Ensaio de Citometria de Fluxo Multiplex Baseado em Esferas para Perfil Funcional de Células T CAR

Resumo

Este artigo apresenta um ensaio de citometria de fluxo baseado em esferas multiplex para quantificar até 12 citocinas e moléculas efetoras de supernadantes derivados de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR)-T, permitindo uma análise rápida e reprodutível da funcionalidade das células T modificadas com pequenos volumes de amostras.

Resumo

O perfil das células CAR T apresenta desafios devido à sua heterogeneidade, respostas imunes complexas e disponibilidade limitada de amostras. Ensaios multiplex permitem a avaliação funcional ao permitir a detecção simultânea de uma ampla gama de moléculas efetoras, incluindo citocinas, quimiocinas e mediadores citotóxicos. Aqui, descrevemos um ensaio multiplex baseado em esferas compatível com citometria de fluxo para a análise da secreção de moléculas efetoras por células T do receptor quimérico de antígeno (CAR)-T humano. Os supernadantes das células T CAR são incubados com uma mistura de esferas de captura compostas por múltiplas populações codificadas por fluorescência, acopladas a anticorpos específicos do analito. Essas esferas se ligam a alvos solúveis na amostra, formando complexos esfera-analito que são posteriormente detectados usando anticorpos de detecção marcados. O ensaio inclui um painel de mediadores imunológicos como interferon (IFN)-γ, interleucina (IL)-2, fator de necrose tumoral (TNF)-α, IL-6, IL-10, fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e Granzyme B. O uso de padrões pré-definidos permite a medição quantitativa de múltiplos analitos a partir de uma única amostra. A aquisição e análise de dados podem ser realizadas usando abordagens automatizadas de gate fornecidas por ferramentas de software associadas a instrumentos ou baseadas na web, facilitando o processamento de dados. Em conclusão, o ensaio multiplex apresentado permite a análise multiparamétrica da funcionalidade das células CAR T e pode ser aplicado em contextos como pesquisa, testes de controle de qualidade, estudos mecanicistas e caracterização funcional.

Introdução

A caracterização funcional é essencial no teste de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), pois fornece insights sobre a potência, segurança e mecanismos de ação dessas terapias. Compreender citocinas e assinaturas mediadoras citotóxicas ajuda a avaliar a eficácia terapêutica e os potenciais efeitos adversos, garantindo o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes. Ensaios tradicionais de plexo único, como ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA), apresentam limitações, como a necessidade de altos volumes de amostras, tempos de processamento longos e execuções separadas para cada analito, além de oferecer uma faixa dinâmica limitada dentro de amostras^{individuais 1,2}. Em contraste, ensaios baseados em esferas multiplex permitem a detecção simultânea de múltiplos mediadores solúveis, reduzindo o tempo de processamento e as necessidades da amostra, além de aumentar a faixa dinâmica ^1,2. Essa eficiência e profundidade de análise tornam os ensaios multiplex ferramentas valiosas para o avanço da pesquisa e desenvolvimento de células CAR^{T 3,4,5}.

O ensaio multiplex apresentado neste estudo utiliza esferas de captura, que apresentam perfis de fluorescência definidos nos canais de fluoresceína isotiocianato (FITC) e ficoeritrina (PE), e são revestidas com anticorpos específicos contra analitos solúveis. Durante a incubação com uma amostra, essas esferas se ligam seletivamente aos seus analitos-alvo da solução. Após a captura do analito, anticorpos de detecção são adicionados para formar complexos sanduíche específicos do analito. Esses anticorpos são diretamente conjugados à aloficocianina (APC) (detecção direta) ou à biotina (detecção indireta). Para a detecção indireta, é necessária uma incubação subsequente com um anticorpo antibiotina conjugado com APC (Figura 1). Os complexos resultantes – compostos por esferas de captura, analitos e anticorpos de detecção – são analisados por citometria de fluxo para quantificar as concentrações dos analitos. O ensaio multiplex é uma tecnologia baseada em placas, incluindo padrões pré-definidos usados para gerar curvas padrão específicas de^{analito 1,2}.

