Ensaio de Citometria de Fluxo Múltiplo Baseado em Contas para Perfil Funcional de Células T CAR

Summary

Este artigo apresenta um ensaio de citometria de fluxo baseado em bead multiplex para quantificar até 12 citocinas e moléculas efetoras a partir de supernantes derivados de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR), permitindo uma análise rápida e reproduzível da funcionalidade das células T engenheiradas com pequenos volumes de amostra.

Abstract

A caracterização das células CAR T apresenta desafios devido à sua heterogeneidade, respostas imunes complexas e disponibilidade limitada de amostras. Os ensaios multiplex permitem a avaliação funcional permitindo a detecção simultânea de uma ampla gama de moléculas efetoras, incluindo citocinas, quimiocinas e mediadores citotóxicos. Aqui, descrevemos um ensaio multiplex baseado em bead compatível com citometria de fluxo para a análise da secreção de moléculas efetoras por células T carreadoras de receptor de antígeno quimérico (CAR) humanas. Os sobrenadantes das células CAR T são incubados com uma mistura de beads de captura compreendendo múltiplas populações codificadas por fluorescência acopladas a anticorpos específicos do analito. Esses beads se ligam a alvos solúveis na amostra, formando complexos bead-analito que são subsequentemente detectados usando anticorpos de detecção rotulados. O ensaio inclui um painel de mediadores imunes como interferon (IFN)-γ, interleucina (IL)-2, fator de necrose tumoral (TNF)-α, IL-6, IL-10, fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e Granzima B. O uso de padrões predefinidos permite a medição quantitativa de múltiplos analitos a partir de uma única amostra. A aquisição e análise de dados podem ser realizadas usando abordagens de gateamento automatizadas fornecidas por ferramentas de software associadas ao instrumento ou baseadas na web, facilitando o processamento de dados. Em conclusão, o ensaio multiplex apresentado permite a análise multiparamétrica da funcionalidade das células CAR T e pode ser aplicado em contextos como pesquisa, testes de controle de qualidade, estudos mecanísticos e caracterização funcional.

Introduction

A caracterização funcional é essencial nos testes de células T com Receptor Antigênico Quimérico (CAR) pois fornece insights sobre a potência, segurança e mecanismos de ação dessas terapias. Compreender as assinaturas de citocinas e mediadores citotóxicos auxilia na avaliação da eficácia terapêutica e potenciais efeitos adversos, garantindo o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes. Ensaios single-plex tradicionais, como os ensaios imunossorbentes ligados a enzimas (ELISA), têm limitações, como a necessidade de altos volumes de amostra, tempos de processamento longos e execuções separadas para cada analito, oferecendo uma faixa dinâmica limitada dentro de amostras individuais^1,2. Em contraste, ensaios multiplex baseados em bead permitem a detecção simultânea de múltiplos mediadores solúveis, reduzindo o tempo de processamento e as necessidades de amostra, ao mesmo tempo em que aumentam a faixa dinâmica^1,2. Essa eficiência e profundidade de análise tornam os ensaios multiplex ferramentas valiosas para o avanço da pesquisa e desenvolvimento de células T CAR^3,4,5.

O ensaio multiplex apresentado neste estudo utiliza beads de captura, que exibem perfis de fluorescência definidos nos canais de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE) e são revestidos com anticorpos específicos contra analitos solúveis. Durante a incubação com uma amostra, esses beads seletivamente se ligam aos analitos-alvo da solução. Após a captura do analito, anticorpos de detecção são adicionados para formar complexos sandwich específicos do analito. Esses anticorpos são conjugados diretamente à aloficocianina (APC) (detecção direta) ou à biotina (detecção indireta). Para a detecção indireta, é necessária uma incubação subsequente com um anticorpo anti-biotina conjugado a APC (Figura 1). Os complexos resultantes - compostos por beads de captura, analitos e anticorpos de detecção - são analisados por citometria de fluxo para quantificar as concentrações dos analitos. O ensaio multiplex é uma tecnologia baseada em placa, incluindo padrões predefinidos usados para gerar curvas padrão específicas para cada analito^1,2.

