Isolamento de Núcleo Único de Tecido de Endarterectomia Coronária de Pacientes com Bypass de Artéria Coronária

Resumo

Amostras de tecido de endarterectomia coronária foram processadas para isolar núcleos individuais usando um protocolo otimizado de dissociação. A integridade dos núcleos isolados foi validada por meio de três abordagens complementares: coloração de exclusão por azul de tripano para avaliar a integridade da membrana, microscopia confocal baseada em DAPI para confirmar a morfologia nuclear e citometria de fluxo para quantificar o rendimento e a pureza nuclear.

Resumo

A aterosclerose é uma condição inflamatória crônica e progressiva, caracterizada pelo acúmulo de placas nas paredes das artérias. Durante a progressão da formação da placa, certas lesões tornam-se instáveis, chamadas de placas de alto risco, e podem causar infarto do miocárdio (IM). Uma placa aterosclerótica é composta por células musculares lisas, células endoteliais, células imunológicas, células adiposas e células necróticas, qualquer uma das quais pode causar ruptura de placa. É crucial estudar a heterogeneidade celular dentro das placas ateroscleróticas para compreender melhor os mecanismos subjacentes à instabilidade da placa. Apresentamos um protocolo facilmente reprodutível para isolar e validar núcleos de tecido endorerectomia coronário humano obtido de pacientes submetidos a cirurgia de bypass da artéria coronária (CABG). Todos os tecidos são mantidos em gelo úmido no meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) para preservar a integridade celular antes da colheita. As amostras de tecido são finamente trituradas e depois suavemente desintegradas com um micropilão em tampão de lise para lisar células e liberar núcleos. Os núcleos isolados são então avaliados quanto à integridade e rendimento usando o ensaio de exclusão de azul de tripan em um microscópio invertido composto. A coloração DAPI permite a visualização de núcleos intactos por microscopia confocal, e a citometria de fluxo fornece quantificação baseada em fluorescência para avaliar o rendimento de isolamento nuclear e validar a população nuclear. Em contraste com os métodos tradicionais de isolamento por dissociação de célula única, o isolamento nuclear reduz o estresse celular e mantém o ambiente transcriptômico nativo, prevenindo assim mudanças na expressão gênica. A preparação nuclear de alta qualidade obtida por esse método é compatível com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq).

Introdução

A doença cardiovascular aterosclerótica (DCASV) é a principal causa mundial de morte e incapacidade e, apesar dos grandes avanços terapêuticos, sua carga permanece^intacta. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica da parede arterial, impulsionada por interações complexas e dinâmicas entre diversas populações celulares que, coletivamente, orquestram a progressão silenciosa da doença subclínica inicial até eventos cardiovasculares (CV) que alteram^{a vida 2}.

Em artérias médias e grandes, o acúmulo de depósitos de colesterol dentro dos macrófagos é uma característica marcante da^{aterosclerose 3}. A placa aterosclerótica consiste em ácidos graxos, colesterol, células inflamatórias, cálcio, fibrina, células musculares lisas, células endoteliais e detritos celulares dentro do^{subendotélio 4}. As placas ateroscleróticas são classificadas em dois tipos: de baixo risco e de alto risco. Placas de alto risco são identificadas por sua tendência a desencadear um evento cardiovascular subsequente, tipicamente por mecanismos como erosão ou ruptura de^{placas 5}.

As características das placas de alto risco incluem grandes núcleos lipídicos, várias células inflamatórias, menos células musculares lisas, uma fina capa fibrosa, microcalcificação, hemorragia intraplaca, neovasos e núcleo necrótico⁶. A detecção de placas de alto risco é realizada clinicamente usando modalidades de imagem não invasivas e invasivas, a saber, tomografia computorizada coronariana (CCTA) e tomografia de coerência óptica (OCT), respectivamente ^7,8. Apesar dos inúmeros avanços na imagem cardiovascular, ainda é difícil prever a ruptura da placa aterosclerótica que causa o infarto do miocárdio (IM), e nem sempre é útil em ambientes^clínicos.

