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PCR sobreposta de uma etapa para síntese rápida de modelos de DNA de RNA de guia simples para o Sistema CRISPR

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DOI:

10.3791/70369

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24 de abril de 2026

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

Neste artigo

Resumo

Um método de PCR sobreposta em uma etapa usando quatro primers permite a geração rápida e de baixo custo de templates de DNA para transcrição in vitro de sgRNA. Uma proporção otimizada de primers (50:5:1:50) produz sgRNAs de alta qualidade em 5 horas, com validação funcional demonstrada por meio de ensaios in vitro e atividade de edição em células HEK293T.

Resumo

O sistema CRISPR–Cas revolucionou a edição do genoma; no entanto, métodos convencionais para gerar RNA de guia único (sgRNA) frequentemente envolvem etapas demoradas de clonagem ou kits comerciais de síntese caros. Uma estratégia otimizada de PCR sobreposta em uma etapa é apresentada para a síntese rápida e econômica de moldes de DNA para transcrição in vitro de sgRNA. Usando quatro primers parcialmente sobrepostos que abrangem o promotor T7, a sequência guia específica do alvo e o suporte de sgRNA, os moldes de comprimento total são montados em uma única reação de PCR sem clonagem. A otimização experimental sistemática estabeleceu uma razão ótima de primers (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), minimizando subprodutos inespecíficos enquanto maximiza o rendimento total do produto, conforme confirmado pela eletroforese em gel de agarose. Essa abordagem foi estendida com sucesso para gerar moldes para sgRNA Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), demonstrando aplicabilidade entre sistemas além do Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Embora a síntese química direta de sgRNAs ofereça vantagens como alta pureza, modificações químicas para melhorar a estabilidade e redução dos efeitos fora do alvo, continua proibitivamente cara para aplicações de alta capacidade ou triagens em grande escala que exigem numerosos sgRNAs. Ensaios de clivagem in vitro demonstraram que RNAs-guia gerados com esse método alcançam eficiências de edição comparáveis às obtidas via clonagem convencional baseada em plasmídeos. Além disso, complexos ribonucleoproteicos montados com esses sgRNAs e entregues às células HEK293T por eletroporação resultaram na formação de indel detectável no locus-alvo, confirmando a funcionalidade in vivo. A análise de custos indica que esse método reduz substancialmente os custos de preparação do molde em comparação com kits comerciais de síntese, ao mesmo tempo em que reduz o tempo de resposta de dias para horas, proporcionando assim uma abordagem acessível e escalável para laboratórios envolvidos em pesquisa genética.

Introdução

O sistema CRISPR–Cas, derivado de um mecanismo imunológico adaptativo em bactérias e arqueias, revolucionou a engenharia genética ao permitir a edição genômica precisa em diversos organismos 1,2. Um componente chave é o RNA de guia único (sgRNA), um RNA quimérico que direciona nucleases Cas para loci genômicos específicos; seu design modular permite o redirecionamento por meio da modificação de uma sequência protoespaçadora de aproximadamente 20 nucleotídeos3. Além do SpCas9, outras nucleases Cas com propriedades distintas foram amplamente adotadas. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) é menor, facilitando a entrega do vírus adenoassociado (AAV) e, assim, expandindo as opçõesde entrega 4. Cada sistema requer arquiteturas específicas de RNA-guia, tornando um método de síntese versátil altamentedesejável 3.

Métodos tradicionais para gerar RNAs funcionais guia incluem clonagem baseada em plasmídeos, kits comerciais de síntese de sgRNA ou síntese comercial direta de sgRNAs 5,6. A clonagem baseada em plasmídeos requer múltiplas etapas laboriosas — digestão por restrição, ligadura, transformação e triagem de colônias — normalmente levando mais de 48 horas 2,4,6. Kits comerciais de sgRNA, embora ofereçam um fluxo de trabalho simplificado (<5 h), continuam proibitivamente caros para aplicações de alta produtividade, normalmente custando entre $35 e $45 por reação. A síntese química direta de sgRNAs oferece vantagens como alta pureza, modificações químicas para aumentar a estabilidade e redução dos efeitos fora doalvo 7; no entanto, é proibitivamente cara (tipicamente US$ 200–US$ 280 por sgRNA) para aplicações de alta capacidade ou triagens em grande escala que exigem centenas de sgRNAs.

