Transcriptômica Espacial da Morfogênese Dentária Precoce em Tecido Embrionário de Camundongos Embutidos com Parafina com Formalina

Resumo

O protocolo atual descreve o uso de seções fixadas em formol, embutidas em parafina, das regiões craniofaciais E13.5 e E15.5 de embriões de camundongos para analisar os perfis diferenciais de expressão gênica usando transcriptômica espacial.

Resumo

O dente em desenvolvimento é composto por populações celulares diversas e altamente especializadas que trabalham juntas para manter a forma e a função adequadas. Elucidar as interações entre essas células e o microambiente ao redor é fundamental para entender os mecanismos regulatórios subjacentes ao desenvolvimento normal dos dentes. Perturbações nesses processos podem resultar em distúrbios congênitos como agenesia dentária, dentinogênese imperfeita e amelogênese imperfeita. Apesar do progresso substancial possibilitado pelo sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) na revelação da heterogeneidade celular, ele não preserva o contexto espacial das células dentro dos tecidos, limitando a capacidade de relacionar a expressão gênica à arquitetura tecidual. Tecnologias espaciais transcriptômicas abordam essa limitação integrando o perfil de expressão gênica de alta resolução com a preservação da arquitetura dos tecidos nativos, permitindo a localização in situ das assinaturas moleculares. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para a coleta, fixação e incorporação de parafina de tecido craniofacial embrionário de camundongo, adequado para aplicações espaciais transcriptômicas a jusante. O fluxo de trabalho detalha a otimização da secção e manuseio de tecidos fixados em formalina, embutidos em parafina, para preservar a integridade do RNA e a morfologia dos tecidos para análise espacial de alta resolução. Esse método é compatível com plataformas de sequenciamento e transcriptômica espacial baseada em imagem, permitindo o perfil transcriptômico espacial reproduzível da morfogênese dentária precoce em embriões de camundongo. Essa abordagem oferece insights poderosos sobre a organização espacial e a dinâmica funcional das estruturas craniofaciais tanto em estados de desenvolvimento quanto patológicos, fornecendo uma estrutura crítica para ligar mecanismos moleculares à morfologia dos tecidos.

Introdução

O desenvolvimento dentário depende de uma sequência altamente coordenada de processos morfogenéticos durante o crescimento embrionário^inicial 1,2,3,4. Embora numerosos genes-chave e vias de sinalização tenham sido identificados por meio de estudos genéticos e do desenvolvimento, nosso entendimento de como esses fatores interagem para moldar estruturas craniofaciais individuais permanece limitado. Notavelmente, mesmo com avanços substanciais na ligação de variantes genéticas específicas tanto a distúrbios dentários sindrômicos quanto não sindrômicos, os mecanismos moleculares detalhados subjacentes à morfogênese específica da estrutura ainda não estão totalmente^definidos 1,2,3,4. Essa lacuna de conhecimento continua a limitar o progresso de estratégias terapêuticas direcionadas para agenesia dentária ou outras aberrações dentárias.

O sequenciamento de mRNA de célula única (scRNA-seq) permitiu a descoberta de tipos celulares anteriormente não reconhecidos tanto em tecidos saudáveis quanto doentes, bem como a identificação de múltiplos subtipos celulares com base em perfis distintos de expressão gênica. No entanto, como o scRNA-seq requer dissociação dos tecidos em células individuais, a informação sobre a posição espacial original de cada célula dentro do tecido é perdida. Como resultado, esses conjuntos de dados não capturam como as células estão organizadas em relação à arquitetura do tecido ^5,6,7. Além disso, as interações previstas célula a célula dependem da presença de interações complementares de transcritos, mas não levam em conta informações epais reais, o que é importante para determinar se tais interações ocorrem in vivo ^5,6,7.

A tecnologia de transcriptômica espacial permite o perfil de alta produtividade da expressão gênica enquanto retém informações espaciais dentro das seções^{teciduais 8,9}. As tecnologias de transcriptômica espacial são baseadas em^imagem 10,11,12 ou baseadas em ^{sequenciamento 12,13}. Abordagens de transcriptômica espacial baseadas em imagem utilizam FISH para detectar e medir a expressão gênica direcionada com precisão espacial celular ou subcelular. Em contraste, tecnologias baseadas em sequenciamento capturam a expressão gênica em todo o transcriptoma com resolução espacial menor. A transcriptômica espacial baseada em sequenciamento emprega uma estratégia para alcançar resolução quase de célula única com cobertura de transcriptoma inteiro (~20.000 genes), apoiando análises exploratórias não tendenciosas, enquanto a transcriptômica espacial baseada em imagem mira painéis gênicos (até ~5.000 genes), permitindo uma análise precisa baseada em hipóteses de vias específicas e interações^{celulares 14}.