Apesar de décadas de pesquisa, ainda carecemos de biomarcadores circulantes confiáveis que possam identificar especificamente fenótipos de placas de alto risco, deixando uma lacuna crítica em nosso manejo clínico da aterosclerose. Isso ressalta a necessidade de estratégias moleculares que possam caracterizar essas placas em um nível biológico mais^{fundamental 7,10}. Nesse contexto, marcadores baseados em RNA ganharam considerável atenção, pois podem capturar a intricada atividade transcricional que ocorre no microambiente da placa¹¹. Desenvolvimentos recentes no sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) têm se mostrado particularmente poderosos, oferecendo uma resolução sem precedentes para perfilar células individuais dentro de placas ateroscleróticas e revelar populações celulares distintas, padrões de expressão gênica e vias moleculares que fundamentam a vulnerabilidade à placa^12,13. Apesar desses desenvolvimentos, existe pouco conhecimento sobre os processos regulatórios, interações e importância funcional dos diversos tipos celulares implicados no desenvolvimento da aterosclerose¹⁴.

Quando a carga aterosclerótica é severa e difusa, a revascularização cirúrgica torna-se a estratégia definitiva de tratamento. A endarterectomia coronária (CE) é um complemento cirúrgico à cirurgia de bypass de artéria coronária (CABG), na qual a placa aterosclerótica é removida mecanicamente de artérias coronárias difusamente doentes para permitir o enxerto de bypass e alcançar a revascularização completa^{do miocárdio 15,16}. Placas ateroscleróticas e amostras de endarterectomia são particularmente difíceis de trabalhar porque contêm tecido necrótico abundante, depósitos lipídicos, fibrina e calcificações. Quando esses tecidos são degradados para análise, geram detritos substanciais que entopem filtros e sistemas microfluídicos, tornando o isolamento de células individuais viáveis extremamente^{difícil 17,18}. De fato, um estudo de placa carótida constatou que células viáveis representavam menos de 1% de todas as partículas após o processamento do tecido; O restante era simplesmente detritos da placa¹⁸.

Para agravar ainda mais esse desafio, as placas ateroscleróticas existem em um estado de estresse metabólico e oxidativo crônico, onde células que passam por apoptose, senescência e outros processos degenerativos tornam as membranas celulares cada vez mais frágeis e suscetíveis a rupturas, tornando o isolamento de células individuais viáveis extremamente^difícil 18,19,20 . A digestão mecânica e enzimática necessária para preparar amostras para o scRNA-seq frequentemente danifica essas células já comprometidas, reduzindo ainda mais a viabilidade e resultando em taxas baixas de captura celular. Esse processo também tende a perder seletivamente populações celulares frágeis ou raras, o que introduz viés significativo tanto nos dados transcriptômicos quanto nos tipos celulares representados nos resultados finais. Esse problema se torna ainda mais acentuado em placas calcificadas ou fortemente doentes, onde as duras condições de processamento necessárias para decompor o tecido causam danos adicionais à viabilidade^celular 18,21,22^.

Em contraste, o núcleo permanece estruturalmente intacto mesmo sob essas condições^{adversas 23}. Isso se deve principalmente ao envelope nuclear, uma bicamada de lipídios duplo reforçada por laminas nucleares (Lamin A/C e Lamin B), que proporciona rigidez mecânica e resistência às tensões osmóticas, enzimáticas e físicas que facilmente desintegram a membrana^{plasmática 24,25}. A lâmina nuclear também preserva a morfologia nuclear mesmo quando o citoplasma ao redor está severamente^{comprometido 26}. Isso torna o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) uma alternativa mais prática e confiável ao sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para o perfil do tecido^{aterosclerótico 27}. Ao capturar informações transcricionais de núcleos intactos em vez de células inteiras, o snRNA-seq contorna as limitações impostas pela baixa viabilidade celular e alto conteúdo de detritos, permitindo um perfil transcriptômico mais preciso e abrangente do microambiente da placa¹⁸.

