Ensaio Padronizado de Citometria de Fluxo usando Painéis de Anticorpos Recombinantes Secos para Caracterização de Células T CAR

Resumo

Este protocolo demonstra como painéis de anticorpos recombinantes secos simplificam a caracterização das células do Receptor de Antígeno Quimérico T (CAR T) ao reduzir a variabilidade e simplificar os fluxos de trabalho. Ele permite a avaliação reprodutível de atributos críticos de qualidade, incluindo a quantificação absoluta das células T do Receptor de Antígeno Quimérico, e é compatível entre diferentes plataformas de citometria de fluxo.

Resumo

A citometria de fluxo é comumente usada para avaliar atributos críticos de qualidade das células do Receptor de Antígeno Quimérico T (CAR T), incluindo viabilidade, fenótipo e eficiência de transdução. Fluxos de trabalho convencionais de reagentes líquidos exigem múltiplas etapas de preparação, o que pode introduzir variabilidade e diferenças no manuseio dependente do operador. Painéis de anticorpos recombinantes secos pré-formulados fornecem um formato alternativo que combina tecnologia de anticorpos recombinantes com uma configuração pronta para uso. Os anticorpos recombinantes oferecem especificidade definida e menor variabilidade de lote para lote, enquanto o formato seco reduz as etapas de preparação e simplifica o manuseio dos reagentes. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho passo a passo para análise de células CAR T usando painéis de anticorpos recombinantes secos. O protocolo inclui coloração de amostras, aquisição de dados e análise, e é acompanhado por uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho. Resultados representativos de coloração são mostrados para ilustrar a aplicação em painéis, e diferenças no tempo de trabalho prático em comparação com um fluxo de trabalho convencional de reagentes líquidos são destacadas. Os exemplos fornecidos demonstram como esses painéis podem ser usados para simplificar a caracterização multiparamétrica das células T CAR. No geral, esse trabalho fornece uma estrutura prática para implementar painéis de anticorpos recombinantes secos na análise de células CAR T baseadas em citometria de fluxo.

Introdução

As terapias com células CAR T surgiram como um avanço importante no tratamento do câncer, especialmente para malignidades hematológicas. Essa abordagem utiliza o próprio sistema imunológico do paciente modificando as células T para expressar receptores de antígeno quiméricos (CARs) que reconhecem e visam as células^{cancerígenas 1}. No entanto, a infraestrutura altamente complexa e os processos de fabricação intensivos em mão de obra necessários para produzir células CAR T tornam a caracterização rigorosa e padronizada essencial para garantir tanto a qualidade do produto quanto a segurança do paciente. Uma parte substancial do custo total da terapia CAR T decorre do extenso trabalho laboratorial e dos procedimentos de controle de qualidade (QC), muitos dos quais envolvem fluxos de trabalho manuais e em múltiplas etapas. Nesse contexto, parâmetros-chave de caracterização — como eficiência de transdução e testes de identidade — são cruciais para avaliar o potencial terapêutico das células^{modificadas 2}. Métodos tradicionais de coloração líquida em citometria de fluxo, comumente usados para essas avaliações, apresentam vários desafios. Variabilidade na pipetagem, problemas de estabilidade dos reagentes e viés do operador podem levar a inconsistências e imprecisões nos dados, comprometendo potencialmente a confiabilidade dos^{resultados 3}.