Figura 1: Princípio da tecnologia de citocinas e fluxo de trabalho de ensaio. O ensaio é baseado em 12 populações de esferas de captura codificadas por fluorescência, acopladas a anticorpos específicos do analito. Após a incubação da amostra, são formados complexos de esferas e analito, que podem ser detectados por citometria de fluxo usando anticorpos específicos de detecção. O fluxo de trabalho do ensaio inclui 1) a preparação de padrões de analito e amostras de interesse em uma placa filtrante, 2) incubação com esferas de captura, 3) incubação com anticorpos anti-analito marcados com biotina para formar complexos sanduíche, 4) incubação com anticorpos anti-biotina marcados com APC, 5) ressuspensão em tampão para medição e 6) aquisição de amostras. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O ensaio multiplex descrito neste estudo é compatível com citometros de fluxo padrão equipados com um blue (por exemplo, 488 nm; canais FITC e PE) e um laser vermelho (por exemplo, 635 nm; canal APC). Como os citometros de fluxo estão amplamente disponíveis em laboratórios de pesquisa, ambientes clínicos e ambientes de controle de qualidade, essa compatibilidade facilita a implementação sem a necessidade de instrumentação especializada^{adicional 5}. No contexto dos testes de funcionalidade das células T CAR, essa abordagem permite a avaliação multiparamétrica das respostas funcionais dentro dos fluxos de trabalho analíticos comumente^{disponíveis 6}. O ensaio oferece vantagens significativas para a pesquisa com células CAR T ao permitir a quantificação simultânea de analitos chave, incluindo GM-CSF, Granzima B, interferon (IFN)-γ, interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, proteína quimioatrativante de monócitos-1 (MCP-1), perforina e fator de necrose tumoral (TNF)-α (painel de citotoxicidade humana). Esses mediadores são fundamentais para entender a ativação das células CAR T, a função dos efetores e a liberação de citocinas relacionadas à^segurança 4,5,7,8.

O fluxo de trabalho do ensaio inclui opções para acesso automatizado e análise de dados usando software associado ao instrumento, bem como ferramentas de análise independentes do instrumento e baseadas na^{web 5}. Essas funcionalidades suportam o processamento simplificado dos dados de perfilamento de moléculas efetoras das células CAR T ao reduzir a extensão da intervenção manual. O uso de análise automatizada pode contribuir para uma maior consistência no tratamento dos dados e facilitar uma avaliação mais eficiente das leituras^{funcionais 8}.

O protocolo atual descreve um método multiplex reproduzível e escalável para o perfil de mediadores imunes de células CAR T. Ao medir 12 analitos diferentes em uma única amostra, a abordagem é particularmente relevante para investigações mecanicistas, pesquisas em estágio inicial e estudos concomitantes. Em estágios avançados da terapia com células CAR T, pode ser benéfico reduzir o número de citocinas medidas, especialmente em um ambiente regulado e sensível ao tempo de controle de qualidade (QC) para testes de liberação de medicamentos. Para esse fim, de 1 a 7 citocinas do painel apresentado podem ser reunidas para projetar um ensaio personalizado de citocinas que pode ser validado para análise de células T engenheirada. Isso torna o protocolo descrito ideal para aplicações diversas tanto em pesquisas quanto em contextos de controle de qualidade tanto nos estágios iniciais quanto finais da terapia com células^{CAR T} 3,4,5,9.

Protocolo

Todas as amostras humanas foram coletadas de voluntários anônimos saudáveis após obtenção de consentimento informado por escrito. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e realizados de acordo com as normas éticas e de biossegurança exigidas.