Portanto, neste estudo, apresentamos um protocolo otimizado de isolamento de núcleos desenvolvido especificamente para tecido de endarterectomia coronariana, incorporando lise não iônica à base de detergente e duração de lise empiricamente ajustada com base no grau de calcificação tecidual, para produzir consistentemente núcleos de alta qualidade com integridade estrutural e de RNA preservados, adequados para análise posterior de snRNA-seq.

Protocolo

O presente estudo foi realizado com aprovação e de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Humana do Instituto de Cardiologia e Centro de Pesquisa da ONU Mehta (EC/Aprovação/26/Cardio/14/12/2024) e da Universidade de Biotecnologia de Gujarat (GBU_IHEC/2023/006). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra. Os pacientes submetidos à cirurgia de bypass de artéria coronariana com endarterectomia coronária foram selecionados para o estudo atual. Após a remoção cirúrgica, o tecido endorerectomia era imediatamente colocado em meio RPMI sem soro, mantido a 4 °C e transportado para o laboratório em aproximadamente 12 horas em um criovial. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os materiais usados no protocolo a seguir.

1. Isolamento de núcleos

NOTA: Realize todos os passos no gelo e use materiais estéreis. Prepare todos os tampões frescos.

1. Lave o tecido uma ou duas vezes com meio RPMI sem soro para remover manchas e fragmentos de sangue. Usando uma pinça estéril, transfira o tecido para uma placa de Petri estéril e registre o peso.
2. Usando uma lâmina cirúrgica (nº 10), triture o tecido em pequenos pedaços de 1 mm³ de tamanho.
3. Prepare 1 mL de tampão de lise combinando 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2 (usando soluções padrão de 1 M para cada componente), 0,1% (v/v) de Nonidet P-40 em água sem nuclease. Adicione os componentes sequencialmente na seguinte ordem: primeiro água sem nuclease, depois Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ e NP-40 por último, para evitar espuma.
   NOTA: O buffer de lise deve ser preparado fresco no dia do uso e mantido gelado em gelo o tempo todo. Não congele.
4. Adicione um tampão de lise gelado de 1 mL ao tecido em um tubo de microcentrífuga de 5 mL.
5. Lise o papel de papel no gelo usando um micropilão, aplicando uma força suave e consistente e girando o micropilão alternadamente no sentido horário e anti-horário. Continue a lise por aproximadamente 30 minutos, garantindo que a amostra permaneça fria durante todo o tempo.
   NOTA: Lisar o tecido até que fique turvo. Use uma ponta de 1000 μL para misturar suavemente pipetando.
6. Filtre a solução usando um peneiro de 100 μm do tamanho de um poro para um tubo centrífugo de 15 mL para remover detritos e pedaços de tecido.
   NOTA: O filtrado deve parecer menos turvo, com detritos visíveis retidos no peneirador.
7. Centrifuge os núcleos a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante.
   NOTA: Um pellet visível deve se formar na parte inferior do tubo.
8. Remova o sobrenadante usando uma ponta de pipeta de calibre comum sem mexer no pellet.
9. Prepare lavagem de núcleos e buffer de ressuspension combinando albumina sérica bovina (BSA) a 1% (usando 10% da solução original), inibidor de RNase de 0,2 U/μL (usando solução de estoque de 20 U/μL) em soro tampão fosfato 1X de Dulbecco (DPBS). Adicione os componentes sequencialmente na seguinte ordem: primeiro DPBS, depois BSA e, por fim, inibidor de RNase.
   NOTA: O buffer deve ser preparado fresco no dia do uso e mantido gelado em tempo integral. Não congele.
10. Resuspenda o pellet em lavagem de núcleos e resuspensão de tampon. Resfrie o buffer no gelo antes de usar.
11. Avalie a eficiência da lise e a viabilidade celular colorindo com 5 μL de azul de tripano e contando em um hemocitômetro.
    NOTA: Se células viáveis ainda estiverem presentes, centrifuge a 500 x g por 5 minutos a 4 °C, depois repita as seções 3-10.
12. Filtre a solução usando um peneiro de 30 μm do tamanho de um poro para um tubo centrífugo de 15 mL para remover detritos e aglomerados.
13. Centrifuge os núcleos a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante.
14. Remova o sobrenadante usando uma ponta de pipeta de diâmetro comum, depois ressuspenda o pellet em 1 mL de lavagem de núcleos e tampon.

