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Artigo de método

Análises Morfométricas de Forma: A Caixa de Ferramentas de Software de Análise para Quantificação de Formas Craniofaciais em Peixe-Zebra

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DOI:

10.3791/70345

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27 de fevereiro de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar a forma da cartilagem craniofacial usando software livre (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) para medir mudanças na estrutura facial em larvas de peixe-zebra.

Resumo

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto variado de deficiências físicas, cognitivas e comportamentais causadas pela exposição pré-natal ao etanol, incluindo aquelas que afetam o esqueleto facial. Loci genéticos sensíveis ao etanol contribuem para esse alto grau de variação na FASD, o que complica as análises do formato facial. Já demonstramos anteriormente que podemos analisar essas mudanças no formato facial devido às interações gene-etanol em peixes-zebra. Peixes-zebra são um modelo ideal para analisar essa variação por vários motivos; (i) 70% dos genes são ortólogos entre humanos e peixes-zebra; (ii) a fertilização externa permite que os pesquisadores controlem o momento e a dosagem dos tratamentos com etanol; (iii) a estrutura do esqueleto facial é conservada com vertebrados; (iv) Larvas translúcidas permitem a visualização direta das mudanças na estrutura esquelética craniofacial durante o desenvolvimento. No entanto, analisar a forma do esqueleto craniofacial pode ser difícil de avaliar completamente por meio de medidas lineares simples, pois elas não capturam mudanças gerais de forma. Além disso, mudanças no tamanho da cabeça podem complicar a interpretação dos dados. Para resolver isso, adotamos uma abordagem morfométrica, analisando o formato geral do rosto por meio de análises de componentes principais via software gratuito, tpsDigs2, MorphoJ e PAST. A combinação desse software permite a comparação par a par da morfologia facial geral. Aqui, delineamos nossa abordagem e análise do formato facial em mutantes peixe-zebra tratados com etanol, utilizando esses programas para conduzir uma série de análises estatísticas multivariadas complementares.

Introdução

Os Transtornos do Espectro Alcoólico Fetal (TEAF) são caracterizados por uma ampla gama de defeitos do desenvolvimento, incluindo comportamentais, neurológicos efísicos 1,2. Incluídos nesses defeitos físicos estão defeitos craniofaciais, como hipoplasia maxilar 3,4,5,6. Embora o momento e a dosagem da exposição ao etanol contribuam para a complexa etiologia do FASD, a contribuição genética desempenha um papel significativo na etiologia doFASD 6,7,8,9,10,11,12. Essa combinação de fatores torna o estudo de defeitos faciais em coortes humanas desafiador. Para estudar o impacto da exposição pré-natal ao etanol no desenvolvimento, usamos o modelo do peixe-zebra. Os peixes-zebra servem como um forte modelo para o TEAF, pois compartilham 70% dos ortólogos gênicos com humanos, 82% dos genes conhecidos como causadoresde doenças 13,14,15,16. Além da conservação genética, peixes-zebra: (i) possuem alta fecundidade, permitindo a produção de várias larvas de peixe-zebra ao mesmo tempo, (ii) passam por fertilização externa, o que possibilita o estudo direto dos processos de desenvolvimento sensíveis ao etanol, (iii) possuem desenvolvimento craniofacial vertebrado altamente conservado e estereotipado, e (iv) são embriões/larvas translúcidas, permitindo visualização de estruturasesqueléticas 17. Já demonstramos anteriormente que mutações em muitos genes diferentes de peixe-zebra sensibilizam embriões a defeitos faciais induzidos pelo etanol, e esses defeitos podem ser sutis e difíceis de identificar a olho10,18. Além disso, observamos que larvas selvagens tratadas com etanol também apresentam pequenas alterações na região craniofacial em comparação com larvas selvagens não tratadas, embora novamente essas alterações sejam difíceis de identificar aolho 10. Embora essas mudanças passem despercebidas na observação visual, conseguimos mostrar essas mudanças no formato facial induzidas pelo etanol usando análises morfométricas disponíveis em imagens 2D do viscerocráneo10.