Figura 1: Princípio da tecnologia de citocinas e fluxograma do ensaio. O ensaio é baseado em 12 populações de beads de captura codificados por fluorescência, acoplados a anticorpos específicos para analitos. Após a incubação da amostra, complexos bead-analito são formados que podem ser detectados via citometria de fluxo usando anticorpos de detecção específicos. O fluxograma do ensaio inclui 1) a preparação de padrões de analitos e amostras de interesse em uma placa de filtro, 2) incubação com beads de captura, 3) incubação com anticorpos anti-analito marcados com biotina para formar complexos sandwich, 4) incubação com anticorpos anti-biotina marcados com APC, 5) ressuspensão em buffer para medição e 6) aquisição da amostra. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O ensaio multiplex descrito neste estudo é compatível com citômetros de fluxo padrão equipados com um laser azul (por exemplo, 488 nm; canais FITC e PE) e um laser vermelho (por exemplo, 635 nm; canal APC). Como os citômetros de fluxo estão amplamente disponíveis em laboratórios de pesquisa, ambientes clínicos e ambientes de controle de qualidade, essa compatibilidade facilita a implementação sem a necessidade de instrumentação especializada adicional⁵. No contexto de testes de funcionalidade de células T CAR, essa abordagem permite a avaliação multiparamétrica das respostas funcionais dentro dos fluxos de trabalho analíticos comumente disponíveis⁶. O ensaio oferece vantagens significativas para a pesquisa de células T CAR, permitindo a quantificação simultânea de analitos-chave, incluindo GM-CSF, Granzima B, interferon (IFN)-α, interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1), Perforina e fator de necrose tumoral (TNF)-α (painel de citotoxicidade humana). Esses mediadores são críticos para entender a ativação, função efetora e liberação de citocinas relacionadas à segurança das células T CAR^4,5,7,8.

O fluxograma do ensaio inclui opções para gating automatizado e análise de dados usando software associado ao instrumento, bem como ferramentas de análise baseadas na web, independentes do instrumento⁵. Esses recursos apoiam o processamento simplificado dos dados de perfil de moléculas efetoras das células T CAR, reduzindo a extensão da intervenção manual. O uso de análise automatizada pode contribuir para uma melhor consistência no manuseio dos dados e facilitar uma avaliação mais eficiente dos resultados funcionais⁸.

O presente protocolo descreve um método multiplex reproduzível e escalável para o perfil de mediadores imunológicos de células T CAR. Ao medir 12 analitos diferentes em uma única amostra, a abordagem é particularmente relevante para investigações mecanísticas, pesquisa em estágio inicial e estudos concomitantes. Em estágios posteriores da terapia de células T CAR, pode ser benéfico reduzir o número de citocinas medidas, especialmente em um ambiente de controle de qualidade (QC) regulado e sensível ao tempo para testes de liberação de medicamentos. Para esse propósito, 1 a 7 citocinas do painel apresentado podem ser montadas para projetar um ensaio de citocinas personalizado que pode ser validado para análises de células T engenheiradas. Isso torna o protocolo descrito idealmente adequado para diversas aplicações em ambientes de pesquisa e QC, tanto em estágios iniciais quanto finais da terapia de células T CAR^3,4,5,9.

Protocol

Todas as amostras humanas foram coletadas de voluntários anônimos saudáveis após obtenção de consentimento informado por escrito. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e realizados de acordo com as regulamentações éticas e de biossegurança necessárias.

1. Co-cultura de células CAR T

1. Prepare uma cultura celular de células CAR T engenheiradas na ausência e na presença de antígeno cognato, por exemplo, células tumorais apresentadoras de antígeno em uma proporção de 2,5:1 (células efetoras: células alvo).
2. Defina um ou mais pontos de tempo para coleta do sobrenadante para analisar citocinas secretadas uma vez ou a cinética das citocinas ao longo de um período definido, por exemplo, às 4, 8, 16, 24 e 48 h.
   NOTA: Os sobrenadantes podem ser usados diretamente ou podem ser congelados para uso posterior.

2. Preparação do padrão e da amostra

1. Reconstitua o padrão do analito adicionando 200 µL de tampão ou meio de cultura celular ao pellet e misture-o suavemente. Prepare seis tubos reagentes e realize uma série de diluições 1:5 do padrão reconstituído, até 3,2 pg/mL ou 0,6 pg/mL (dependendo do analito) e prepare um em branco.
2. Colete sobrenadantes de co-cultura CAR T, por exemplo, 16 h ou 24 h após a co-cultura. Opcionalmente, colha células CAR T para fenotipagem paralela usando citometria de fluxo.
3. Centrifuge as amostras a 10.000 × g por 10 min a 4 °C. Use os sobrenadantes puros ou dilua-os para se adequarem à faixa da curva padrão.