A citometria de fluxo é uma tecnologia fundamental para a caracterização e controle de qualidade das células CAR T, permitindo uma análise detalhada de múltiplos parâmetros celulares. No entanto, o uso convencional de reagentes líquidos nesse processo está cheio de possíveis^{armadilhas 4,5}. A variabilidade da pipetagem pode introduzir erros significativos, especialmente ao lidar com pequenos volumes e múltiplos reagentes. Além disso, reagentes líquidos são suscetíveis à degradação ao longo do tempo, o que pode comprometer sua estabilidade e resultar em resultados de coloração^{inconsistentes 6}. O viés do operador, decorrente da preparação e manuseio manuais, agrava ainda mais esses problemas, levando potencialmente à variabilidade nos resultados entre laboratórios e até mesmo dentro das corridas no mesmo laboratório. Atributos críticos de qualidade, como viabilidade celular, frequência de transdução, contagem de CD3⁺ e identidade, são essenciais para o lançamento seguro dos produtos CAR T. Garantir a precisão e consistência dessas medições é vital, pois impactam diretamente a eficácia terapêutica e a segurança das células^{CAR T 1}. Por exemplo, a avaliação precisa da frequência de transdução é crucial para determinar a proporção de células T modificadas com sucesso para expressar a CAR, enquanto a contagem e a porcentagem de CD3⁺ fornecem insights sobre a composição geral e pureza da população de células T.

Painéis de anticorpos secos oferecem uma solução promissora para esses desafios, proporcionando entrega consistente de reagentes e reduzindo o tempo de configuração e o risco de erro. Esses painéis são compostos por múltiplos anticorpos que foram secos a partir de coquetéis pré-misturados. Após a secagem, esses painéis são estáveis e prontos para uso, eliminando a necessidade de etapas complexas de preparação e minimizando o potencial de erro humano ^6,7. Importante, não há necessidade de reconstituir esses painéis secos antes do uso — suspensões celulares podem ser adicionadas diretamente à mistura de anticorpos secos. A incorporação de anticorpos recombinantes nesses formatos secos oferece várias vantagens em relação aos reagentes policlonais convencionais ou derivados de hibridoma. Sua estrutura molecularmente definida garante alta consistência e reprodutibilidade de lote a lote, reduzindo a variabilidade entre experimentos e laboratórios. Uma região Fc projetada baseada em IgG1 humano minimiza a reatividade cruzada e a coloração de fundo. Como consequência, o bloqueio Fc não é necessário, reduzindo ainda mais o tempo necessário para realizar o ensaio citométrico de fluxo. O formato seco protege os reagentes da degradação, mantendo sua eficácia ao longo do tempo e entre lotes. Essa consistência é crucial para alcançar resultados confiáveis e reprodutíveis em ensaios de citometria^{de fluxo 8}.

A aplicabilidade dos formatos de reagentes secos abrange várias etapas do desenvolvimento e monitoramento da terapia com células CAR T. No controle de qualidade de fabricação, os reagentes secos facilitam a amostragem em sistemas fechados, garantindo esterilidade e consistência. Isso é particularmente importante em um ambiente clínico, onde manter a integridade da amostra é fundamental⁹. Para a caracterização do produto, os reagentes secos permitem a avaliação precisa das contagens absolutas e dos subconjuntos imunológicos, cruciais para determinar a qualidade terapêutica das células T da CAR. Além disso, em ambientes de pesquisa, os reagentes secos são inestimáveis para o monitoramento longitudinal do paciente, permitindo o acompanhamento consistente da persistência das células CAR T ao longo do tempo, o que é fundamental para entender a eficácia e segurança a longo prazo da terapia.

As vantagens do uso de painéis de anticorpos secos na citometria de fluxo são múltiplas, sendo uma das mais importantes a capacidade de reduzir erros de pipeteamento ao fornecer um painel totalmente pré-configurado, em vez de exigir reagentes individuais resuspensos e combinados manualmente. Ao contrário dos anticorpos secos únicos — que ainda precisam ser reconstituídos e pipetados e, portanto, oferecem principalmente uma vida útil estendida — painéis secos pré-montados eliminam múltiplas etapas manuais de preparação. Isso simplifica o fluxo de trabalho, minimizando significativamente as oportunidades de variabilidade dependente do operador. Como resultado, o processo geral torna-se menos propenso a erros, menos demorado e menos dependente de treinamento técnico extensivo, tornando-o acessível a uma gama mais ampla de^{laboratórios 10}. Além disso, o formato estável e pronto para uso dos painéis de anticorpos recombinantes secos garante desempenho consistente e confiável do ensaio entre operadores e locais⁹.

