Análise Multi-Ômica Integrativa do Buti Huatan Tang em Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica

Resumo

O perfil multiômico do Buti Huatan Tang (BTHTT) na doença pulmonar obstrutiva crônica revela seu potencial para modular o eixo metabólico do hormônio IL-1R2/IL-1β-tireoidiano. Esse trabalho fornece uma estrutura para validação mecanicista adicional dos componentes bioativos do BTHTT, estabelecendo uma base para futuros estudos de intervenção causal necessários para confirmar esse eixo.

Resumo

Este estudo utilizou uma estrutura multi-ômica e de biologia computacional para investigar o potencial terapêutico da fórmula da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) Buti Huatan Tang (BTHTT) contra a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Melhorias fisiológicas significativas foram observadas em um modelo de rato após a intervenção com BTHTT. A análise histológica mostrou uma reversão do dano patológico pulmonar, enquanto ensaios bioquímicos e transcriptômicas confirmaram a normalização dos níveis de IL-1β e IL-1R2 . Além disso, o perfil metabólico revelou que o BTHTT corrigiu as interrupções nos níveis de hormônio tireoidiano T3 e T4. Foi observada uma correlação negativa entre o eixo IL-1β/IL-1R2 e esses hormônios da tireoide, indicando que sua regulação está associada ao efeito terapêutico da fórmula. Além das medições diretas, algoritmos de aprendizado de máquina identificaram dez genes assinaturados para DPOC a partir de bancos de dados clínicos. A análise de enriquecimento de vias sugere que a BTHTT pode atuar por meio de interações citocina-citocina-receptor e das vias de síntese dos hormônios tireoidianos. Além disso, embora 283 componentes tenham sido identificados in vivo, compostos como tanshinona IIA e criptotanshinona são atualmente considerados substâncias ativas candidatas. Seu papel como motores principais é apoiado por um modelo no qual eles se ligam de forma estável ao IL-1R2; essa inferência baseia-se em simulações de acoplamento molecular e dinâmica molecular (MD), em vez de isolamento experimental direto. No geral, os dados apoiam um modelo em que o BTHTT exerce um efeito multi-alvo sobre a DPOC ao modular a inflamação e a homeostase metabólica. Essa abordagem integrada fornece uma base científica refinada para a aplicação clínica do BTHTT e destaca caminhos específicos para validação experimental futura.

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), uma das doenças respiratórias mais comuns na prática clínica, tornou-se a terceira principal causa de morte no mundo devido à sua taxa extremamente alta de incapacidade e exacerbações agudas^recorrentes. A DPOC foi um fator significativo que levou à perda de capacidade de trabalho na população e a um aumento acentuado nos custos de cuidados familiares, com perdas sociais e econômicas muito superiores às da maioria das doenças^{crônicas 2}. Na "Iniciativa China Saudável 2030", a DPOC foi listada como uma doença-chave para prevenção e tratamento. Devido a uma compreensão incompleta dos mecanismos subjacentes à DPOC, o uso combinado de broncodilatadores e corticosteroides permaneceu como o tratamento principal. Embora essa abordagem tenha proporcionado alívio relativamente óbvio dos sintomas, não pode evitar o declínio progressivo da função pulmonar. Além disso, o uso prolongado de corticosteroides inevitavelmente aumenta a incidência de reações adversas, afetando ainda mais a eficácia a longo prazo dos medicamentos e a tolerância dos^{pacientes 3}. Estudos mostraram que, mesmo com a terapia tripla, 28%–31% dos pacientes ainda apresentam exacerbações agudas ou piora dos sintomas. Portanto, o desenvolvimento de medicamentos eficazes para a DPOC continua sendo uma questão fundamental e fundamental nas pesquisas atuais sobre^{DPOC 4}.