Em contraste, o método de PCR sobreposta de uma etapa descrito aqui completa a síntese do modelo em menos de 5 horas usando espoletas padrão, ao custo de aproximadamente $5–8 por sgRNA, representando uma redução substancial tanto no tempo quanto no custo do material. Além disso, sgRNAs produzidos por esse método alcançam eficiências de edição comparáveis às geradas pela clonagem baseada em plasmídeos, conforme confirmado por ensaios de clivagem in vitro . Uma comparação dessas abordagens é ilustrada na Figura 1.

A extensão por sobreposição PCR (OE-PCR) fornece uma estratégia rápida e independente da ligase para montar fragmentos de DNA8. Essa abordagem foi adaptada para a síntese de moldes de sgRNA usando primers sobrepostos. Em uma reação de uma etapa usando quatro primers parcialmente sobrepostos, ocorre a ligação competitiva: os primers externos (AF1 e Tracr-R) definem os limites de amplificação, enquanto os primers internos (AF2 e AF3) devem ser diluídos para garantir uma extensão ordenada de ambas as extremidades em direção ao centro. Apesar desse arcabouço teórico, um parâmetro crítico que afeta a eficiência da montagem — a razão ótima dos primers — não foi investigado sistematicamente. Além disso, a aplicabilidade mais ampla desses métodos OE-PCR em diferentes sistemas CRISPR permanece pouco explorada.

Para resolver essas limitações, foi elaborado um estudo para otimizar e validar um método de PCR sobreposta de uma etapa para a síntese de moldes de sgRNA. A razão ideal dos espoletários foi estabelecida por meio de um desenho experimental estruturado, com eletroforese em gel de agarose usada para identificar condições que resultassem em um único produto de tamanho correto. Após a otimização, a versatilidade do método foi avaliada em dois sistemas CRISPR amplamente utilizados (SpCas9 e saCas9), com amplificação bem-sucedida de ambos os modelos. A validação funcional usando ensaios de clivagem in vitro demonstrou que sgRNAs gerados por esse método alcançam eficiências comparáveis às obtidas por clonagem baseada em plasmídeos.

Para avaliar melhor a funcionalidade em contexto celular, o sgRNA de SpCas9 foi complexado com a proteína Cas9 para formar complexos ribonucleoproteicoicos (RNP) e entregue às células HEK293T por eletroporação . A edição genômica em um locus endógeno foi avaliada usando um ensaio de endonuclease T7 I (T7EI), com padrões de clivagem em géis de agarosa indicando formação detectável de indel in vivo. Coletivamente, esses achados demonstram que esse método produz de forma confiável modelos de sgRNA funcionais e de alta qualidade. O protocolo a seguir descreve o procedimento detalhado usando SpCas9 como exemplo representativo, com moldes de primer fornecidos para adaptação a outras nucleases Cas.

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Protocolo

O uso da linha celular de HEK293T comercialmente disponível (ATCC CRL-3216) foi realizado de acordo com as diretrizes do Comitê Ético do Primeiro Hospital Popular da Cidade de Chenzhou, Universidade do Sul da China, para o uso de linhagens celulares de origem humana. Os reagentes, softwares e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Projeto de sequências alvo de sgRNA

  1. Identifique a região genômica alvo usando ferramentas online estabelecidas (por exemplo, CRISPRscan, CHOPCHOP ou Broad Institute CRISPick)3.
  2. Acesse o servidor web do CHOPCHOP em https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Insira as informações do gene alvo e selecione o sistema CRISPR/Cas apropriado (por exemplo, EGFR para CRISPR/Cas9) (Figura 2A).
  4. Revise a tabela de saída, incluindo classificação, sequência alvo, localização genômica, fiança, conteúdo de GC (%), auto-complementaridade, locais off-target previstos (MM0, MM1, MM2, MM3) e pontuação de eficiência (Figura 2B).
  5. Selecione uma sequência de RNA guia com alta eficiência no alvo e baixa atividade prevista fora do alvo.
  6. Registre a sequência final do alvo do sgRNA para o design do primer (por exemplo, sequência alvo do EGFR: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Figura 2B).