Para realizar plenamente o potencial da tecnologia de reagentes secos na citometria de fluxo, é essencial desenvolver um protocolo passo a passo para seu uso. Isso inclui diretrizes para manchação de painéis secos, aquisição e análise automatizada, garantindo que todos os aspectos do processo sejam padronizados e otimizados para precisão e eficiência. Ao fornecer um protocolo claro e abrangente, os laboratórios podem alcançar resultados consistentes e confiáveis, facilitando a liberação segura e eficaz dos produtos de células CAR^{T 2}. Aqui, fornecemos um protocolo que aproveita as vantagens dos painéis de anticorpos secos para abordar limitações dos métodos tradicionais de tingimento líquido, aumentando assim a confiabilidade, a eficiência e a reprodutibilidade — características-chave para garantir terapias seguras e eficazes com células CAR T (Figura 1).

Protocolo

Todas as amostras humanas foram coletadas de voluntários anônimos saudáveis após obtenção de consentimento informado por escrito. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e realizados de acordo com as normas éticas e de biossegurança exigidas.

1. Coleta e preparação de amostras

1. Colete amostras asépticas do Receptor de Antígeno Quimérico T (CAR T) das bolsas de processamento para controle de qualidade de fabricação.
2. Processe as amostras rapidamente para manter a viabilidade celular. Armazene as amostras a 2–8 °C, protegidas da luz, até que fiquem manchadas.
3. Determine o número de células de cada amostra antes da coloração.
4. Ajuste cada amostra para uma concentração de até 10^{células nucleadas de 6} por 100 μL usando soro salino tamponado com fosfato (PBS)/2 mM EDTA/0,5% de tampão BSA, pH 7,2.
   1. Se necessário, centrifuge as amostras a 300 × g por 5 minutos. Aspire completamente o sobrenadante.
   2. Ressuspenda as células até a concentração apropriada.

2. Mancha de painéis secos

NOTA: Dois painéis de anticorpos secos pré-formulados são usados para colorir amostras: o Cocktail de Composição Celular Imune (ICC) recombinante seco, humano, e o coquetel de transdução recombinante CAR T seco, humano. A coloração CAR para o painel de transdução CAR T é fundamental. É necessária a separação confiável das células CAR-negativas e CAR-positivas para determinar com precisão a frequência de transdução. A lavagem pode reduzir a recuperação celular devido à perda celular durante a centrifugação e aspiração. Portanto, protocolos sem lavagem geralmente são preferidos quando é necessária concentração celular precisa.

1. ICC Cocktail (protocolo sem lavagem)
   1. Adicione 100 μL da suspensão da célula preparada diretamente ao tubo de anticorpos ICC seco. Misture pipetando para cima e para baixo e/ou brevemente em vórtice para dissolver completamente o pellet. Incube por 10 minutos no escuro, em temperatura ambiente (19–25 °C).
   2. Confirme que o pellet de anticorpos seco está totalmente dissolvido. Prossiga diretamente para a aquisição sem um lavado.
2. Coquetel de transdução CAR T (protocolo de lavagem)
   1. Adicione 100 μL da suspensão da célula preparada ao tubo de transdução CAR T seco.
   2. Adicione o volume apropriado do reagente de detecção CAR (por exemplo, 2 μL). Misture pipetando para cima e para baixo e/ou brevemente em vórtice para dissolver completamente o pellet. Incube por 10 minutos no escuro, em temperatura ambiente (19–25 °C). Confirme que o pellet de anticorpos seco está totalmente dissolvido.
   3. Lave as células adicionando 1 mL de tampão. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos. Remova completamente o sobrenadante.
3. Coloração secundária (se necessário)
   1. Realize uma segunda lavagem (veja passo 2.2.3) para reagentes de detecção CAR marcados com biotina para remover reagentes conjugados com biotina livre e reduzir a mancha de fundo.
   2. Resuspenda as células em 98 μL de tampão. Adicione 2 μL de anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (PE). Vórtice para misturar brevemente. Incube por 10 minutos no escuro, em temperatura ambiente (19–25 °C).
   3. Lave as células para remover o anticorpo secundário não ligado (veja o passo 2.2.3).
4. Preparação final para aquisição
   1. Ajuste o volume de todas as amostras coradas (CAR T Transduction Cocktail e ICC Cocktail) para 300–500 μL com buffer. Proteja as amostras da luz e mantenha entre 2 e 8 °C.
   2. Realize a aquisição em até 1 hora para manter a estabilidade do fluoróforo e preservar a viabilidade celular.

