$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Não foi necessária aprovação ética para este estudo, pois não envolveu participantes humanos nem amostras clínicas. Todos os procedimentos envolvendo linhagens celulares foram conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais de biossegurança. A linha celular epitelial da próstata usada neste estudo foi obtida de um fornecedor comercial certificado.
NOTA: Todos os reagentes, instrumentos e softwares usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. O fluxograma deste estudo é apresentado na Figura 1.
1. Triagem de ingredientes ativos
- Acesse o banco de dados TCMSP.
- Selecione "Nome da erva" na caixa de busca, digite "Huangbo" e clique em "Pesquisar".
- Clique no filtro "OB", defina "≥30" e aplique.
- Clique no filtro "DL", defina "≥0.18" e aplique.
- Copie os resultados filtrados para uma planilha do Excel.
- Aplique o mesmo método de triagem para obter os ingredientes ativos do "Cangzhu".
- Remova os ingredientes ativos duplicados importando todos os conjuntos de dados para o Microsoft Excel (versão 2019) e mesclar as listas compostas no formato Excel.
- Remova ingredientes ativos duplicados padronizando nomes de compostos e identificando entradas idênticas. Quando múltiplos registros correspondiam ao mesmo composto, apenas uma entrada representativa era mantida.
- Estabeleça associações entre "Huangbo", "Cangzhu" e ingredientes ativos.
2. Obter os alvos correspondentes aos ingredientes ativos
- Acesse o banco de dados TCMSP.
- Selecione "Nome do produto químico" na caixa de busca, insira os ingredientes ativos e clique em "Pesquisar".
- Copie o nome do Alvo correspondente a cada ingrediente ativo.
- Remova nomes duplicados dos Alvos e estabeleça associações entre os ingredientes ativos e os nomes dos Alvos.
- Acesse o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/)18, recupere os símbolos oficiais de genes para cada nome de Alvo e os substitua sistematicamente.
3. Aquisição de alvos de doenças
- Acesse o banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org)19.
- Digite "Prostatite" no campo de busca e pressione o ícone de busca para obter a lista de genes relevante.
- Ordene os genes em ordem decrescente pela pontuação de Relevância.
- Exporte os genes relevantes no formato Excel.
- Alvos com Pontuação ≥1 foram selecionados como alvos relacionados à prostatite.
4. Preparação para a construção de uma rede reguladora de medicamento-ingrediente ativo-alvo de doença
- Obtenha a interseção entre os alvos relacionados aos ingredientes ativos e os alvos relacionados à prostatite, e defina-os como os alvos do EMP para tratar a prostatite.
- Estabeleça a associação entre os princípios ativos e os alvos terapêuticos do EMP para prostatite.
- Crie um arquivo Excel chamado "Network" com as três primeiras colunas chamadas "Node1", "Node2" e "Net".
- Cole as associações entre EMP e o medicamento nas colunas "Node1" e "Node2", enquanto digita "droga" na coluna "Net" para todas as linhas.
- Cole as associações entre o ingrediente ativo e o medicamento nas colunas "Node1" e "Node2", enquanto digita "ingrediente" na coluna "Net" para todas as linhas.
- Preencha as colunas "Node1" e "Node2" com as associações de ingrediente ativo-alvo para alvos de EMP no tratamento da prostatite, com "alvo" inserido na coluna "Net".
- Cole os alvos terapêuticos do EMP para prostatite na coluna "Node1", enquanto insira "prostatite" na coluna "Node2" e "disease" na coluna "Net" para todas as linhas.
- Salve o arquivo Excel "Network" como um arquivo no formato txt.
- Crie um arquivo Excel chamado "Type" com as duas primeiras colunas chamadas "Node" e "Type".
- Preencha a coluna "Node" com "EMP", com "fórmula" inserida na coluna "Type".
- Insira "Huangbo" e "Cangzhu" na coluna "Node"; insira "droga" na coluna "Tipo" para todas as linhas.