1. Cocultura de células CAR T

1. Preparar uma cultura celular de células CAR T humanas modificadas na ausência e presença de antígeno afins, por exemplo, células tumorais apresentadoras de antígeno, em uma proporção de 2,5:1 (efetor: células-alvo).
2. Defina um ou vários pontos de tempo para a coleta de supernadantes para analisar citocinas secretadas uma vez, ou cinética de citocinas em um período definido, por exemplo, em 4, 8, 16, 24 e 48 horas.
   NOTA: Os supernadantes podem ser usados diretamente ou podem ser congelados para uso posterior.

2. Preparação padrão e de amostra

1. Reconstitua o padrão do analito adicionando 200 μL de tampão ou meio de cultura celular ao pellet e misture suavemente. Prepare seis tubos de reagente e realize uma série de diluição 1:5 do padrão reconstituído, até 3,2 pg/mL ou 0,6 pg/mL (dependendo do analito), e prepare um blank.
2. Colete supernadantes da cocultura CAR T, por exemplo, 16 h ou 24 h após a co-cultura. Opcionalmente, colete células CAR T para fenotipagem paralela usando citometria de fluxo.
3. Centrifuge as amostras a 10.000 × g por 10 minutos a 4 °C. Use os supernadantes puros ou dilua-os para se encaixar na faixa padrão de curvas.

3. Fluxo de trabalho de ensaio

1. Faça vórtice na mistura de contas de captura para resuspendê-la completamente. Adicione 50 μL do padrão ou amostra, junto com 20 μL de esferas pré-diluídas, aos poços de uma placa filtrante de 96 poços.
2. Incube por 2 horas em temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave os poços duas vezes com 200 μL de tampão usando um coletor a vácuo ou centrífuga.
3. Adicione 100 μL do reagente de detecção pré-diluído 1:50 (no buffer). Incube por 1 hora em temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave duas vezes.
4. Adicione 100 μL do reagente de detecção pré-diluído 1:50 2 (no buffer). Incube por 30 minutos em temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave uma vez.
5. Para a aquisição, resuspenda as amostras em 200 μL de tampão. Uma visão geral do fluxo de trabalho do ensaio é mostrada na Figura 1.

4. Aquisição e análise de dados

1. Adquira dados em um citômetro de fluxo equipado com lasers azul e vermelho (canais PE, FITC e APC são necessários). Ao trabalhar com citômetros de fluxo MACSQuant, utilize os templates Express Mode para gating e análise de dados totalmente automatizados.
2. Alternativamente, envie arquivos de dados FSC ou MQD para a ferramenta web InspectoR, que realiza medições quantitativas automatizadas de citocinas e fornece resultados prontos para exportação, independentes do instrumento utilizado.
3. Certifique-se de verificar a separação adequada das 12 diferentes populações de esferas de captura no canal FITC versus PE.
4. Aplique a curva padrão para calcular as concentrações de citocinas e exporte e visualize os resultados.
5. Para aquisição de dados em um citômetro de fluxo MACSQuant, use o código de barras 2D do frasco das esferas de captura, que contém todas as configurações relevantes de aquisição.
   1. Após fazer login no software, selecione a Placa de Filtro MACSPlex como rack de amostras e clique no botão Código de Barras na barra de ferramentas para ativar o leitor de códigos 2D.
   2. Apresente o frasco ao leitor, garantindo que o código fique voltado para a luz piscante a uma distância ideal de 0,5–2,5 cm.
   3. Na aba Autolabel , atribua as Capturas de Conta (MPx Cyt T-NK,h) e NoLabel. Para as diluições seriais do padrão citotóxico de células T/NK, defina as posições dos grupos e, na aba Configurações , selecione Modo Expresso com Tipo: Análise e Modo: MACSPlex_Standard, aplicando uma mistura suave conforme necessário.
   4. Amostras desconhecidas são atribuídas de forma semelhante, com suas posições definidas, agrupamento opcional e seleção de Modo Expresso, Tipo: Análise e Modo: MACSPlex_Sample na aba Configurações , incluindo IDs e descrições opcionais de exemplo.
   5. Verifique se as definições de rack estão corretas na Tabela de Experimentos , assegure os níveis corretos de líquido nos poços da placa de filtro e então inicie a medição.