3. Aquisição citométrica de fluxo e análise de dados

1. Prepare e prepare o citômetro de fluxo, garantindo que a calibração e as configurações do instrumento estejam otimizadas.
2. Ligue os lasers e enxágue o sistema fluídico. Deixe pelo menos 30 minutos para a bancada óptica aquecer.
3. Durante o aquecimento, execute um programa de limpeza com uma solução de hipoclorito a 1%.
4. Use esferas de calibração para ajustar as configurações do laser.
5. Prepare controles com uma única coloração para compensação usando conjuntos de anticorpos correspondentes.
   1. Para contas: adicione um volume apropriado de esferas de controle positivo e negativo.
   2. Para células: adicione 100 μL de suspensão celular.
   3. Para reagentes conjugados com biotina: inclua um tubo com 98 μL de tampão mais 2 μL de anticorpo secundário marcado com PE.
   4. Verifique se os reagentes de compensação correspondem ao coquetel de anticorpos (números dos lotes).
6. Incube controles por 10–20 segundos, vártice por 5 segundos e depois incube 10 minutos no escuro a 19–25 °C.
7. Dilua as amostras com 600 μL de tampão e misture cuidadosamente.
8. Configure a compensação usando controles de uma única mancha.
9. Ajuste as tensões FSC e SSC e defina limiares para excluir detritos.
10. Adquira pelo menos 50.000–100.000 linfócitos vivos por amostra.
11. Realize o gate para avaliar a viabilidade, expressão do CD3 e expressão do CAR.
12. Para quantificação absoluta, determine-se a fração de células T CAR-positivas (f₍CAR T₎).
13. Defina leukócitos totais (N₍total₎) como ^CD45+ viável, células únicas após exclusão de detritos.
14. Meça a contagem total de leucócitos por contagem direta a partir de amostras coloridas com ICC, se for apoiado pelo instrumento, ou usando esferas de contagem ou um analisador hematológico.
15. Calcule a concentração de células CAR T:
    
    NOTA: Exemplo de cálculo com valores das Figuras 2 e 3
    ​
    
16. Aplique esse método para a quantificação das células T CAR em diferentes instrumentos e fluxos de trabalho.

Resultados

Painéis de anticorpos recombinantes secos foram aplicados em amostras de células T CAR⁺ para demonstrar os fluxos de trabalho de coloração por citometria de fluxo. Como ilustrado na Figura 1, substituir os fluxos de trabalho convencionais de reagentes líquidos por painéis de anticorpos secos pré-formulados elimina várias etapas de preparação—incluindo a rotulagem do tubo (para indicar a composição de anticorpos do painel; cada tubo ainda requer o ID apropriado da amostra), combinação de reagentes e mistura manual—simplificando assim o processo de coloração. Os tubos incluem um rótulo que pode ser escaneado com citômetros compatíveis ou lido manualmente, oferecendo opções flexíveis para identificação de amostras.