- Insira ingredientes ativos na coluna "Node", enquanto digite "ingrediente" na coluna "Tipo" para todas as linhas correspondentes.
- Preencha a coluna "Node" com os alvos terapêuticos do EMP para prostatite, com "alvo" inserido na coluna "Tipo".
- Insira os alvos relacionados à prostatite na coluna "Nó", enquanto insira "doença" na coluna "Tipo" para todas as linhas correspondentes.
- Salve o arquivo Excel "Type" como um arquivo de formato .txt.
5. Visualização da rede regulatória "Medicamento-Ingrediente Ativo-Alvo-Doença" pelo Cytoscape
- Inicie o Cytoscape.
- Vá em "Arquivo > importar > rede do Sistema de Arquivos" e abra o arquivo "network.txt".
- Abra o painel "Estilo". Selecione "Formato", escolha "Tipo" no menu suspenso "Coluna" e defina "Tipo de Mapeamento" como "Mapeamento Discreto".
- Atribua formatos distintos de nós às seguintes categorias: fórmula, medicamento, ingrediente, alvo, doença.
- Selecione "Cor de Preenchimento", escolha "Tipo" no menu suspenso "Coluna" e defina "Mapping Type" como "Discrete Mapping".
- Atribua cores distintas dos nós às seguintes categorias: fórmula, medicamento, ingrediente, alvo, doença.
- Selecione "Altura" e "Largura", escolha "Tipo" no menu suspenso "Coluna" e defina "Tipo de Mapeamento" como "Mapeamento Discreto".
- Atribua tamanhos distintos de gântulos às seguintes categorias: fórmula, medicamento, ingrediente, alvo, doença.
- Selecione "Tamanho da Fonte do Rótulo", escolha "Tipo" no menu suspenso "Coluna" e defina "Tipo de Mapeamento" como "Mapeamento Discreto".
- Atribua tamanhos distintos de fonte de etiqueta para as seguintes categorias: fórmula, medicamento, ingrediente, alvo, doença.
- Reposicione manualmente os nós para otimizar o layout da rede.
- Vá em "Arquivo > exportar > imagem de rede para arquivo" e salve a rede como uma imagem.
6. Análise e visualização de redes PPI
- Acesse https://cn.string-db.org/ e vá ao módulo "Múltiplas Proteínas".
- Insira a lista de genes alvo na caixa de busca, selecione "Homo sapiens" como organismo e clique em "Buscar".
- Após o carregamento dos resultados, clique em "Continuar".
- Abra o painel "Configurações", defina "pontuação mínima de interação necessária" para "alta confiança (0,700)" e marque "ocultar nós desconectados na rede".
- Clique em "Atualizare" e depois exporte os dados de associação PPI no formato TSV via menu "Exportar".
- Inicie o Cytoscape, navegue até o menu Arquivos e selecione "Importar Rede do Sistema de Arquivos" para abrir seu arquivo TSV.
- Navegue até o menu "Ferramentas" e selecione "NetworkAnalyzer > Análise de Rede > Interpretação de Rede > Tratar a rede como não direcionada".
- Navegue até o menu "Arquivo", selecione o sistema "Exportar Tabela para o arquivo" e exporte os dados da rede.
- Navegue até o painel "Estilo" e configure os atributos "Forma", "Cor de Preenchimento", "Altura" e "Largura".
- Ajuste o layout da rede PPI reposicionando os nós.
- Navegue até o menu "Arquivo", selecione "Exportar Imagem de Rede para Arquivo" e exporte a rede visualizada como uma imagem.
- Abra os dados exportados da rede PPI com WPS e ordene decrescentemente pela coluna "Degree".
- Selecione os 20 melhores alvos ordenados, gere um gráfico de barras e salve o gráfico como uma imagem.
7. Análise de enriquecimento de vias KEGG
- Abra um terminal ou prompt de comando, digite R e pressione Enter.
- No console R, execute os seguintes comandos um a um:
install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
- Converter os símbolos genéticos dos alvos do EMP para tratar prostatite em IDs Entrez usando org. Hs.eg.db.