2. Caracterização de núcleos isolados

1. Coloração de azul tripano para avaliar a integridade dos núcleos.
   1. Retire 15 μL da suspensão de núcleos isolados em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Adicione 5 μL de corante azul de tripan (0,4% em p/v) e misture suavemente pipetando.
   3. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a mancha adequada.
   4. Coloque 10 μL da mistura corada em um hemocitômetro.
   5. Observe sob um microscópio invertido composto para examinar a morfologia e contar o número de núcleos.
2. Análise de citometria de fluxo em suspensão de núcleos individuais
   1. Pegue 1 mL de suspensão de núcleos isolados e centrifuge a suspensão de núcleos a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde de oscilação.
   2. Remova o sobrenadante usando uma ponta de pipeta de diâmetro comum e ressuspenda o pellet em um tampão FACS de 200 μL (1X PBS e 1% BSA).
   3. Divida 200 μL de núcleos ressuspensos em duas alíquotas: mantenha 100 μL como controle não corado e use 100 μL como amostra colorida.
   4. Adicione 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg/mL) à amostra corada para alcançar uma concentração final de 10 μg/mL. Misture suavemente e incube em temperatura ambiente no escuro por 5 minutos antes da análise citométrica de fluxo.
   5. No citômetro de fluxo usado neste estudo, use o laser violeta a 405 nm e detecte usando 448/45 nm. Faça primeiro a amostra controle não corada e adquira no mínimo 10.000 eventos da população total.
   6. Ajuste a tensão para 183 V para dispersão direta (FSC), 300 V para dispersão lateral (SSC) e 400 V para V450 (Laser DAPI). Defina o limite em 10.000 para FSC.
      NOTA: Todas as configurações de tensão e ganho do instrumento são constantes entre as amostras para manter a consistência.
   7. Plote a área de dispersão frontal (FSC-A) versus altura de dispersão frontal (FSC-H) para distinguir singlets de doublets e agregados. Desenhe uma porta em torno de eventos que exibam uma relação linear para reter apenas núcleos singlet.
   8. Gerar um gráfico bivariado de FSC-A versus área de dispersão lateral (SSC-A). Aplique uma porta ampla que abrange toda a população de dispersão, pois núcleos isolados tipicamente exibem um perfil de dispersão heterogêneo sem subpopulações distintas.
   9. Crie um gráfico de densidade 2D (pseudo cor) de SSC-A versus área violeta de 450 nm (V450-A). Use o controle não corado para definir a fluorescência de fundo e guiar a colocação precisa da porta. Identifique e faça gate à população distinta de DAPI⁺ correspondente aos núcleos intactos.
      NOTA: Como um único fluorocromo (DAPI) é utilizado, a compensação de fluorescência não é necessária.
3. Imageamento dos núcleos isolados usando microscopia confocal
   1. Pegue 50 μL de suspensão de núcleos e adicione 1 μL de DAPI (1 mg/mL) à amostra corada para alcançar uma concentração final de 10 μg/mL, misture suavemente e incube em temperatura ambiente por 5 minutos no escuro antes da imagem confocal.
   2. Monte 5 μL de suspensão de núcleos manchados em uma lâmina de vidro limpa e cubra-a com um revestimento.
      NOTA: Evite fixação para preservar a morfologia nuclear.
   3. Visualize os núcleos usando um microscópio confocal invertido. Abra o software do microscópio confocal e observe primeiro em campo claro 10X, depois mude para campo claro 40X.
   4. Adquira imagens confocais usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com detector espectral e objetivos PLAN APO λD 40X (NA 0,95, RI 1,0). Excite DAPI usando um laser de 405 nm e colete a emissão entre 429-474 nm.
   5. Os parâmetros de imagem foram os seguintes:
      1. Modo detector: Multicanal (GaAsP)
      2. Scanner: Galvano unidirecional
      3. Modo de varredura: Banda
      4. Média de linha: 2X
      5. Resolução: 1024 × 1024 pixels
      6. Tempo de permanência: 2,0 μs
      7. Tamanho do orifício: 47,7 μm
      8. Potência do laser: 0,1-9,3% (dependendo da intensidade do campo)
      9. Ganho do detector: 37,8-45,9%
      10. Zoom: 1.0X
      11. Calibração: 0,43-0,58 μm/pixel
   6. Adquira todas as imagens usando a câmera AX com modo mínimo de diafonia sob configurações ópticas idênticas, e o sistema de foco perfeito (PFS) deve estar ativo durante a imagem para manter a estabilidade do plano z.