Avanços tecnológicos em transcriptômica espacial agora possibilitam a análise da expressão gênica dentro da arquitetura de tecidos preservados. Fluxos de trabalho baseados em parafina fixa com formol (FFPE) e baseados em criosseção oferecem abordagens complementares para transcriptômica espacial 15,16,17. O FFPE proporciona preservação superior da arquitetura tecidual, permitindo o mapeamento espacial preciso da expressão gênica em tecidos estruturalmente complexos, como dentes em desenvolvimento e prateleiras palatinas. Em nosso estudo e em outros, a fixação e o arquivamento do FFPE produziram dados espaciais transcriptômicos altamente precisos^{e reprodutíveis 18}. Os fluxos de trabalho de criosseção preservam a integridade do RNA, mas são mais propensos à distorção^{tecidular 18}. Portanto, o FFPE foi selecionado para este estudo. Enquanto o sucesso do scRNA-seq depende em grande parte da manutenção da alta integridade do RNA, a transcriptômica espacial também requer uma morfologia tecidular de alta qualidade para localizar com precisão os sinais de expressão gênica em características histológicas específicas.

Este protocolo é mais adequado para tecidos craniofaciais embrionários de camundongos com FFPE que abrangem estágios iniciais de desenvolvimento, onde a preservação da arquitetura fina dos tecidos é crítica para análise transcriptômica espacial. O fluxo de trabalho tende a ter desempenho subótimo em amostras excessivamente fixas, blocos de parafina mal orientados ou tecidos com integridade de RNA comprometida, o que pode resultar em redução da qualidade do sinal e perda de resolução espacial. A aplicação bem-sucedida desse método é indicada pela morfologia tecidual intacta, distorção mínima de seções e sinais transcriptômicos robustos e espacialmente resolvidos que se alinham com características histológicas.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (ACUC), sob o Protocolo de Estudo com Animais #21-031.

1. Preparação do animal experimental e coleta de tecidos

1. Combine machos saudáveis e férteis de Mus musculus para acasalamentos temporizados. Identificar fêmeas grávidas pela presença de um tampão vaginal, designado como dia embrionário (E) 0,5.
2. Eutanasiar camundongos fêmeas grávidas por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical. Posicione o supino do animal sobre uma superfície cirúrgica absorvente e estéril e desinfete a área abdominal com 70% de etanol ao longo do local da incisão pretendido.
3. Faça uma incisão abdominal na linha média usando tesoura cirúrgica estéril e abra cuidadosamente a parede peritoneal com tesoura microcirúrgica para expor os chifres uterinos. Exteriorize suavemente a cadeia uterina usando pinças contundentes. Isolar os embriões liberando o tecido uterino ao longo do miométrio e cortando o oviduto e a fixação mediana do chifre uterino.
4. Transfira imediatamente embriões inteiros para um PBS 1x gelado e estéril em uma placa de Petri de 10 cm.
5. Separe cuidadosamente cada embrião das membranas uterina, amniótica e coriônica ao redor, e transfira-o para um recipiente fresco de 10 cm contendo 1x PBS estéril e gelado.
6. Dissece as cabeças embrionárias nos estágios de desenvolvimento desejados usando uma lâmina cirúrgica estéril e enxágue-as uma vez em 1x PBS gelada antes do processamento adicional.

2. Fixação e processamento do tecido

1. Dissecar cabeças embrionárias de camundongos nos estágios de desenvolvimento desejados e fixar em formalina tamponada neutra a 10% durante a noite em temperatura ambiente em um shaker.
2. Após a fixação, remova o formol e enxágue as amostras com 1x PBS antes de transferi-las para etanol a 70% para armazenamento. Realize desidratação tecidual, limpeza e infiltração de parafina usando um processador automatizado de tecidos.
3. Embutida as cabeças dos embriões em parafina com orientação no plano coronal ou sagital.
4. Após a solidificação da cera, remova os blocos de parafina dos moldes, coloque-os em recipientes herméticos ou sacos zip-lock rotulados e armazene a 4 °C até a secção.
   NOTA: Os blocos de FFPE podem ser armazenados por vários anos antes de serem seccionados sem comprometer a integridade dos tecidos.