3. Fluxo de trabalho do ensaio

1. Vortex o mix de grânulos de captura para ressuspendê-lo completamente. Adicione 50 µL do padrão ou amostra, juntamente com 20 µL de grânulos pré-diluídos, aos poços de uma placa de filtro de 96 poços.
2. Incube por 2 h a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave os poços duas vezes com 200 µL de tampão usando um manifold de vácuo ou centrífuga.
3. Adicione 100 µL de reagente de detecção 1 pré-diluído 1:50 (em tampão). Incube por 1 h a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave duas vezes.
4. Adicione 100 µL de reagente de detecção 2 pré-diluído 1:50 (em tampão). Incube por 30 min a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, no escuro. Lave uma vez.
5. Para aquisição, ressuspenda as amostras em 200 µL de tampão. Uma visão geral do fluxo de trabalho do ensaio é mostrada em Figura 1.

4. Aquisição e análise de dados

1. Adquira dados em um citômetro de fluxo equipado com lasers azul e vermelho (os canais PE, FITC e APC são necessários). Ao trabalhar com citômetros de fluxo MACSQuant, use os modelos Express Mode para segmentação totalmente automatizada e análise de dados.
2. Alternativamente, carregue arquivos de dados FSC ou MQD na ferramenta web InspectoR, que realiza medição quantitativa automatizada de citocinas e fornece resultados prontos para exportação independentemente do instrumento usado.
3. Certifique-se de verificar a separação adequada das 12 populações diferentes de grânulos de captura no canal FITC versus PE.
4. Aplique a curva padrão para calcular as concentrações de citocinas e exporte e visualize os resultados.
5. Para aquisição de dados em um citômetro de fluxo MACSQuant, use o código de barras 2D do frasco de grânulos de captura, que contém todas as configurações de aquisição relevantes.
   1. Após fazer login no software, selecione o MACSPlex Filter Plate como o rack de amostras e clique no botão Código de Barras na barra de ferramentas para ativar o leitor de código 2D.
   2. Apresente o frasco ao leitor, garantindo que o código esteja voltado para a luz piscando a uma distância ideal de 0,5–2,5 cm.
   3. Na aba Autolabel, atribua o Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) e o NoLabel. Para as diluições seriais do padrão de células T/NK citotóxicas, defina as posições do grupo e, na aba Configurações, selecione Express Mode com Tipo: Análise e Modo: MACSPlex_Standard, aplicando mistura suave conforme necessário.
   4. Amostras desconhecidas são atribuídas de forma semelhante, com suas posições definidas, agrupamento opcional e seleção de Express Mode, Tipo: Análise e Modo: MACSPlex_Sample na aba Configurações, incluindo IDs e descrições opcionais de amostras.
   5. Verifique se as definições do rack estão corretas na tabela Experimento, garanta níveis de líquido adequados nos poços da placa de filtro e, em seguida, inicie a medição.

Results

Identificação de populações representativas de contagem de contagem codificando para 12 analitos solúveis

As populações de contagem de contagem foram identificadas usando os canais FITC e PE do citômetro de fluxo. Clusters distintos de contagem representando analitos individuais foram claramente resolvidos no gráfico biaxiais, incluindo IL-10, Granzima B, MCP-1, IL-17A, Perforina, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 e GM-CSF (Figura 2). Cada população exibiu uma assinatura de fluorescência única, confirmando a detecção multiplex bem-sucedida e a clara diferenciação dos citocinas e moléculas efetoras medidas.

Figura 2: Detecção de populações representativas de contagem de contagem multiplex. As contagens de contagem contêm intensidades de fluorescência inerentes que podem ser usadas para distinguir as diferentes populações específicas de analitos. O gráfico de dispersão exibe a separação dos sinais específicos de analitos com base na intensidade de fluorescência nos canais FITC (B1) e PE (B2). A imagem mostra um perfil representativo das 12 populações de contagem de contagem codificando para GM-CSF, Granzima B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforina e TNF-α. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Perfil representativo de concentração de citocinas de células T CAR após co-cultura com células tumorais

Após a co-cultura das células T CAR com células-alvo tumorais, as concentrações de citocinas foram quantificadas usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex (Figura 3). As células T CAR secretaram altos níveis de Granzima B (49.950,2 pg/mL), IFN-γ (48.367,8 pg/mL), TNF-α (7.055,2 pg/mL) e GM-CSF (6.653,5 pg/mL), indicando potente ativação e função efetora citotóxica em resposta ao engajamento do tumor. Os níveis de IL-2 excederam o limite superior de detecção (>10.000 pg/mL), consistente com forte sinalização proliferativa. A amostra não foi mais diluída ou re-medida. Em contraste, citocinas associadas a respostas regulatórias ou auxiliares alternativas de células T, incluindo IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e MCP-1, estavam presentes em níveis baixos ou quase indetectáveis. Esses resultados sugerem que as células T CAR montaram uma resposta imune predominantemente tipo 1 (Th1/citotóxico) caracterizada por alta atividade efetora e produção limitada de citocinas imunossupressoras.