- Leia os IDs Entrez e realize a análise de enriquecimento KEGG usando o pacote clusterProfiler com parâmetros: organism = "has", pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
- Após remover as vias humanas relacionadas a doenças e metabolismo dos resultados obtidos da análise de enriquecimento KEGG, separe as vias restantes de acordo com a contagem de genes enriquecidos.
- Estabeleça a associação entre as 15 vias de sinalização mais bem classificadas e os alvos.
- Prepare um arquivo de duas colunas com associações "pathway" e "target", e então importe-o para o Cytoscape via "File > Import > Network from File".
- Defina formas e cores dos nós para distinguir caminhos de alvos usando o painel "Estilo".
- Ajuste o layout manualmente e exporte a rede como uma imagem.
8. Preparação farmacêutica
NOTA: A formulação EMP é composta por 15 g de Córtex de Phellodendri Chinensis (Huangbo) e 15 g de Rizoma Atractylodis (Cangzhu). O método de extração de água e precipitação de álcool foi empregado para obter o extrato para experimentos celularessubsequentes 20.
- Imerga o medicamento em uma massa de água dez vezes maior por 1 hora.
- Decocte por 1 hora, depois filtre através da gaze para obter a decocção.
- Adicione uma massa 10 vezes mais água ao medicamento, descocte por 30 minutos e filtre através da gaze para obter a decocção.
- Adicione uma massa de água 10 vezes mais uma vez ao medicamento, descoque por 30 minutos e filtre através da gaze para obter a decocção.
- Combine as três decocções filtradas e depois filtre a mistura através de papel filtrante.
- Concentre a decocção sob pressão reduzida até 10% do volume original.
- Resfrie o concentrado, adicione etanol lentamente a 75% com a mexer, seguido de vedação e armazenamento a 4 °C por 12 horas.
- Centrifuge a mistura e colete o sobrenadante.
- Continue com a destilação sob pressão reduzida.
- Por fim, liofilize o produto usando um liofilizador a vácuo.
NOTA: O pó liofilizado pode ser armazenado a –20ºC por até 3 meses, o que serve como um ponto seguro de pausa. Para recomeçar, reconstitua o pó em um solvente apropriado conforme necessário.
9. Descongelamento e cultura celular
NOTA: As células compradas foram entregues ao laboratório em gelo seco. Antes do início do experimento, o Meio Livre de Soro de Queratinócitos (K-SFM) foi preparado antecipadamente, suplementando-o com fator de crescimento epidérmico recombinante humano (rEGF) até uma concentração final de 5 ng/mL, extrato da hipófise bovina até uma concentração final de 50 μg/mL e 1% de Penicilina-Estreptomicina.
- Ative o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C.
- Remova as células do gelo seco e agite-as imediatamente no banho-maria até que descongelem completamente.
- Adicione 5 mL de K-SFM às células. Misture suavemente e depois centrifuge a mistura (4 °C, 500 × g, 5 min).
- Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet em K-SFM completo.
- Transfira as células para um frasco T-25 e coloque-as em uma incubadora de cultura celular.
NOTA: Os parâmetros ambientais da incubadora de culturas celulares foram mantidos em 37 °C, 5% de CO₂ e ≥ 95% de umidade relativa.
10. Subcultura celular
NOTA: A subcultura foi realizada quando as células atingiram 80–90% de confluência, com uma proporção de subcultura de 1:2 a 1:3.
- Aspire o supernadante do meio de cultura, seguido por duas lavagens das células com PBS sem cálcio e magnésio.
- Introduza 2 mL de tripsina-EDTA e deixe as células descansarem por 3 minutos para dissociação enzimática.
ATENÇÃO: Este protocolo envolve o uso de reagentes perigosos, incluindo lipopolissacarídeos (LPS), clorofórmio, etanol e reagente TRIzol. Todos os procedimentos envolvendo produtos químicos perigosos devem ser realizados em uma coifa química certificada, enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas e proteção ocular). Os materiais biológicos devem ser manuseados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
- Adicione um K-SFM suplementado com 10% de soro fetal bovino para interromper a digestão.