Exemplos representativos mostram que o painel de composição das células imunes secas permite a identificação de subconjuntos de leucócitos-chave (Figura 2), enquanto o painel de transdução CAR T seca permite visualizar células T que expressam CAR e avaliar a transdução (Figura 3). O bloqueio de Fc não é necessário para esses painéis, e apenas um controle isotipo é necessário para todos os anticorpos do painel. Esses exemplos destacam a aplicação de painéis secos para análise multiparamétrica de células CAR T e demonstram como o fluxo de trabalho pode ser executado de forma eficiente com menos etapas práticas. A composição dos painéis de anticorpos secos usados neste estudo é fornecida na Tabela 1.

A Figura 4 ilustra a redução do tempo de preparação para um experimento representativo ao usar painéis secos tanto para usuários menos experientes quanto experientes. O formato seco simplifica os procedimentos de mancha, minimiza o manuseio manual e fornece orientações práticas para implementação e treinamento de fluxos de trabalho. Importante, o uso de coquetéis de anticorpos secos gerou frequências de subconjuntos de células imunes comparáveis às obtidas com coquetéis líquidos convencionais (Figura 5). Além disso, painéis de anticorpos secos são estáveis em temperatura ambiente e podem ser armazenados em condições ambientes durante toda a sua vida útil de um ano, ao contrário dos anticorpos líquidos convencionais, que normalmente exigem armazenamento a frio. Essa estabilidade suporta uso repetido, estudos de longo prazo e gestão simplificada de estoques.

Em conclusão, os exemplos fornecidos demonstram como painéis de anticorpos recombinantes secos podem ser usados para simplificar a caracterização multiparamétrica das células T CAR. No geral, este trabalho oferece uma abordagem prática para a implementação de painéis de anticorpos secos na análise de células CAR T baseada em citometria de fluxo, com manuseio simplificado, redução de etapas de preparação e configurações de painel adaptáveis.