Figura 3: Perfil representativo de citocinas de células T CAR após co-cultura com células tumorais. Células T Chimeric Antigen Receptor (CAR) engenheiradas foram co-cultivadas durante a noite com células tumorais JeKo-1. Os sobrenadantes de cultura celular foram colhidos após 16 horas de incubação e centrifugados para remover particulados. As amostras diluídas foram analisadas usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex. Duas curvas padrão foram realizadas e as concentrações de todos os 12 analitos foram determinadas. Um resultado de dados representativo para a análise e cálculo das concentrações específicas de analitos usando o Modo Express do citômetro de fluxo é mostrado. O gráfico de barras e a tabela anexa mostram os níveis calculados (picograma/mililitro) das 12 moléculas efetoras. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cinética de secreção de citocinas de células T CAR após estimulação específica de antígeno

Após a co-cultura das células T CAR com células-alvo expressando (Antigeno⁺) ou não (Antigeno⁻) o antígeno cognato, a secreção de citocinas foi monitorada ao longo do tempo usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex. As células T CAR exibiram liberação rápida e robusta de citocinas após o reconhecimento dos alvos Antigeno⁺, com forte regulação positiva de Granzima B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-2 dentro de 8-24 h, atingindo níveis de pico em 48 h (Figura 4). Este padrão indica potente ativação e função efetora citotóxica após o engajamento do antígeno. Aumentos moderados em IL-6, IL-17A e IL-21 também foram observados, enquanto IL-4, IL-10, MCP-1 e Perforina permaneceram baixos ou moderadamente elevados. Em contraste, co-culturas com alvos Antigeno⁻ mostraram indução mínima de citocinas em todos os analitos (Figura 4). Juntos, esses dados demonstram que a ativação das células T CAR e a produção de citocinas efetoras ocorrem especificamente em resposta ao reconhecimento de antígenos e se intensificam ao longo do tempo.

Figura 4: Cinética de secreção de moléculas efetoras de células T CAR co-cultivadas com células-alvo positivas ou negativas para antígenos​. Células T Chimeric Antigen Receptor (CAR) engenheiradas foram co-cultivadas com células-alvo expressando (Antigeno⁺) ou não (Antigeno⁻) o antígeno cognato das células T CAR por 4, 8, 16, 24 e 48 h. Em cada ponto de tempo, os sobrenadantes de cultura foram coletados e analisados usando o painel de citotoxicidade humana do ensaio multiplex para quantificar um amplo painel de analitos efetores solúveis ao longo do tempo. A cinética de citocinas para 12 analitos é mostrada (picograma/mililitro).

Discussion

O ensaio multiplex foi usado para analisar as respostas dos mediadores imunológicos solúveis em co-culturas de células CAR T. As células CAR T co-cultivadas com células-alvo positivas para antígenos mostraram maior secreção de IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzima B e IL-2, consistente com a ativação efetora e função citotóxica^4,5,8. Em contraste, controles negativos para antígenos exibiram baixa produção de citocinas, demonstrando a capacidade do ensaio de discriminar respostas específicas ao antígeno sob as condições testadas^5,8. Esses resultados apoiam a aplicabilidade do ensaio para avaliar a funcionalidade das células CAR T, incluindo o uso em análises relacionadas à potência, perfil de segurança e investigações mecanísticas.

Embora o painel fixo de 12 analitos forneça uma visão geral da atividade imune das células CAR T, pode não ser prático capturar a gama completa de analitos em todas as aplicações. Para fluxos de trabalho focados, como validação de ensaios ou testes de controle de qualidade (QC) de produtos de células CAR T, o painel pode ser reduzido a um subconjunto (por exemplo, IL-2, IFN-γ e TNF-α) para simplificar a análise, mantendo a sensibilidade funcional^1,2.

Passos críticos no protocolo incluem o design da co-cultura de células CAR T e a seleção apropriada das condições de amostragem. Em particular, a duração da co-cultura e o número de células efetoras (relação E:T) determinam diretamente a magnitude das citocinas e devem ser definidos durante a configuração do ensaio^5,6. Além disso, a diluição da amostra deve ser ajustada para garantir que as concentrações dos analitos estejam dentro da faixa dinâmica do ensaio^1,2. A solução de problemas deve, portanto, focar na verificação do desempenho da curva padrão e no ajuste das condições de co-cultura ou fatores de diluição se os sinais estiverem fora da faixa quantificável^1,2.

