal antes da cirurgia
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM; MW 84.01; 2,18 g/L. Componente do aCSF interno.
Cloreto de Sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM; MW 58.44; 7,25 g/L. Componente do aCSF interno.
SOL-M (Agulha hipodérmica estéril 30 G)	Europa Sol-Millennium	113005	Curvado 90º e grau; na ponta e fixada no cotonete para criar o dispositivo de punção dura-dura
Braço manipulador padrão, 3 eixos ESQUERDA (Stoelting)	Stoelting Co.	51604	Usado para inserção de sondas Neuropixels durante sessões de gravação
Braço manipulador padrão, 3 eixos DIREITO (Stoelting)	Stoelting Co.	51606	Usado para inserção de sondas Neuropixels durante sessões de gravação
Quadro estereotáxico & mdash; RWD F67001	Ciências da Vida RWD	F67001	quadro estereotáxico padrão; Usado para estabilização da cabeça e colocação de implantes referenciada por coordenadas
Caneta de pele com marcador cirúrgico e régua (Tinta Violeta)	Fannin	SM0372	Marcador cirúrgico cutâneo biocompatível à base de genciana-violeta usado para delinear a craniotomia planejada e a pegada do implante no osso. Resistente à preparação de cianoacrilato (Loctite 401) e permanece visível por meio da desengraxação do crânio e fixação da cabeça, permitindo a transferência confiável das coordenadas estereotáxicas para a superfície óssea.
Kit de Elastomer de Silicone SYLGARD 184 (PDMS)	Dow (Alemanha)	1673921	Polidimetilsiloxano; fundido em thin (< membranas de 1 mm; colocado na superfície dural para proteger o cérebro
Detergente enzimático Tergazyme	Alconox	1304-1	Limpador à base de protease usado a 1% (p/v) em água RO morna para limpeza pós-sessão com eletrodos (45 min de molho, depois enxágue triplo em água purificada).
Cimento Dental UV Total C-Ram Automix (Branco)	Itena	R301950	Modelo: TTCRAM-BLC. resina dentária curável por UV; Usado para reforço de placa de cabeça e fixação de soquete
Solução de Limpeza Ultrassônica (TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	Concentrado à base de ácido cítrico; Usado em banho ultrassônico para limpeza de instrumentos pós-cirúrgicos
Gel Ocular Viscotears 2 mg/g	Alcon	503849	Pomada lubrificante à base de carbomeros; aplicada nas córneas durante a anestesia para evitar o ressecamento
Fonte de Luz Fria Zeiss KL1500 LCD	Carl Zeiss	KL1500 LCD	Iluminação a frio por fibra óptica para campo cirúrgico; previne danos térmicos