A face é uma estrutura 3D complexa que é difícil de medir usando medições lineares convencionais. Essas medidas lineares simples não levam em conta a posição relativa de cada estrutura medida e seu impacto nas outras estruturas medidas da face. Análises morfométricas abordam essas limitações usando configurações de forma por meio de marcos que consideram a posição relativa de todas as estruturas medidas, controlando até mesmo diferenças gerais de tamanho18, 19 e 20. Essa abordagem resulta em dados mais precisos, com maior resolução e muito mais fáceis de visualizar, o que pode gerar resultados que talvez não sejam observados usando medições linearesconvencionais 18,19,20. Além disso, abordagens morfométricas podem fazer comparações diretas entre e dentro de grupos usando métodos estatísticos multivariados. Aqui descrevemos o uso do software morfométrico gratuito tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 e Paleontological Statistics (PAST)22, em combinação com imagens 2D do viscerocânio em heterozigotas de tipo selvagem e larvas não tratadas e tratadas com etanol para o gene da Proteína Morfogenética Óssea (Bmp) bmp7a. Embora esses programas tenham sido utilizados principalmente em campos focados em paleontologia e ecologia, quando usados em conjunto, eles fornecem uma análise detalhada do formato facial. Por fim, neste protocolo, mostramos como usar esses aplicativos de software gratuitos para quantificar mudanças de forma da cartilagem craniofacial no modelo do peixe-zebra.

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Protocolo

Todas as larvas de peixe-zebra usadas neste procedimento foram criadas e reproduzidas seguindo protocolos estabelecidos da IACUC aprovados pela Universidade deLouisville 23.

NOTA: A cepa de peixe-zebra bmp7aty68a24 e irmãos do tipo selvagem (todos no fundo AB) foram usados neste estudo, com peixes adultos mantidos em 28,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14/10 horas. Use as linhas apropriadas conforme os resultados experimentais desejados. Use água que foi esterilizada por osmose reversa. O sexo como variável biológica não se aplica aos estágios de desenvolvimento estudados, já que o sexo é detectável pela primeira vez em peixes-zebra cerca de 20-25 dias após a fertilização (dpf)25, após todas as análises.

1. Tratamento com etanol

  1. Colete óvulos de cruzamentos heterozigóticos e faça estágio morfologico dos embriões conformedescrito 23.
  2. Separe os embriões em grupos de amostras de 100 e crie a 28,5 °C até os pontos de desenvolvimento desejados. Incubar todos os grupos em meio embrionário (EM)10,18.
  3. Às 6 horas após a fertilização (HPF), troque a EM para EM fresca ou EM contendo 1% de etanol (v/v). A 24 hpf, lave EM contendo etanol com três mudanças frescas deEM 10,18.

2. Manchas faciais e imagem

  1. Fixe as larvas de peixe-zebra em 5 dpf e colore com Alcian Blue, marcando a cartilagem (Figura 1) conforme descritoanteriormente 26.
  2. Veja imagens de montagem inteira, vista ventral, campo claro do viscerocânio, montando larvas conforme descritoanteriormente 27.
  3. Resumidamente, monte peixes, superfície ventral para cima, na solução de glicerol 50% do final da coloração Alcian Blue.
    NOTA: As configurações dos microscópios compostos podem variar; Use configurações apropriadas às estruturas de imagem desejadas. Um microscópio composto Olympus BX53 foi usado neste estudo para gerar todas as imagens analisadas. As imagens foram tiradas com ampliação de 10x.

3. Genótipagem

  1. Remova as caudas de 5 larvas de dpf após a coloração da cartilagem azul Alcian conforme descritoanteriormente 18.
  2. Separe as cabeças e caudas das larvas. Mantenha as cabeças em armazenamento de 50% de glicerol para exames de imagem posteriores.
  3. Líse caudas com 5 μL de Proteinase K (10 mg/mL) para extrair gDNA.
  4. Realize PCR no gDNA de cada amostra usando espolvadores direcionados ao gene de interesse para amplificar regiões contendo o SNP.
  5. Digere o produto PCR usando digestão de DNA baseada em endonuclease de restrição para diferenciar alelos mutantes de selvagens com base no SNP e identificar o SNP. Divida as amostras por genótipo em grupos agrupados e imagine para análise.
    NOTA: Para este trabalho, o SNP foi amplificado em bmp7a e genotipado usando BslI (NEB).

4. Software usado para análises de formas

  1. Use tpsUtil e tpsDig221, e MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) para análise morfométrica de larvas coloridas com alciano, e o software MorphoJ e Paleontological Statistics Package for Education and Data Analysis (https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/) 22 para todas as análises estatísticas.
    NOTA: O software tpsUtil pode ser encontrado no link "Programas utilitários", o software tpsDig2 pode ser encontrado no link "aquisição de dados" e o MorphoJ pode ser encontrado no link "Programas abrangentes" no https://sbmorphometrics.org. A solução de problemas para cada software pode ser facilmente encontrada tanto gratuitamente online, em múltiplas plataformas quanto dentro do próprio software. A Análise de Componentes Principais (PCA), a Análise de Variações Canônicas (CVA), a ANOVA de Procrustes e gráficos wireframe da variação facial foram gerados usando MorphoJ, e um teste multivariado de normalidade e uma análise multivariada de variância (MANOVA) foram realizados usando PAST.