Resultados

Identificação de populações representativas de contas de captura codificando 12 analitos solúveis

Populações de esferas de captura foram identificadas usando os canais FITC e PE do citômetro de fluxo. Agrupamentos distintos de esferas representando analitos individuais foram claramente resolvidos no gráfico biaxial, incluindo IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 e GM-CSF (Figura 2). Cada população apresentou uma assinatura de fluorescência única, confirmando a detecção múltipla bem-sucedida e a diferenciação clara das citocinas e moléculas efetorais medidas.

Figura 2: Detecção de populações representativas de contas de captura multiplexadas. As esferas de captura contêm intensidades de fluorescência inerentes que podem ser usadas para distinguir as diferentes populações específicas de analitos. O gráfico de dispersão mostra a separação de sinais específicos do analito com base na intensidade de fluorescência nos canais FITC (B1) e PE (B2). A imagem mostra um perfil representativo das 12 populações de esferas de captura que codificam para GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin e TNF-α. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Perfil representativo de concentração de citocinas das células T CAR após co-cultura com células tumorais

Após a co-cultura de células CAR T com células-alvo tumorais, as concentrações de citocinas foram quantificadas usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex (Figura 3). As células T CAR secretaram altos níveis de Granzyme B (49.950,2 pg/mL), IFN-γ (48.367,8 pg/mL), TNF-α (7.055,2 pg/mL) e GM-CSF (6.653,5 pg/mL), indicando ativação potente e função efetora citotóxica em resposta ao engajamento tumoral. Os níveis de IL-2 excederam o limite superior de detecção (>10.000 pg/mL), consistente com forte sinalização proliferativa. A amostra não foi diluída nem remedida. Em contraste, citocinas associadas a respostas regulatórias ou alternativas de células T auxiliares, incluindo IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e MCP-1, estavam presentes em níveis baixos ou quase indetectáveis. Esses resultados sugerem que as células CAR T apresentaram uma resposta imune predominantemente do tipo 1 (Th1/citotóxica) caracterizada por alta atividade dos efetores e produção limitada de citocinas imunossupressoras.

Figura 3: Perfil representativo de citocinas das células CAR T após co-cultura com células tumorais. Células T do Receptor Quimérico de Antígeno (CAR) modificadas foram co-cultivadas durante a noite com células tumorais JeKo-1. Os supernadantes em cultura celular foram colhidos após 16 horas de incubação e centrifugados para remover partículas. Amostras diluídas foram analisadas usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex. Duas curvas padrão foram realizadas e as concentrações de todos os 12 analitos foram determinadas. Um dado representativo para a análise e cálculo das concentrações específicas do analito usando o Modo Express do citômetro de fluxo é mostrado. O gráfico de barras e a tabela acompanhante mostram os níveis calculados (picograma/mililitro) das 12 moléculas efetoras. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Cinética de secreção de citocinas das células CAR T após estimulação específica do antígeno

Após a co-cultura de células CAR T com células-alvo expressando (Antígeno⁺) ou sem (Antígeno⁻) do antígeno cognato, a secreção de citocinas foi monitorada ao longo do tempo usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex. As células CAR T apresentaram liberação rápida e robusta de citocinas ao reconhecer alvos Antigen⁺, com forte regulação positiva de Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-2 em 8–24 horas, atingindo níveis máximos em 48 horas (Figura 4). Esse padrão indica ativação potente e função efetora citotóxica após o engajamento do antígeno. Também foram observados aumentos moderados em IL-6, IL-17A e IL-21, enquanto IL-4, IL-10, MCP-1 e Perforin permaneceram baixos ou moderadamente elevados. Em contraste, coculturas com alvos Antigen⁻ apresentaram indução mínima de citocinas em todos os analitos (Figura 4). Juntos, esses dados demonstram que a ativação das células CAR T e a produção de citocinas efetoras ocorrem especificamente em resposta ao reconhecimento de antígenos e se intensificam ao longo do tempo.