2. Síntese e preparação de quatro primers sobrepostos

  1. Projete quatro primers de oligonucleotídeos (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) com regiões sobrepostas conforme segue (Figura 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [alvo seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    NOTA: Substitua [target seq] no primer AF1 pela sequência obtida no passo 1.6.
  2. Sintetize primers em escala de 25 nmol com purificação padrão por dessalinização.
  3. Ressuspenda primers secos em água sem nuclease até uma concentração de estoque de 100 μM. Centrifuge a 5000 × g por 1 minuto em temperatura ambiente.

3. Otimização da concentração de primers e PCR sobreposta em um passo para síntese de moldes de sgRNA

  1. Prepare misturas de espoletas com diferentes concentrações de AF2 e AF3 conforme a Tabela 1. Mantenha AF1 e Tracr-R em 10 μM.
  2. Prepare reações de PCR em tubos livres de nuclease de 0,2 mL conforme a Tabela 2. Use uma DNA polimerase de alta fidelidade.
  3. Misture suavemente pipetando cinco vezes. Não faça vórtice. Centrifuge a 5000 × g por 1 minuto.
  4. Execute a PCR usando as condições de ciclo descritas na Tabela 3.

4. Eletroforese e recuperação de moldes de DNA

  1. Prepare um gel de agarose a 2% dissolvendo 2 g de agarose em 100 mL de tampão 1× TAE. Resfrie até 50–60 °C, adicione 5 μL de coloração de ácido nucleico e funda o gel.
  2. Deixe o gel solidificar por 30 minutos em temperatura ambiente.
  3. Carregue um produto de PCR de 10 μL misturado com 2 μL de buffer de carga de 6×. Inclua uma escada de DNA de 100 pb.
  4. Execute a eletroforese a 100 V por 30–40 minutos.
  5. Visualize sob iluminação UV. Confirme que a Condição 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) produz uma única faixa de ~120 bp (Figura 4A).
  6. Use concentrações otimizadas de primer: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Remova a faixa alvo usando um bisturi estéril. Limite a exposição aos UV a ≤30 s.
    NOTA: Armazene as fatias de gel a −20 °C por até 1 semana ou proceda imediatamente.

5. Purificação de moldes de DNA

  1. Purifique o DNA usando um kit de extração em gel conforme as instruções dofabricante 10.
  2. DNA elutado em água pré-aquecida (60 °C) sem nuclease de 20–30 μL.
  3. Meça a concentração de DNA. Rendimento típico: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1,8–2,0.
    NOTA: Armazene DNA purificado a −20 °C por até 1 ano.

6. Transcrição in vitro e purificação de sgRNA

  1. Montar a reação de transcrição usando um kit de síntese de RNA T7 (Tabela 4). Preparar nogelo 11.
    NOTA: Use materiais livres de RNase e descontamine todas as superfícies.
  2. Incube a 37 °C por 16 horas.
  3. Adicione 1 μL de DNase I e incube a 37 °C por 15 minutos.
  4. Purifique sgRNA usando um kit de limpezade RNA 12.
  5. Elute em água livre de nuclease de 30–50 μL.
  6. Quantifique sgRNA. Rendimento esperado: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1,9–2,1.
    NOTA: Armazene sgRNA a −80 °C por até 1 ano.

7. Ensaio de clivagem in vitro para verificar a atividade do sgRNA

  1. Prepare e purifique o DNA-alvo. Ajuste a concentração para 60 ng/μL13.
  2. Monte a reação de clivagem (Tabela 5) — pré-incube sem DNA a 25 °C por 30 minutos. Inclua um controle negativo.
  3. Adicione 1 μL de DNA-alvo.
  4. Incube a 37 °C por 2 horas.
  5. Adicione 4 μL de buffer de carga de 6× para parar a reação.
  6. Administre os produtos em um gel de agarose a 2% a 100 V por 30–40 minutos.
  7. Visualize sob luz UV. Confirme clivagem (por exemplo, 617 bp → 414 bp + 203 bp) (Figura 4C).