5. Imagear consistentemente o esqueleto facial para todas as amostras a serem analisadas

  1. Certifique-se de que as imagens do esqueleto facial sejam tiradas com configurações idênticas de microscópio e salvas como arquivos .tif.
    NOTA: As configurações do microscópio variam dependendo da configuração e funcionalidade do microscópio e das amostras/tecidos a serem fotografados. O segredo é um ajuste consistente de microscópio e preparação da amostra.
  2. Salve arquivos em uma única pasta rotulada para identificar completamente o experimento.

6. Preparação de imagens com o software tps

  1. Abra o bloco de notas e selecione Salvar como. A partir daqui, clique em todos os arquivos na parte inferior. Salve o arquivo como "experiment-name.tps" e salve-o na pasta que contém todas as imagens a serem analisadas.

7. Inserir imagens no software tps

  1. Abra o software tpsUtil. Em seguida, puxe Operação para baixo e selecione o arquivo Build tps na aba de imagens .
  2. A partir desta aba, clique em input e abra o arquivo contendo as imagens. Clique na primeira imagem do arquivo e selecione Abrir.
  3. Selecione a aba de saída , seguida pelo arquivo do bloco de notas tps, e salve. Quando solicitado a substituir o arquivo, selecione sim.
  4. Em seguida, clique na aba de configurar e crie. Vá ao arquivo para ver se as imagens foram adicionadas.

8. Adicionar pontos de referência às imagens

  1. Abra tpsDigs2 e abra as seguintes abas em ordem: Entrada fonte, arquivo, depois o arquivo salvo do TPS Notepad.
  2. Em seguida, clique nas opções para visualizar a opção Ferramentas de Imagem . Aqui, certifique-se de definir o comprimento de referência para 100 μm. Pressione definir escala.
    NOTA: Não escale em relação à escala da imagem.
  3. Ao definir a escala, pressione ok para definir parâmetros e depois saia das ferramentas de imagem.
  4. Neste ponto, adicione pontos de referência a cada imagem para análise morfologica correta clicando no símbolo de mira.
  5. Garanta que os pontos de referência estejam posicionados na mesma ordem para cada imagem. Marcos foram colocados nas seguintes articulações entre os elementos da cartilagem (Veja a Figura 1E, E'):
    1. Articulação média entre as cartilagens de Meckel (Marco #1, Figura 1E, E').
    2. As articulações bilaterais entre as cartilagens de Meckel e palatoquadradas (Pontos de referência #2, Figuras 1E, E').
    3. Articulação da linha média entre as cartilagens cerato-hiais (Marco #3, Figura 1E, E').
    4. As articulações bilaterais entre as cartilagens palatoquadrada e cerato-hial (Pontos de referência #4, Figuras 1E, E').
    5. A extremidade distal das cartilagens hiomandibulares (Marcos #5, Figura 1E, E').
  6. Após colocar pontos de referência em uma imagem, clique em arquivos no menu suspenso. Siga esse caminho para salvar os dados e depois sobrescreva.
  7. Saia de tpsDigs2.

9. Uso do MorphoJ para analisar a forma por Procrustes ANOVA

  1. Abra o software MorphoJ.
  2. Em preliminares, crie e nomeie o conjunto de dados. Selecione criar novo conjunto de dados e nomeie o conjunto de dados. Depois, clique em tps e selecione o bloco de notas com os novos pontos de dados adicionados do passo 8.4. Crie o conjunto de dados.
  3. As imagens estão prontas para serem vistas estatisticamente usando o ajuste de Procrustes. Selecione a aba de leitura da árvore de projeto e clique no conjunto de dados. Selecione os seguintes botões neste caminho: preliminares, novo ajuste de Procrustes, Alinhar por eixos principais e Executar ajuste de Procrustes.
  4. Selecione gerar matriz de covariância sob preliminares; o software vai dizer coordenadas de Procruste. Execute a função quando solicitado.
  5. Selecione criar ou editar wireframe em preliminares e vincule os pontos nas imagens. Depois, selecione pontos de link e aceite ou crie a imagem. Editar classificadores.
  6. Abra uma planilha enquanto mantém o MorphoJ aberto. Adicione todas as informações necessárias, por exemplo: Genótipo, Tratamento, Genótipo e Tratamento, Experimento, etc. Salve a planilha como um arquivo CSV.
  7. No MorphoJ, clique em arquivo e importe variáveis do classificador para selecionar o arquivo CSV. Depois de abrir o arquivo, volte para a árvore de projetos e clique no conjunto de dados.
  8. Uma vez que o conjunto de dados seja aberto, clique em preliminares e edite classificadores. Isso garantirá que todas as imagens sejam adicionadas.
  9. Em seguida, clique em árvore de projetos, Covmatrix e depois em Variação no topo.
  10. Selecione Análise de Componentes Principais para ver as pontuações do PC. Clique em pontuações no PC para ver o gráfico gerado.
  11. Para adicionar cores ao gráfico, clique com o botão direito e pressione a elipse de confiança para adicionar o classificador desejado. Pressione pontos de dados de cor para adicionar as cores, e ok para aceitar essas mudanças.
    NOTA: Uma vez que a aba de pontuação do PC seja fechada e reaberta seguindo as instruções do passo 9.10, as cores devem ser atualizadas.
  12. Para mudar as cores do wireframe, vá em Preliminares. Clique em definir opções para o gráfico de formas, localizado na parte inferior da tela. Selecione gráficos wireframe para mudar as cores da forma alvo, da forma inicial e dos números.
  13. Selecione Variação, depois Procrustes ANOVA.
  14. Exporte os resultados da ANOVA Procrustes para o arquivo da planilha a partir do passo 9.7.