3. Processamento de tecido FFPE para transcriptômica espacial

1. Desinfete superfícies de trabalho e instrumentos com 70% de etanol, seguido do tratamento com solução descontaminante de RNase para minimizar a degradação do RNA.
2. Prepare um banho-maria contendo água desionizada e mantenha-o a 40 °C, ajustando a temperatura entre 40 °C e 43 °C conforme necessário, com base nas características do estágio embrionário ou do tecido.
3. Prepare o microtomo, instale uma nova lâmina após passar suavemente com uma solução descontaminante de RNase, fixe a lâmina e ajuste o ângulo de folga para 10°.
   NOTA: Certifique-se de que a nova lâmina seja usada para seccionar e alcançar cortes de tecido precisos. Alterar o ângulo da lâmina do micrótomo pode impactar significativamente a qualidade da seção, afetando a integridade do tecido, a uniformidade da espessura e a preservação das características morfológicas.
4. Corte o excesso de parafina ao redor do tecido embutido e monte o bloco de FFPE na fase fria do micrótomo.
5. Prepare e trate pinças e escovas limpas com solução descontaminante de RNase antes do uso.
6. Alinhe a face do bloco de parafina com a lâmina do micrótomo e faça cortes de corte de aproximadamente 12 μm até que a região de interesse seja aproximada (por exemplo, até que a parte mesial dos molares se torne visível nas seções coronais). Ajuste o posicionamento do bloco e da pá conforme necessário para garantir seções coronais simétricas e devidamente orientadas em toda a cabeça.
7. Se for necessário realizar isolamento de RNA das seções de tecido, colete diretamente seções de 10 μm em tubos microcentrífugas de 1 mL e processe-as de acordo com as recomendações do^{fabricante 19,20} para avaliação de qualidade do DV200.
8. Corte seções seriadas de 5 μm de espessura e monitore continuamente a proximidade da área de interesse examinando seções de teste em uma lâmina comum ao microscópio.
9. Uma vez perto da região de interesse, marque cuidadosamente a área do tecido usando uma lâmina de bisturi nº 11 sem cortar completamente, em duas regiões estrategicamente espaçadas para evitar que as seções se enrolem ou aderam. Após a secção, remova qualquer parafina presa usando as cerdas de um pincel fino.
10. Coloque as seções de tecido flutuante sobre o banho-maria a 41 °C para permitir um relaxamento suave e achatamento antes de pegá-las no escorregador.

4. Transcriptômica espacial baseada em sequenciamento

1. Colete seções de tecido nas lâminas de vidro recomendadas, garantindo que todas as regiões de interesse estejam contidas em uma área de 6,5 × 6,5 mm. Quando várias seções adjacentes são colocadas no mesmo slide, aqueça brevemente as lâminas em um aquecedor de slides a 40 °C para promover a aderência e evitar o descolamento de seções previamente colocadas. Depois que todas as seções estiverem posicionadas, incube as lâminas em um aquecedor de lâminas coberto a 60 °C por 2 horas para aumentar a aderência do tecido.
   NOTA: Seções que se estendiam além da área de 6,5 × 6,5 mm não foram processadas.
2. Após a incubação, realize-se a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) usando um protocolo padrão de coloração H&E, substituindo água desionizada por água da torneira para preservar a integridade do RNA.
3. Monte os coverslips usando 80% de glicerol e adquira imagens H&E de alta resolução, fornecendo uma imagem de referência de maior qualidade para substituir a imagem típica H&E gerada pelo sistema de imagem de lâminas e transferência de tecido.
4. Após a imagem, remova as lâminas de cobertura mergulhando as lâminas individualmente em tubos de 50 mL contendo água desionizada, e prepare as lâminas para submissão à instalação de núcleo para processamento subsequente.