Resultados

O tecido de endarterectomia coronária humana foi coletado de pacientes submetidos à cirurgia de CABG. O tecido foi pesado e processado para isolamento de núcleos, e núcleos mais isolados foram confirmados por citometria de fluxo e microscopia confocal (Figura 1).

Avaliação do azul de tripano da qualidade do isolamento dos núcleos
O tecido mantido em médio RPMI foi pesado e mediu 247,8 mg. O tecido foi triturado e depois homogeneizado em tampão ...

Discussão

Um fluxo de trabalho otimizado para o isolamento de núcleos do tecido endorerectomia coronário humano é descrito no protocolo atual. O protocolo de isolamento nuclear descrito aqui foi especificamente projetado para superar as limitações críticas de obter células viáveis e intactas a partir de placas ateroscleróticas coronárias avançadas. Diferentemente das abordagens convencionais de scRNA-seq que dependem de digestão enzimática agressiva e dissociação^{mecânica 21,30}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 & mu; Filtro m	Miltenyi Biotech	130-098-463
30 & mu; Filtro m	Miltenyi Biotech	130-098-458
Albumina Sérica Bovina	HiMedia	TC546-25G
Centrífuga	MPW	NA	https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Microscópio Composto	Nikon	NA	Microscópio invertido Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Microscópio Confocal	Nikon	NA	Microscópio confocal invertido Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
Coberturas	HiMedia	BG011C
Frasco de Amostra CRYOCHIL de Boca Larga	Tarsons	883191
DAPI	Sigma	D9542-5MG
DPBS	Gibco (Termofischer)	10010-023
Tubo de centrífuga (15 mL)	Tarsons	546021
Citômetro de fluxo	BD em Biociências	663029	BD FACSLyric (3L12C Instrumento CEIVD)
Hemocitômetro	Axibio	CCB 100
Tubo de Microcentrífuga (1,5 mL)	Tarsons	500010C
Tubo Microcentrífuga (5 mL)	Tarsons	500050
MgCl2	Sigma	M1028-100ML
Micro pilão	Tarsons	160020
NaCl	Sigma	S9888-500G
NP-40	HiMedia	MB143-100ML
Água livre de nuclease	Gibco (Termofischer)	W4502-1L
Inibidor de RNase	Sigma	333540201
RPMI 1640	Gibco (Termofischer)	11875093
Slide	Riviera	72910135
Tris-HCl	Sigma	T2194-100ML
Azul de tripan & nbsp;	Sigma	302643-25G