8. Validação celular da edição guiada por sgRNA em Cas9

  1. Prepare o complexo ribonucleoproteico (RNP) misturando a proteína Cas9 e o sgRNA em uma proporção molar de 1:2. Combine 10 μL de Cas9 (4 mg/mL), 280 μL de sgRNA (60 ng/μL) e 200 μL de DMEM. Incube por 15 minutos.
  2. Cultive HEK293T células até ~80% de confluência. Colha e ajuste para 3 × 106 células por amostra.
  3. Combine o complexo RNP com as células e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
  4. Transfira para uma cubeta de eletroporação de 2 mm. Eletropore a 115 V, 4 ms, um pulso (575 V/cm). Adicione imediatamente 10 mL de meio completo e transfira para uma placa de 6 poços.
  5. Incube a 37 °C com 5% de CO2 por 48 horas.
  6. Extrair DNA genômico das células tratadas e de controle. Meçam a concentração.
    NOTA: Armazene DNA a −20 °C por até 6 meses.
  7. Amplifique o locus alvo por PCR (Tabela 6 e Tabela 7).
    NOTA: Tamanho esperado do produto: 617 pb para EGFR.
  8. Verifique os produtos de PCR em um gel de agarose a 2%. Purifique a faixa correta e quantifique o DNA.
  9. Realizar a formação heteroduplex (Tabela 8 e Tabela 9).
  10. Adicione 1 μL de T7 Endonuclease I e incube a 37 °C por 15 minutos. Inative a 85 °C por 10 minutos.
  11. Adicione o buffer de carga e use um gel de agarose a 2%.
  12. Visualize sob luz UV. Confirme a formação de indel (617 pb→ 414 pb 203 pb) (Figura 4D).

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Resultados

A aplicação bem-sucedida do protocolo de PCR sobreposta de uma etapa produz uma única faixa de DNA nítida do tamanho esperado quando analisada por eletroforese em gel de agarosa.

Razões subótimas de espoletões, especialmente aquelas com concentrações excessivas de espoletas internas (AF2 e AF3), resultam em bandas adicionais maiores que o produto esperado, indicando amplificação inespecífica ou formação de primer-dímero, junto com faixas tênues correspondentes...

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Discussão

Um protocolo simplificado e econômico para sintetizar moldes de DNA de sgRNA por meio de uma estratégia de PCR sobreposta em uma etapa. Esse método elimina a necessidade de construção e clonagem de plasmídeos, reduzindo o tempo de preparação do molde de vários dias para aproximadamente 5 horas. Um aspecto chave dessa abordagem é a otimização sistemática da razão do primer, determinada como 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), correspondendo a concentrações de trabalho de 10 μM, 1 μM...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa em Saúde da Comissão Provincial de Saúde de Hunan (bolsa número W20243264), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Hunan (bolsa número 2023JJ50368), pelo Projeto-Chave de Pesquisa do Departamento de Educação da Província de Hunan (bolsa número 24A0607) e pelo Projeto de Equipe Inovadora do Hospital Popular Inicial de Chenzhou (bolsa número CX202103).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Marcador de tamanho de DNA para eletroforese
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MReagente de amplificação PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Marcador de tamanho de DNA para pequenos fragmentos
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Buffer de carga de amostra para eletroforese
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Purificação de DNA do gel de agarose
Agarose I Thermo Scientific 17850Preparação de gel de agarose
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicFerramenta de design de sgRNA
CentrífugaHENGNUO2-16RCentrifugação de amostra
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ASuplemento para cultura celular
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Reagentes para preparação de solução de buffer TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Ferramenta de design de sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Incubação de cultura celular de mamíferos
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Ferramenta de design de sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Meio de cultura celular
dsDNaseThermo Scientific EN0771Remoção do template de DNA após transcrição
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Eletroporação de células
EDTA Na2BioSharpBS108Reagentes para preparação de solução de buffer TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Incubação com temperatura controlada
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNEletroforese em gel de agarose
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Visualização e imagem de gel
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Nuclease Cas9 para edição genômica
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Isolamento de DNA genômico
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040STranscrição in vitro de sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834Amplificação PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cQuantificação de ácido nucleico
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Visualização de DNA em gel de agarose
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Amplificação PCR de alta fidelidade
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucleotídeos para montagem de template de sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Reagentes para preparação de solução de buffer TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Purificação de RNA

Referências

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