Para atender a essas necessidades, fórmulas clássicas da MTC como Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin e Bu Fei Tang foram desenvolvidas. Entre eles, o BTHTT foi particularmente notável por seus efeitos significativos na tonificação do pulmão, aumento de energia e resolução do catarro para aliviar a^tosse 5,6,7,8. O BTHTT foi amplamente utilizado no tratamento clínico da DPOC, não apenas por sua notável eficácia e efeitos colaterais mínimos, mas também pelo seu potencial de reverter o declínio progressivo da função pulmonar. Ele tinha grande potencial em contextos clínicos e sociais e tinha potencial para um "desenvolvimento secundário" como um medicamento principal, com valor científico e econômico significativo ^9,10,11,12. No entanto, devido à falta de pesquisas científicas sistemáticas e de longo prazo, os estudos sobre o BTHTT geralmente têm sofrido de uma compreensão pouco clara de sua base componente e de alvos centrais de ação não identificados. Fundamentalmente, isso se deveu a deficiências significativas na pesquisa sobre o principal mecanismo e a potencial base terapêutica da substância BTHTT.

Em resposta a essa característica, integrar múltiplas tecnologias de ómicas, como metabolômica e transcriptômica, bem como métodos de mineração multi-algoritmo, focando nas principais correlações entre genes-chave característicos e vias metabólicas chave no microambiente do^corpo 13,14,15 não pode apenas explorar a essência do tratamento, mas também avaliar a eficácia sinérgica dos componentes ativos. Um foco particular é dado ao eixo dos hormônios tireoidianos, já que pesquisas emergentes indicam que a disfunção tireoidial é uma comorbidade frequente na DPOC, frequentemente correlacionada com aumento da inflamação sistêmica e deterioração da função muscular respiratória. Modular esse eixo pode representar um novo caminho para restaurar a homeostase metabólica na doença pulmonar^16,17.

Em resumo, este estudo adotou uma abordagem tripla combinando integração multi-ômica com biologia computacional, baseada na premissa da correspondência entre síndrome e fórmula. Por um lado, utilizou técnicas de farmacoquímica sérica da MTC para identificar os componentes transmitidos pelo sangue do BTHTT sob condições eficazes. Por outro lado, focando nos principais genes característicos da DPOC, utilizou metabolômica tecidular abrangente para descobrir biomarcadores de doenças a partir de pequenas moléculas endógenas e construir uma avaliação precisa dos efeitos gerais da fórmula. Enquanto isso, combinado com mineração multi-algoritmo e análise de identificação transcriptômica, identificou os principais genes característicos regulados pelo BTHTT sob condições eficazes e conduziu uma análise de correlação entre os principais genes característicos e as principais vias metabólicas. A base potencial da substância terapêutica foi avaliada por acoplamento molecular e análise dinâmica molecular.

Com base em nosso arcabouço multi-ômico e no perfil farmacológico do BTHTT, este estudo propõe as seguintes previsões testáveis. Modulação anti-inflamatória: A intervenção com BTHTT reduzirá significativamente os marcadores de inflamação sistêmica e pulmonar, especificamente normalizando o eixo de expressão IL-1β/IL-1R2 para mitigar danos tecidos. Restauração metabólica: O BTHTT altera os sinais na via de síntese do hormônio tireoidiano, levando a uma correção mensurável dos níveis de T3/T4 e a uma subsequente melhora no estado metabólico do microambiente pulmonar. Restauração Metabólica: A BTHTT altera os sinais na via de síntese do hormônio tireoidiano, levando a uma correção mensurável dos níveis de T3/T4 e a uma melhoria subsequente no estado metabólico do microambiente pulmonar.

Protocolo

NOTA: Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Aquisição e pré-processamento de dados clínicos

Para investigar as assinaturas moleculares da DPOC, conjuntos de dados transcriptômicos foram retirados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Um total de cinco conjuntos de dados foi selecionado: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 e GSE222965. Os dados brutos e os arquivos de anotação da plataforma foram baixados para mapeamento sonda para gene. Quando múltiplas sondas atingiam um único gene, o valor máximo de expressão era mantido. As matrizes de expressão gênica resultantes (linhas como genes, colunas como amostras) foram fundidas em um único conjunto de dados de descoberta. Para levar em conta variações técnicas entre diferentes plataformas de microarranjos e coortes de estudo, a correção de efeito lote foi realizada usando o algoritmo ComBat do pacote sva R. A eficácia da correção foi validada por meio de gráficos de Análise de Componentes Principais (PCA). Após a correção por lote, o conjunto de dados de descobertas mesclado foi utilizado para análise diferencial. Genes diferencialmente expressos (DEGs) entre pacientes com DPOC e controles saudáveis foram identificados usando o pacote limma. Os limites de significância foram definidos em |logFC| ≥ 1 e p ≤ 0,05.