5. Transcriptômica espacial baseada em imagem

NOTA: Os slides foram fornecidos pelo^{fabricante 20}, cada um contendo uma área designada para imagens (linhas delineadas) medindo 12 mm × 24 mm, com uma região disponível de amostra de aproximadamente 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Posicione as seções do tecido inteiramente dentro dessa área definida, garantindo que as seções, incluindo a parafina residual, não se sobreponham. Ao posicionar múltiplas seções adjacentes, aqueça brevemente os trilhos em um aquecedor de ferrolho a 40 °C para promover a aderência e evitar o descolamento de seções previamente montadas.
2. Depois que todas as seções de tecido estiverem posicionadas, coloque as lâminas em um aquecedor de lâminas coberto e incube durante a noite a 40 °C para garantir a adesão adequada.
3. Após a incubação, siga o protocolo¹⁹ do fabricante para processar as lâminas e carregá-las na máquina para sequenciamento de RNA, com o protocolo cruzado em relação à versão mais recente, já que os detalhes procedurais estão sujeitos a atualizações periódicas.
   NOTA: Todos os materiais perigosos gerados durante o protocolo, como formolão, etanol e soluções descontaminantes de RNase, devem ser descartados de acordo com as políticas institucionais de segurança e regulamentos locais, utilizando recipientes adequados para resíduos químicos, métodos de descarte de riscos biológicos e práticas de exaustores.

Resultados

Este método descreve o processamento de cabeças embrionárias de camundongos recém-dissecadas para gerar amostras de FFPE de tecidos craniofaciais, incluindo o dente em desenvolvimento, que podem ser facilmente seccionadas por micrótomo mantendo a integridade do RNA (Figura 1). Esse protocolo foi aplicado com sucesso às cabeças de embriões murinos E13.5 (embrionário dia 13.5), E15.5 e E16.5 para regiões craniofaciais de alta resolução baseadas em imagens (

Discussão

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para preparar blocos FFPE de cabeças embrionárias de camundongos otimizados para uso em plataformas de imagem espacial de RNA de alta resolução, incluindo transcriptômica espacial baseada em sequenciamento e imagem. Um objetivo fundamental deste protocolo é preservar tanto a morfologia dos tecidos quanto a integridade dos ácidos nucleicos em seções inteiras da cabeça, com foco especial na região craniofacial em desenvolvimento. Garantir...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  para realizar lavagens durante o fluxo de trabalho
50 mL tubos cônicos (Ambion) livres de RNAse	Thermo Fischer	AM12502	Uso para armazenar amostras em diferentes soluções
Oscilador orbital avançado	VWR	6683-470	Uso para agitar tecidos na solução de fixação durante a incubação
Álcool, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Use para limpar e desinfetar todo o espaço de trabalho
Processador automatizado de tecido a vácuo	Leica Biosystems	ASP300S	Uso para limpar desidratação, reidratação e infiltração de cera em amostras
Espessura do Vidro da Cobertura 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Uso para montagem de slides no fluxo de trabalho Visium HD
Buffer de Azulamento Dako, Pronto para Uso	Tecnologias Agilant	CS70230-2	Uso para H& Coloração por E
Eosina-Y com floxina	Fisher Scientific	22050198	Uso para H& Coloração por E
Hematoxilina, Mayer, solução aquosa pronta para uso	Tecnologias Agilant	S330930-2	Uso para H& Coloração por E
Banho-maria HistoCore & nbsp;	Leica Biosystems	HIS2326	Use para flutuar as seções a 40-43 graus; C para remover rugas das seções FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Use para analisar dados do Visium HD
Lâminas descartáveis de perfil baixo DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Use para seccionar blocos FFPE
Formalina Tamponada Neutra 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Usar para consertar os lenços
Solução de Descontaminação RNase RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Uso para limpar e remover RNase
Microtomo Rotativo Semi-Automatizado	Leica Biosystems	RM2245	Use para seccionar blocos FFPE conforme informado nas diretrizes.
Aquecedor de Ferrolho com Tampa	Estreia	XH2004	Uso para incubação de lâminas em diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides & nbsp;	Fisher Scientific	12-550-15	Uso para anexar seções para o Vsium HD
Lâmina cirúrgica nº 11	Integra Miltex	4-311	Uso para a marcação de tecidos FFPE
Paraplastos Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Uso para realizar infiltração de tecidos e inserção de tecidos
TISsue PRATO de cultura 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso para coletar e dissecar amostras em 1x PBS
Glicerol UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Uso para montagem de slides Visium HD do coverglass antes do CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Uso para experimentos de fluxo de trabalho Visium HD
Visium HD Sequenciamento Espacial de RNA	10X Genomics, Inc.	1000676	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos
Xenium 5K Localização In Situ de RNA	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos
Analisador de Xenium	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Use para realizar imagens de RNA de Xênio e Xênia 5K
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Uso para analisar dados de Xenium
Localização in situ de RNA de xênia	10X Genomics, Inc.	1000672	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos