Amostras de tecido de endarterectomia coronária foram processadas para isolar núcleos individuais usando um protocolo otimizado de dissociação. A integridade dos núcleos isolados foi validada por meio de três abordagens complementares: coloração de exclusão por azul de tripano para avaliar a integridade da membrana, microscopia confocal baseada em DAPI para confirmar a morfologia nuclear e citometria de fluxo para quantificar o rendimento e a pureza nuclear.
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Artigo de método
Isolamento de Núcleo Único de Tecido de Endarterectomia Coronária de Pacientes com Bypass de Artéria Coronária
Neste artigo
Resumo
Resumo
A aterosclerose é uma condição inflamatória crônica e progressiva, caracterizada pelo acúmulo de placas nas paredes das artérias. Durante a progressão da formação da placa, certas lesões tornam-se instáveis, chamadas de placas de alto risco, e podem causar infarto do miocárdio (IM). Uma placa aterosclerótica é composta por células musculares lisas, células endoteliais, células imunológicas, células adiposas e células necróticas, qualquer uma das quais pode causar ruptura de placa. É crucial estudar a heterogeneidade celular dentro das placas ateroscleróticas para compreender melhor os mecanismos subjacentes à instabilidade da placa. Apresentamos um protocolo facilmente reprodutível para isolar e validar núcleos de tecido endorerectomia coronário humano obtido de pacientes submetidos a cirurgia de bypass da artéria coronária (CABG). Todos os tecidos são mantidos em gelo úmido no meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) para preservar a integridade celular antes da colheita. As amostras de tecido são finamente trituradas e depois suavemente desintegradas com um micropilão em tampão de lise para lisar células e liberar núcleos. Os núcleos isolados são então avaliados quanto à integridade e rendimento usando o ensaio de exclusão de azul de tripan em um microscópio invertido composto. A coloração DAPI permite a visualização de núcleos intactos por microscopia confocal, e a citometria de fluxo fornece quantificação baseada em fluorescência para avaliar o rendimento de isolamento nuclear e validar a população nuclear. Em contraste com os métodos tradicionais de isolamento por dissociação de célula única, o isolamento nuclear reduz o estresse celular e mantém o ambiente transcriptômico nativo, prevenindo assim mudanças na expressão gênica. A preparação nuclear de alta qualidade obtida por esse método é compatível com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq).
Introdução
A doença cardiovascular aterosclerótica (DCASV) é a principal causa mundial de morte e incapacidade e, apesar dos grandes avanços terapêuticos, sua carga permaneceintacta. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica da parede arterial, impulsionada por interações complexas e dinâmicas entre diversas populações celulares que, coletivamente, orquestram a progressão silenciosa da doença subclínica inicial até eventos cardiovasculares (CV) que alterama vida 2.
Em artérias médias e grandes, o acúmulo de depósitos de colesterol dentro dos macrófagos é uma cara....
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Protocolo
O presente estudo foi realizado com aprovação e de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Humana do Instituto de Cardiologia e Centro de Pesquisa da ONU Mehta (EC/Aprovação/26/Cardio/14/12/2024) e da Universidade de Biotecnologia de Gujarat (GBU_IHEC/2023/006). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra. Os pacientes submetidos à cirurgia de bypass de artéria coronariana com endarterectomia coronária foram selecionados para o estudo atual. Após a remoção cirúrgica, o tecido endorerectomia era imediatamente colocado em meio RPMI sem soro, mantido a 4 °C e transportado para o laboratór....
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Resultados
O tecido de endarterectomia coronária humana foi coletado de pacientes submetidos à cirurgia de CABG. O tecido foi pesado e processado para isolamento de núcleos, e núcleos mais isolados foram confirmados por citometria de fluxo e microscopia confocal (Figura 1).
Avaliação do azul de tripano da qualidade do isolamento dos núcleos
O tecido mantido em médio RPMI foi pesado e mediu 247,8 mg. O tecido foi triturado e depois homogeneizado em tampão .......
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Discussão
Um fluxo de trabalho otimizado para o isolamento de núcleos do tecido endorerectomia coronário humano é descrito no protocolo atual. O protocolo de isolamento nuclear descrito aqui foi especificamente projetado para superar as limitações críticas de obter células viáveis e intactas a partir de placas ateroscleróticas coronárias avançadas. Diferentemente das abordagens convencionais de scRNA-seq que dependem de digestão enzimática agressiva e dissociaçãomecânica 21,30
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses a revelar.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) e pela colaboração do Instituto de Cardiologia e Centro de Pesquisa das Nações Unidas Mehta, em Ahmedabad. Khushi Jani reconhece a Comissão de Subsídios Universitários (UGC) e o Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Governo da Índia, por concederem a qualificação conjunta CSIR-UGC NET (Nº DE REFERÊNCIA NTA: 241620143543).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 & mu; Filtro m | Miltenyi Biotech | 130-098-463 | |
| 30 & mu; Filtro m | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | |
| Albumina Sérica Bovina | HiMedia | TC546-25G | |
| Centrífuga | MPW | NA | https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r |
| Microscópio Composto | Nikon | NA | Microscópio invertido Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2) |
| Microscópio Confocal | Nikon | NA | Microscópio confocal invertido Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series) |
| Coberturas | HiMedia | BG011C | |
| Frasco de Amostra CRYOCHIL de Boca Larga | Tarsons | 883191 | |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | |
| DPBS | Gibco (Termofischer) | 10010-023 | |
| Tubo de centrífuga (15 mL) | Tarsons | 546021 | |
| Citômetro de fluxo | BD em Biociências | 663029 | BD FACSLyric (3L12C Instrumento CEIVD) |
| Hemocitômetro | Axibio | CCB 100 | |
| Tubo de Microcentrífuga (1,5 mL) | Tarsons | 500010C | |
| Tubo Microcentrífuga (5 mL) | Tarsons | 500050 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028-100ML | |
| Micro pilão | Tarsons | 160020 | |
| NaCl | Sigma | S9888-500G | |
| NP-40 | HiMedia | MB143-100ML | |
| Água livre de nuclease | Gibco (Termofischer) | W4502-1L | |
| Inibidor de RNase | Sigma | 333540201 | |
| RPMI 1640 | Gibco (Termofischer) | 11875093 | |
| Slide | Riviera | 72910135 | |
| Tris-HCl | Sigma | T2194-100ML | |
| Azul de tripan & nbsp; | Sigma | 302643-25G |
Referências
- Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
- de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. He....
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Reimpressões e permissões