- Transfira a mistura da célula para um tubo centrífugo de 15 mL, centrifuge (4 °C, 500 × g, 5 min) e remova o sobrenadante.
- A pastilha celular foi ressuspensa em K-SFM completo e posteriormente transferida para novos frascos de cultura.
11. Determinação da concentração máxima de tratamento medicamentoso via ensaio MTS
NOTA: Cada concentração de medicamento foi testada com 5 réplicas técnicas.
- Digere as células RWPE-1 na fase de crescimento logarítmico.
- Resuspenda as células em meio completo de K-SFM e depois determine a concentração celular contando.
- Ajuste a suspensão das células para uma densidade de 1 × 105 células/mL com meio K-SFM completo.
- Dispense a suspensão da célula em uma placa de 96 poços com 100 μL por poço.
- A placa de 96 poços foi colocada em uma incubadora de cultura celular para cultivo.
- Após 24 horas, uma vez que as células aderiam completamente, o meio de cultivo era aspirado e descartado.
- Substitua o meio por meio completo de K-SFM contendo diferentes concentrações de solução de EMP.
- Coloque a placa de volta na incubadora de cultura celular para mais 24 horas de incubação.
- Aspire o meio, depois enxágue as células duas vezes usando PBS.
- Adicione 100 μL de meio K-SFM completo a cada poço e incube a placa na incubadora de culturas celulares por mais 4 horas.
- Dispense 10 μL de solução MTS em cada poço e determine a OD em 490 nm após uma incubação de 1 hora.
- Usando o grupo controle em branco (células cultivadas em meio completo sem estimulação LPS ou tratamento medicamentoso) como linha de base, a proliferação celular sob cada concentração de tratamento foi calculada.
NOTA: A maior concentração, sem efeito significativo na proliferação celular, foi definida como o tratamento em alta dose, seguida por sua metade da concentração como o tratamento de dose média e uma quarta de concentração como o tratamento de baixa dose.
12. Intervenção celular
- Digere as células RWPE-1 na fase de crescimento logarítmico.
- As células foram ressuspensas em meio completo de K-SFM, e a concentração celular foi determinada por contagem celular.
- A suspensão das células foi ajustada para uma densidade de 5 × 105 células/mL usando meio completo K-SFM.
- A suspensão da célula foi semeada em uma placa de 6 poços com 2 mL por poço.
- A placa foi colocada em uma incubadora de cultura e incubada por 12 horas para permitir a adesão celular.
- As células foram tratadas com concentrações de EMP baixas (150 μg/mL), médias (300 μg/mL) e altas doses (600 μg/mL), respectivamente.
- Após 1 hora, uma solução de LPS de 10 μg/mL foi adicionada ao meio de cultura.
- Após 24 horas de tratamento, o sobrenadante foi coletado para ELISA, e as células foram coletadas para análise RT-PCR.
NOTA: O LPS foi selecionado para induzir uma resposta inflamatória devido à sua capacidade bem estabelecida de ativar vias de sinalização pró-inflamatória em células epiteliais da próstata; a concentração (10 μg/mL) foi escolhida com base em estudos anteriores que demonstraram indução robusta de citocinas.
13. Isolamento do RNA total
NOTA: Para evitar a degradação do RNA, luvas e máscaras foram usadas durante todo o procedimento experimental, e pontas de pipeta e tubos centrífugas sem RNase foram utilizadas.
- Após a intervenção, enxágue as células duas vezes com PBS.
- Adicione 1 mL de reagente Trizol às células e misture repetidamente com uma pipeta para garantir a homogeneização.
ATENÇÃO: Realizar todos os procedimentos em uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado.
- Transfira o lisado para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL e deixe-o incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Em seguida, adicione 0,2 mL de clorofórmio e faça vórtice vigorosamente na amostra.
- Depois de deixar em temperatura ambiente por 5 minutos, centrifuge a amostra a 10.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
- Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior incolor para um tubo novo de microcentrífuga.