Figura 4: Cinética de secreção de moléculas efetoras de células CAR T co-cultivadas com células-alvo antigênico-positivas ou negativas para antígenos. Células T do Receptor Quimérico do Antígeno (CAR) modificadas foram co-cultivadas com células-alvo que expressavam (Antígeno⁺) ou não possuíam (Antígeno⁻) o antígeno cognato CAR T por 4, 8, 16, 24 e 48 horas. Em cada momento, supernadantes da cultura foram coletados e analisados usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex para quantificar um amplo painel de analitos efetores solúveis ao longo do tempo. A cinética das citocinas para 12 analitos é mostrada (picograma/mililitro). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

O ensaio multiplex foi utilizado para perfilar respostas mediadoras imunes solúveis em coculturas de células CAR T. Células CAR T co-cultivadas com células-alvo antigênico-positivas mostraram aumento na secreção de IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzyme B e IL-2, consistente com ativação do efetor e função ^{citotóxica 4,5,8}. Em contraste, controles antigênicos apresentaram baixa produção de citocinas, demonstrando a capacidade do ensaio de discriminar respostas específicas do antígeno sob as condições^{testadas 5,8}. Esses resultados apoiam a aplicabilidade do ensaio para avaliar a funcionalidade das células CAR T, incluindo uso em análises relacionadas à potência, perfis associados à segurança e investigações mecanicísticas.

Embora o painel fixo de 12 analitos forneça uma visão geral ampla da atividade imune à CAR T, pode não ser prático capturar toda a gama de analitos em todas as aplicações. Para fluxos de trabalho focados, como validação de ensaios ou testes de controle de qualidade (QC) de produtos com células CAR T, o painel pode ser reduzido para um subconjunto reduzido (por exemplo, IL-2, IFN-γ e TNF-α) para simplificar a análise mantendo a sensibilidade^{funcional 1,2}.

Etapas críticas do protocolo incluem o desenho da cocultura das células T CAR e a seleção adequada das condições de amostragem. Em particular, a duração da cocultura e o número de células efetoras (razão E:T) determinam diretamente a magnitude das citocinas e devem ser definidos durante a configuração do^{ensaio 5,6}. Além disso, a diluição da amostra deve ser ajustada para garantir que as concentrações de analito estejam dentro da faixa dinâmica ^1,2 do ensaio. A solução de problemas deve, portanto, focar na verificação do desempenho da curva padrão e no ajuste das condições de cocultura ou fatores de diluição caso os sinais estejam fora da faixa^{quantificável 1,2}.

Comparado aos ELISAs tradicionais de plexo único, a plataforma de multiplex baseada em citometria de fluxo gera conjuntos de dados multi-analitos de alta densidade a partir de volumes amostrais mínimos. Ao permitir a medição simultânea de múltiplos analitos dentro de uma única amostra, a multiplexação pode reduzir o consumo total de reagentes, aumentar o débito da amostra e encurtar o tempo de ensaio em relação à realização de múltiplos ensaios plex^{únicos 1,2}. Opções automatizadas de aquisição e análise padronizada podem potencialmente reduzir a variabilidade dependente do usuário e suportar reprodutibilidade e escalabilidade em ambientes experimentais ou de^{fabricação 5,8}. A sensibilidade padrão da detecção ELISA normalmente varia de 16 a 2000 pg/mL (pode ser menor para kits de alta sensibilidade⁾⁷. Dentro da plataforma apresentada neste estudo, as menores concentrações detectáveis variam de 0,05 pg/mL para os analitos mais sensíveis até aproximadamente 93,8 pg/mL para aqueles com sensibilidade inerentemente menor ao ensaio. Em avaliações internas, mais de 74% dos analitos medidos apresentaram limites de detecção abaixo de 5 pg/mL, e 38% foram detectáveis abaixo de 1 pg/mL, ressaltando a sensibilidade geral do sistema. Como a sensibilidade ao multiplex pode variar conforme a citocina, a possível competição entre epítopos continua sendo uma consideração importante. Para minimizar essa interferência, o ensaio emprega epítopos não sobrepostos para captura e detecção de cada analito, reduzindo assim o viés relacionado à competição e melhorando a confiabilidade da medição em condições multiplexadas.

