Transcriptômica Espacial da Morfogênese Dentária Precoce em Tecido Embrionário de Camundongos Embutidos com Parafina com Formalina

Summary

O protocolo atual descreve o uso de seções fixadas em formol, embutidas em parafina, das regiões craniofaciais E13.5 e E15.5 de embriões de camundongos para analisar os perfis diferenciais de expressão gênica usando transcriptômica espacial.

Abstract

O dente em desenvolvimento é composto por populações celulares diversas e altamente especializadas que trabalham juntas para manter a forma e a função adequadas. Elucidar as interações entre essas células e o microambiente ao redor é fundamental para entender os mecanismos regulatórios subjacentes ao desenvolvimento normal dos dentes. Perturbações nesses processos podem resultar em distúrbios congênitos como agenesia dentária, dentinogênese imperfeita e amelogênese imperfeita. Apesar do progresso substancial possibilitado pelo sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) na revelação da heterogeneidade celular, ele não preserva o contexto espacial das células dentro dos tecidos, limitando a capacidade de relacionar a expressão gênica à arquitetura tecidual. Tecnologias espaciais transcriptômicas abordam essa limitação integrando o perfil de expressão gênica de alta resolução com a preservação da arquitetura dos tecidos nativos, permitindo a localização in situ das assinaturas moleculares. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para a coleta, fixação e incorporação de parafina de tecido craniofacial embrionário de camundongo, adequado para aplicações espaciais transcriptômicas a jusante. O fluxo de trabalho detalha a otimização da secção e manuseio de tecidos fixados em formalina, embutidos em parafina, para preservar a integridade do RNA e a morfologia dos tecidos para análise espacial de alta resolução. Esse método é compatível com plataformas de sequenciamento e transcriptômica espacial baseada em imagem, permitindo o perfil transcriptômico espacial reproduzível da morfogênese dentária precoce em embriões de camundongo. Essa abordagem oferece insights poderosos sobre a organização espacial e a dinâmica funcional das estruturas craniofaciais tanto em estados de desenvolvimento quanto patológicos, fornecendo uma estrutura crítica para ligar mecanismos moleculares à morfologia dos tecidos.

Introduction

O desenvolvimento dentário depende de uma sequência altamente coordenada de processos morfogenéticos durante o crescimento embrionário^inicial 1,2,3,4. Embora numerosos genes-chave e vias de sinalização tenham sido identificados por meio de estudos genéticos e do desenvolvimento, nosso entendimento de como esses fatores interagem para moldar estruturas craniofaciais individuais permanece limitado. Notavelmente, mesmo com avanços substanciais na ligação de variantes genéticas específicas tanto a distúrbios den....

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (ACUC), sob o Protocolo de Estudo com Animais #21-031.

1. Preparação do animal experimental e coleta de tecidos

1. Combine machos saudáveis e férteis de Mus musculus para acasalamentos temporizados. Identificar fêmeas grávidas pela presença de um tampão vaginal, designado como dia embrionário (E) 0,5.
2. Eutanasiar camundongos fêmeas grávidas por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical. Posicione o supino do....

Results

Este método descreve o processamento de cabeças embrionárias de camundongos recém-dissecadas para gerar amostras de FFPE de tecidos craniofaciais, incluindo o dente em desenvolvimento, que podem ser facilmente seccionadas por micrótomo mantendo a integridade do RNA (Figura 1). Esse protocolo foi aplicado com sucesso às cabeças de embriões murinos E13.5 (embrionário dia 13.5), E15.5 e E16.5 para regiões craniofaciais de alta resolução baseadas em imagens (

Discussion

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para preparar blocos FFPE de cabeças embrionárias de camundongos otimizados para uso em plataformas de imagem espacial de RNA de alta resolução, incluindo transcriptômica espacial baseada em sequenciamento e imagem. Um objetivo fundamental deste protocolo é preservar tanto a morfologia dos tecidos quanto a integridade dos ácidos nucleicos em seções inteiras da cabeça, com foco especial na região craniofacial em desenvolvimento. Garantir.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  para realizar lavagens durante o fluxo de trabalho
50 mL tubos cônicos (Ambion) livres de RNAse	Thermo Fischer	AM12502	Uso para armazenar amostras em diferentes soluções
Oscilador orbital avançado	VWR	6683-470	Uso para agitar tecidos na solução de fixação durante a incubação
Álcool, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Use para limpar e desinfetar todo o espaço de trabalho
Processador automatizado de tecido a vácuo	Leica Biosystems	ASP300S	Uso para limpar desidratação, reidratação e infiltração de cera em amostras
Espessura do Vidro da Cobertura 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Uso para montagem de slides no fluxo de trabalho Visium HD
Buffer de Azulamento Dako, Pronto para Uso	Tecnologias Agilant	CS70230-2	Uso para H& Coloração por E
Eosina-Y com floxina	Fisher Scientific	22050198	Uso para H& Coloração por E
Hematoxilina, Mayer, solução aquosa pronta para uso	Tecnologias Agilant	S330930-2	Uso para H& Coloração por E
Banho-maria HistoCore & nbsp;	Leica Biosystems	HIS2326	Use para flutuar as seções a 40-43 graus; C para remover rugas das seções FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Use para analisar dados do Visium HD
Lâminas descartáveis de perfil baixo DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Use para seccionar blocos FFPE
Formalina Tamponada Neutra 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Usar para consertar os lenços
Solução de Descontaminação RNase RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Uso para limpar e remover RNase
Microtomo Rotativo Semi-Automatizado	Leica Biosystems	RM2245	Use para seccionar blocos FFPE conforme informado nas diretrizes.
Aquecedor de Ferrolho com Tampa	Estreia	XH2004	Uso para incubação de lâminas em diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides & nbsp;	Fisher Scientific	12-550-15	Uso para anexar seções para o Vsium HD
Lâmina cirúrgica nº 11	Integra Miltex	4-311	Uso para a marcação de tecidos FFPE
Paraplastos Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Uso para realizar infiltração de tecidos e inserção de tecidos
TISsue PRATO de cultura 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso para coletar e dissecar amostras em 1x PBS
Glicerol UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Uso para montagem de slides Visium HD do coverglass antes do CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Uso para experimentos de fluxo de trabalho Visium HD
Visium HD Sequenciamento Espacial de RNA	10X Genomics, Inc.	1000676	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos
Xenium 5K Localização In Situ de RNA	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos
Analisador de Xenium	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Use para realizar imagens de RNA de Xênio e Xênia 5K
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Uso para analisar dados de Xenium
Localização in situ de RNA de xênia	10X Genomics, Inc.	1000672	Uso para realizar experimentos espaciais transcriptômicos