Figura 1: Comparação entre o fluxo de trabalho de coloração manual e os painéis de anticorpos recombinantes secos. O fluxo de trabalho manual tradicional (topo) envolve múltiplas etapas de preparação, incluindo rotulagem de tubos, combinação e mistura de reagentes, e adição de amostras, o que pode aumentar o esforço prático. Em contraste, o fluxo de trabalho do painel de anticorpos recombinantes secos (base) utiliza painéis pré-premixados e secos que requerem apenas a adição da amostra. Essa abordagem simplificada reduz etapas manuais e simplifica o processo de coloração, ilustrando a eficiência do fluxo de trabalho e a implementação prática. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Análise citométrica de fluxo de uma amostra de leucaferêrese corada com o painel de anticorpos recombinantes secos "Cocktail de Composição Celular Imunológica". (A) Detritos foram excluídos por barragem entre FSC e SSC para incluir todas as células. (B) Os doublets foram removidos usando uma porta FSC-A versus FSC-H. (C) Os leucócitos foram identificados por meio de portação em células CD45⁺ , permitindo a exclusão de eritrócitos residuais. (D) Células mortas foram excluídas usando coloração 7-AAD. (E,F) Células CD3⁺ foram identificadas e posteriormente classificadas em células (E) T e células (F) NKT com base na expressão do CD56. (G) As células T foram subsequentemente separadas em subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺ . (H) Dentro da população CD3^– , os monócitos foram definidos pela expressão do CD14 e as células B pela expressão do CD19. (I) As células demais CD14^–/CD19^– foram subdivididas em células SSC alta/CD16^– eosinófilas, SSC alta/CD16⁺ neutrófilos e células SSC baixa/CD56⁺/CD16⁺ . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise citométrica de fluxo das células CAR T CD19 (FMC63) coradas com o painel de anticorpos recombinantes secos "CAR T Transduction Cocktail". (A) Os detritos foram excluídos por gate no FSC versus SSC para incluir todas as células. (B) Os doublets foram removidos usando uma porta FSC-A versus FSC-H. (C) Os leucócitos foram identificados por portamento em células CD45⁺ . (D) Células mortas foram excluídas com base na coloração com 7-AAD⁻ . (E,F) Células CD3⁺ foram identificadas e posteriormente separadas em populações ^CAR+ e ^CAR− . (G) As células ^CAR+ e (H) ^CAR− foram subdivididas em subconjuntos de células T CD4⁺ e CD8⁺ . (I) Dentro da população ^CD3− , os monócitos residuais foram definidos pela expressão CD14. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Economia de tempo obtida com painéis de anticorpos secos em diferentes níveis de experiência. Para usuários não experientes (à esquerda) e experientes (à direita), foi avaliado o tempo necessário para montar um experimento citométrico de fluxo (painel de anticorpos recombinantes secos "Immune Cell Composition Cocktail", triplicados técnicos) desde o início do experimento até o início da incubação, incluindo manuseio de reagentes, pipetagem e documentação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Análise de citometria de fluxo de sangue total lisado, sobreposição de uma amostra corada com o painel de anticorpos recombinantes secos "Immune Cell Composition Cocktail" (azul) e uma amostra colorida com os mesmos anticorpos em formato líquido (laranja). (A) Detritos foram excluídos por gate entre FSC versus SSC para incluir todas as células. (B) Os doublets foram removidos usando uma porta FSC-A versus FSC-H. (C) Os leucócitos foram identificados por portação em células CD45⁺, excluindo assim os eritrócitos residuais. (D) Células mortas foram excluídas usando coloração 7-AAD. ^Células CD3+ (E) foram identificadas. (F) Essas células foram então classificadas em células T e células NKT com base na expressão do CD56. (G) As células T foram subsequentemente separadas em subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺. (H) Dentro da população CD3^–, os monócitos foram definidos pela expressão do CD14 e as células B pela expressão do CD19. (I) As células demais CD14^–/CD19^– foram subdivididas em células SSC alta/CD16^– eosinófilas, SSC alta/CD16⁺ neutrófilos e células SSC baixa/CD56⁺/CD16⁺. (J) Frequências obtidas com anticorpos líquidos e painéis de reagentes secos foram comparadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Propósito	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Determinação da viabilidade celular e composição das células imunes	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Determinação da eficiência de transdução de células T CAR	CD45	CD4	CD3	Reagente de detecção CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

Tabela 1: Composição dos painéis de anticorpos recombinantes secos usados para análise de células CAR T. Esta tabela lista os anticorpos incluídos em cada painel seco, especificando o antígeno alvo, clone, fluorocromo e a quantidade típica por tubo. São apresentados dois painéis: o painel "Composição Celular Imunológica" para identificação dos principais subconjuntos de leucócitos, e o painel "Transdução T CAR" para detecção da expressão de CAR e caracterização de subconjuntos de células T. As informações fornecem uma referência para implementação do fluxo de trabalho e adaptação opcional com anticorpos conjugados líquidos adicionais.

Discussão

Painéis de anticorpos recombinantes secos fornecem um fluxo de trabalho eficiente e prático para a caracterização de células CAR T em laboratório. O formato pré-formulado reduz as etapas de preparação e simplifica o manuseio, ajudando a limitar a variabilidade dependente do operador e suportando a execução consistente de procedimentos de citometria de fluxo^{multiparamétrico 8}. Exemplos representativos ilustram o uso desses painéis para identificar subconjuntos de leucócitos, detectar a expressão de CAR e avaliar subconjuntos de células T. Os painéis também podem ser complementados com anticorpos conjugados líquidos adicionais para incluir marcadores extras ou subconjuntos imunológicos, permitindo adaptação flexível a necessidades experimentais específicas ou análises de parâmetros mais altos.