O desempenho do ensaio multiplex pode variar entre os analitos dependendo da sensibilidade e do contexto biológico, e sob certas condições, as concentrações dos analitos podem se aproximar do limite superior de detecção e, portanto, devem ser avaliadas durante a configuração do ensaio. Por outro lado, alguns analitos (por exemplo, MCP-1 e IL-4 neste estudo) podem permanecer indetectáveis dependendo das condições experimentais. Além disso, fatores pré-analíticos, como o manuseio das amostras, podem influenciar as medições de citocinas, e condições de processamento consistentes devem ser mantidas para garantir a comparabilidade.

No geral, essa abordagem multiplex permite a caracterização eficiente e quantitativa da funcionalidade das células CAR T. Em comparação com a maioria das plataformas existentes de detecção de citocinas multiplexadas, o ensaio é compatível com citometros de fluxo padrão e inclui uma ferramenta de software associada ao instrumento que facilita a aquisição e análise de dados simplificada. Embora a detecção de citocinas multiplex já tenha sido usada em outros ambientes imunológicos, o presente trabalho demonstra sua aplicação ao perfil funcional de células CAR T dentro de um fluxo de trabalho padronizado. O formato baseado em esferas permite a detecção simultânea de múltiplos analitos, suportando maior taxa de transferência em comparação com métodos single-plex. As aplicações potenciais incluem avaliação funcional do produto farmacêutico, como avaliação de ligantes CAR, otimização vetorial e desenvolvimento de processos. A escalabilidade e as capacidades de análise automatizada do ensaio também suportam testes de potência, perfilamento de segurança e estudos mecanicistas voltados para entender o comportamento e a funcionalidade das células T^{CAR 5,7,8}.

Embora os perfis de secreção de citocinas forneçam insights valiosos sobre a ativação das células CAR T e a potência funcional in vitro, eles não podem replicar totalmente a complexa biologia que determina a eficácia terapêutica nos pacientes. Fatores como o microambiente tumoral, densidade de antígenos, regulação imune e persistência in vivo influenciam o desempenho das células T CAR além do que pode ser medido em ensaios^{controlados 6,8,10}. No entanto, estabelecer ensaios funcionais robustos e padronizados, como o perfil de citocinas multiplex, representa um passo importante rumo à caracterização funcional do produto^{farmacêutico 3,4}. Os padrões de citocinas não são apenas indicativos da atividade das células CAR T, mas também estão intimamente associados a fenômenos de toxicidade, incluindo a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a síndrome de neurotoxicidade associada às células efetorais imunes (ICANS^)3,6,7. Atualmente, a variabilidade nos métodos de medição e nos relatórios limita a comparabilidade entre ensaios, destacando a necessidade de um perfil padronizado e reprodutível de mediadores ^{imunológicos 1,2,3}. À medida que as tecnologias analíticas e os conjuntos de dados clínicos continuam a avançar, o objetivo final é definir assinaturas preditivas de secreção que reflitam de forma confiável tanto o potencial terapêutico quanto a segurança do paciente, fazendo a ponte entre os ensaios pré-clínicos de potência e a eficácia clínica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Ensaio de citocina múltiplex baseado em bead para citometria de fluxo
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Ferramenta baseada na web para gateway e análise automatizada de dados MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados múltiplex
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados múltiplex
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Software para gateway e análise automatizada
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Meio de cultura celular livre de soro otimizado desenvolvido para o cultivo e expansão de células T humanas e de rato