10. Análise de variações canônicas do conjunto de dados

  1. No MorphoJ, selecione o conjunto de dados ou projeto original. Para iniciar a Análise Variada Canônica (AVC), selecione Comparação seguida por Análise Variada Canônica. Selecione a(s) variável(ões) classificador(es) - selecione Genótipo & Tratamento e execute a função.
  2. Para exportar CVA, clique na aba de resultados e clique com o botão direito na página de resultados agora aberta. Selecione Exportar para Arquivo e salve as informações.
  3. Clique em Árvore de Projetos e selecione CVA, depois Pontuações. No canto superior esquerdo da página, selecione Arquivo. Depois que a aba Arquivo for aberta, escolha Exportar Conjunto de Dados e selecione o tipo de dado e Genótipo & Tratamento. Salve as pontuações CVA como um arquivo .txt.
  4. Para preparar o arquivo para o software PAST, abra as pontuações CVA salvas no Notepad ou em um software equivalente. Mude o ID no canto superior esquerdo para Rótulo para não confundir o software PASSADO. Salve as pontuações CVA editadas ou equivalente.

11. MANOVA em softwares PASSADOS

  1. Para importar as pontuações CVA no PAST, selecione Arquivo, depois Abrir para acessar as pontuações CVA salvas no Notepad ou equivalente. Quando a janela Importar arquivo de texto abrir, selecione Nomes, Dados para linha e coluna, e tab para um separador. Selecione Importar.
  2. Na aba Mostrar , selecione Atributos da Coluna. Ao lado do botão Type , abra o menu suspenso e selecione Group para a primeira coluna que deve conter a(s) variável(ões) classificador(es).
  3. Destaque os dados do PC ou do CV. Selecione Multivariado, Testes e Normalidade Multivariada para rodar o teste de normalidade. Execute esse teste no PC e no CV separadamente.
  4. Clique na célula cinza vazia no canto superior esquerdo, acima do tipo, para selecionar todo o conjunto de dados. Selecione Multivariado, Testes e MANOVA para processar o MANOVA. Exporte os resultados do MANOVA para o arquivo da planilha a partir da etapa 9.7.
    NOTA: Tanto os resultados Resumo quanto os Dois serão fornecidos pelo software. Exporte ou salve ambos.

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Resultados

Para identificar mudanças de forma facial induzidas por etanol em peixes-zebra, combinamos aplicativos de software disponíveis gratuitamente para gerar e quantificar dados morfológicos do esqueleto facial. Embriões de peixes portadores adultos heterozigotos de bmp7a foram gerados e tratados com etanol de 6 a 24 hpf. As larvas desses cruzamentos foram fixadas em 5 dpf, e as cartilagens faciais foram tingidas com Alcian Blue. Imagens do viscerocânio foram feitas para cada larva de...

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Discussão

O TEAF é caracterizado por uma ampla gama de defeitos de desenvolvimento, incluindo defeitos craniofaciais como hipoplasia maxilar. O peixe-zebra é um modelo forte para o TEAF devido à sua conservação genética com humanos, alta fecundidade, larvas translúcidas e fertilização externa. Os peixes-zebra têm sido usados há décadas para estudar tanto a formação do esqueleto craniofacial quanto o impacto do etanol no desenvolvimento 6,1...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por uma bolsa do National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R01AA031043 à C.B.L.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJhttps://sbmorphometrics.orgSoftware Freeware - pode exigir permissões administrativas para download
PASSADOhttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/Software Freeware - pode exigir permissões administrativas para download
Microscópio composto de campo claroOlympusBX53

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