Comparado com os ELISAs single-plex tradicionais, a plataforma multiplex baseada em citometria de fluxo gera conjuntos de dados de alta densidade e multi-analíticos a partir de volumes mínimos de amostra. Ao permitir a medição simultânea de múltiplos analitos em uma única amostra, o multiplex pode reduzir o consumo geral de reagentes, aumentar o rendimento das amostras e encurtar o tempo do ensaio em relação à realização de múltiplos ensaios single-plex^1,2. Opções de aquisição automatizada e análise padronizada podem potencialmente reduzir a variabilidade dependente do usuário e apoiar a reprodutibilidade e escalabilidade em ambientes experimentais ou de fabricação^5,8. A sensibilidade típica de detecção ELISA padrão varia de 16 a 2000 pg/mL (pode ser menor para kits de alta sensibilidade)⁷. Dentro da plataforma apresentada neste estudo, as concentrações detectáveis mais baixas variam de 0,05 pg/mL para os analitos mais sensíveis a aproximadamente 93,8 pg/mL para aqueles com sensibilidade de ensaio inerentemente mais baixa. Em avaliações internas, mais de 74% dos analitos medidos exibiram limites de detecção abaixo de 5 pg/mL, e 38% foram detectáveis abaixo de 1 pg/mL, ressaltando a sensibilidade geral do sistema. Como a sensibilidade multiplex pode variar por citocina, a potencial competição de epítopos permanece uma consideração importante. Para minimizar tal interferência, o ensaio emprega epítopos não sobrepostos para captura e detecção de cada analito, reduzindo assim o viés relacionado à competição e melhorando a confiabilidade da medição em condições multiplexadas.

O desempenho do ensaio multiplex pode variar entre analitos dependendo da sensibilidade do ensaio e do contexto biológico, e sob certas condições, as concentrações dos analitos podem se aproximar do limite superior de detecção e, portanto, devem ser avaliadas durante a configuração do ensaio. Por outro lado, alguns analitos (por exemplo, MCP-1 e IL-4 neste estudo) podem permanecer indetectáveis dependendo das condições experimentais. Além disso, fatores pré-analíticos, como o manuseio da amostra, podem influenciar as medições de citocinas, e condições de processamento consistentes devem ser mantidas para garantir a comparabilidade.

No geral, esta abordagem multiplex permite a caracterização eficiente e quantitativa da funcionalidade das células CAR T. Em relação à maioria das plataformas de detecção de citocinas multiplex existentes, o ensaio é compatível com citômetros de fluxo padrão e inclui uma ferramenta de software associada ao instrumento que facilita a aquisição e análise de dados. Embora a detecção multiplex de citocinas tenha sido usada em outros cenários imunológicos, o presente trabalho demonstra sua aplicação ao perfil funcional das células CAR T dentro de um fluxo de trabalho padronizado. O formato baseado em beads permite a detecção simultânea de múltiplos analitos, apoiando um rendimento mais alto em comparação com métodos single-plex. Potenciais aplicações incluem a avaliação funcional do produto farmacêutico, como avaliação do ligante CAR, otimização do vetor e desenvolvimento de processos. A escalabilidade do ensaio e as capacidades de análise automatizada também apoiam testes de potência, perfil de segurança e estudos mecanísticos visando entender o comportamento e a funcionalidade das células CAR T^5,7,8.

Embora os perfis de secreção de citocinas forneçam insights valiosos sobre a ativação e potência funcional das células CAR T in vitro, eles não podem replicar completamente a biologia complexa que determina a eficácia terapêutica em pacientes. Fatores como o microambiente tumoral, densidade de antígenos, regulação imunológica e persistência in vivo influenciam o desempenho das células CAR T além do que pode ser medido em ensaios controlados^6,8,10. No entanto, estabelecer ensaios funcionais robustos e padronizados, como o perfil multiplex de citocinas, representa um passo importante para a caracterização funcional do produto farmacêutico^3,4. Os padrões de citocinas não são apenas indicativos da atividade das células CAR T, mas também estão intimamente associados a fenômenos de toxicidade, incluindo o síndrome de liberação de citocinas (CRS) e o síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)^3,6,7. Atualmente, a variabilidade nos métodos de medição e nos limites de relatórios dificulta a comparabilidade entre ensaios, destacando a necessidade de um perfil de mediadores imunológicos padron

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Ensaio multiplex de citocinas baseado em bead para citometria de fluxo
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Ferramenta baseada na web para gateway e análise automatizada de dados MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados multiplex
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados multiplex
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Software para gateway e análise automatizada
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Meio de cultura celular sem soro otimizado desenvolvido para o cultivo e expansão de células T humanas e de rato