- Introduza um volume igual de isopropanol pré-resfriado, misture bem e depois incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
- Centrifuge a amostra novamente (4 °C, 10.000 × g, 10 min), depois descarte a fase líquida e retenha o precipitado.
- Enxágue o pellet com 1 mL de etanol pré-resfriado a 75% e resuspenda suavemente pipetando.
- Realize uma centrifugação final a 4 °C e 7.500 × g por 10 minutos, depois remova o sobrenadante e deixe o pellet de RNA secar ao ar em um gabinete de biossegurança.
- Dissolva o RNA purificado em 50 μL de água tratada com DEPC.
- Determine a concentração de RNA, a razão A260/A280 e a razão A260/A230 usando um espectrofotômetro NanoDrop para avaliar a pureza do RNA e garantir contaminação mínima por proteínas e solventes antes das análises posteriores.
14. RT-PCR
- Use 1 μg de RNA total para preparar um sistema de reação de transcrição reversa de 20 μL.
- Incube o sistema de reação a 42 °C por 15 minutos, seguido por 95 °C por 5 minutos, depois esfrie até 4 °C.
- Dilua o cDNA resultante 10 vezes usando água destilada.
- Prepare um sistema de reação PCR de 20 μL usando o cDNA diluído.
- Programe o ciclador térmico e ajuste uma retenção inicial em 95 °C por 60 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 60 s.
- Realize uma análise da curva de fusão e registre os valores de CT para todos os genes-alvo e genes de referência após a conclusão.
- Use o método 2(-ΔΔCT) para determinar os níveis de expressão normalizados dos genes-alvo.
15. Ensaio ELISA
NOTA: Pegue o kit ELISA do armazenamento e deixe-o se equilibrar em temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso.
- Prepare a solução padrão conforme as instruções do fabricante e realize as diluções apropriadas para padrões, anticorpos biotinilados, conjugados enzimáticos e tampão de lavagem.
- Centrifuge o supernadante de cultura celular coletado (4 °C, 10.000 × g, 10 min) e colete o sobrenadante.
- Transfira 100 μL das diluições padrão e amostras de teste para os poços pré-revestidos.
- Fele os poços com uma tira adesiva e incube a placa a 37 °C por 90 minutos.
- Descarte o líquido dos poços e lave a placa usando uma lavadora automática de placas.
NOTA: Defina os parâmetros da lavadora automática para: 350 μL de buffer de lavagem por poço, tempo de imersão de 15 segundos entre a dispensação e a aspiração, 5 ciclos completos.
- Dispense 100 μL de solução ativa de anticorpos biotinilados em cada poço. Deixe incubar a 37 °C por 60 minutos.
- Descarte a solução e lave a placa conforme descrito na 15.5.
- Pipete 100 μL de enzima conjuga solução de trabalho por poço, depois incube a 37 °C por 60 minutos.
- Descarte a solução e lave a placa conforme descrito na 15.5.
- A cada poço, adicione 100 μL de substrato cromogênico. Mantenha a 37 °C por 15 minutos enquanto se protege da luz.
- Pipete 100 μL de solução de parada por poço, depois misture suavemente.
- Meça imediatamente a densidade óptica (OD) em 450 nm.
- Estabeleça uma curva padrão plotando os valores médios de OD com as concentrações padrão usando o software Curve Expert.
- Determine a concentração de cada amostra por interpolação a partir da curva padrão usando seu valor OD.
16. Análise estatística
- Operar o software SPSS (Versão 20.0).
- Importe o conjunto de dados para as Estatísticas SPSS e defina as variáveis adequadamente. Use Analisar > Estatísticas Descritivas> Explorar para calcular a média e o desvio padrão (DE).
- Use Analisar > Comparar Médias > ANOVA Unidirecional para comparações de múltiplos grupos.
- Obtenha os valores p diretamente das tabelas de saída de teste e relate-os de acordo.
- Apresente todos os resultados como média ± DS e considere diferenças estatisticamente significativas quando p < 0,05.