A detecção precisa do CAR é fundamental para a determinação confiável da frequência^{de transdução 1}. A separação clara das populações CAR-negativas e CAR-positivas depende de condições de coloração devidamente otimizadas, especialmente quando os níveis de expressão de CAR variam. Controles como amostras de fluorescência menos um (FMO) podem suportar uma barreira precisa. Em alguns casos, as etapas de lavagem podem melhorar a discriminação ao remover anticorpos não ligados; No entanto, essas etapas podem reduzir a recuperação celular devido à perda celular durante a centrifugação e aspiração. Portanto, fluxos de trabalho sem lavagem podem ser preferidos quando é necessária quantificação precisa das células.

Embora a abordagem idealmente utilize um reagente de detecção específico para CAR que reconheça o domínio extracelular do CAR modificado, reagentes alternativos, como anticorpos que visam regiões de ligação conservadas entre os domínios de ligação e sinalização de antígenos, também podem ser empregados. Essas alternativas permitem a detecção de células que expressam CAR e podem ser incorporadas em fluxos de trabalho onde reagentes específicos para CAR não estão disponíveis, com otimização adequada.

A integração com sistemas automatizados de aquisição e análise, incluindo o Modo Express, pode agilizar ainda mais a coleta e análise de dados, reduzindo o tempo de trabalho prático e permitindo a execução consistente dos fluxos de trabalho entre operadores.

Embora este trabalho ilustre o método, a validação formal de ensaios para fabricação regulamentada ou testes de liberação não foi realizada. A validação multicêntrica ainda não foi realizada, então a reprodutibilidade entre laboratórios ainda precisa ser^{confirmada 5}. A abordagem depende de painéis pré-formulados, o que pode limitar a flexibilidade para aplicações altamente especializadas. No entanto, opções de painéis secos sob medida podem ser projetadas para incluir marcadores ou combinações específicas, permitindo fluxos de trabalho personalizados e superando as limitações dos painéis padrão. As considerações de custo são amplamente equilibradas por redução do tempo de trabalho prático e procedimentos simplificados, o que pode ser particularmente vantajoso em fluxos de trabalho de alta produtividade.

Trabalhos futuros poderiam focar em avaliações quantitativas de desempenho, validação formal para uso regulado e expansão para estudos multicêntricos para avaliar a consistência do fluxo de trabalho entre laboratórios. O design personalizado de painéis representa uma via prática para expandir a cobertura de marcadores, responder a questões experimentais únicas ou adaptar-se a estudos longitudinais de imunomonitoramento.

Em resumo, painéis de anticorpos recombinantes secos fornecem uma plataforma flexível e prática para citometria de fluxo de células CAR T. Eles reduzem etapas de preparação, simplificam fluxos de trabalho e suportam design experimental flexível, incluindo configurações personalizadas de painéis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(Opcional) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Apenas necessário se for utilizado um Reagente de Detecção de CAR conjugado com Biotina.
(Opcional) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Adição de software para MACSQuant Analyzers; permite portões automatizados e análise de dados, embora a análise manual também seja possível.
Reagente de Detecção de CAR de escolha detectável no canal PE, por ex., Reagente de Detecção de CAR CD19, humano, Biotina	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Opções alternativas: CD19 CAR FMC63 Idiotype Antibody, PE, REAfinity (130-127-342); Reagente de Detecção de CAR CD22, humano, Biotina (130-126-727); Reagente de Detecção de CAR BCMA, humano, PE (130-133-888)
Citômetro de fluxo, por ex., MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	Os tubos StainExpress são compatíveis com todos os citômetros de fluxo padrão.
StainExpress CAR T Transduction Cocktail, humano	Miltenyi Biotec	130-127-638	Configurações personalizadas de painel de anticorpos secos podem ser solicitadas através do representante local da Miltenyi Biotec ou equipe de suporte técnico.
StainExpress Immune Cell Composition Cocktail, humano	Miltenyi Biotec	130-127-637	Configurações personalizadas de painel de anticorpos secos podem ser solicitadas através do representante local da Miltenyi Biotec ou equipe de suporte técnico.