Para identificar os genes característicos mais robustos, três algoritmos independentes de aprendizado de máquina foram integrados. Para garantir a confiabilidade dos modelos e evitar vazamento de dados, o processo de seleção de características foi aninhado dentro dos ciclos de validação cruzada quando aplicável, e o conjunto de dados de descoberta foi estritamente separado dos conjuntos de validação independentes. O modelo LASSO foi aplicado aos DEGs usando o pacote glmnet. Empregamos validação cruzada de 10 vezes para determinar o parâmetro de penalidade ideal. O valor ótimo do parâmetro de penalidade correspondente ao erro mínimo de validação cruzada foi selecionado como o limiar para identificar os genes centrais das características. A SVM foi utilizada para classificar genes com base em seu poder discriminatório. Foi implementada uma estratégia de validação cruzada de 10 vezes para identificar o ponto de erro mínimo de generalização, determinando assim o número ótimo de genes característicos. O pacote randomForest foi usado para ranquear os DEGs com base em sua Precisão Média Diminutiva e índice de Gini. Genes com as maiores pontuações de importância foram selecionados como características relacionadas à doença.

A interseção das características identificadas por LASSO, SVM e randomForest foi tomada para definir os genes característicos centrais finais. O desempenho diagnóstico desses genes foi avaliado usando análise da curva Receiver Operating Feature (ROC). A Área Sob a Curva (AUC) e os Intervalos de Confiança (ICs) de 95% associados foram calculados usando o pacote pROC. Um gene era considerado com alto valor diagnóstico se a AUC > 0,70. Por fim, os níveis de expressão e a precisão diagnóstica desses genes foram ainda validados em um conjunto independente de validação para garantir a generalização dos achados.

Utilizando o PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) e o banco de medicamentos (https://go.drugbank.com/), foram obtidos um total de 12 perfis específicos de medicamentos, como LABAs, LAMAs, SABAs, SAMAs, Fluticasone propionate, Budesonida, Beclometasona, Fluticasone, Salmeterol, Umeclidinium, Vilanterol, Theophylline. Os alvos compilados foram calibrados usando o banco de dados Uniprot (https://www.uniprot.org/), durante o qual genes não humanos foram removidos e alvos duplicados inválidos foram excluídos para obter nomes padronizados de genes. Ao inserir a palavra-chave "doença pulmonar obstrutiva crônica", "DPOC" nos bancos de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) e DisGENET (https://www.disgenet.org/), foram recuperados alvos relacionados à doença. Todos os alvos dos três bancos de dados foram consolidados em um arquivo Excel, genes duplicados foram removidos e os dados calibrados usando o banco de dados Uniprot para obter as informações finais do gene alvo da doença.

Desenvolvimento de modelos de aprendizado de máquina

Um framework de aprendizado de máquina multi-algorítmico foi construído utilizando sequencialmente os pacotes R glmnet, e1071 e randomForest. Especificamente, a regressão LASSO foi realizada para redução de dimensionalidade baseada em penalidades, a análise de Suporte Vector Machine (SVM) foi empregada para avaliar erros de validação com base no agrupamento amostral, e a Random Forest foi usada para filtrar características de acordo com escores de importância. Esse processo gerou visualizações diagnósticas correspondentes, incluindo curvas de validação cruzada e gráficos de bolhas de importância gênica. Após a construção do modelo, foi realizada uma análise do diagrama de Venn nos conjuntos gênicos identificados por esses múltiplos algoritmos para extrair os genes de características sobrepostos de "interseção", aumentando assim a confiabilidade dos potenciais biomarcadores. A matriz de expressão desses genes de interseção foi então extraída para visualizar diferenças de expressão entre grupos por meio de gráficos de violino. Por fim, curvas ROC foram geradas por meio de loops iterativos para cada gene para calcular a Área Sob a Curva (AUC), validando seu valor diagnóstico como biomarcadores candidatos.

Indução de modelos animais

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Guizhou (2303411) e seguiu as diretrizes ARRIVE e regulamentos de bem-estar animal. Um total de 72 ratos machos Sprague-Dawley (SD) de grau SPF (230 ± 20 g). Após 1 semana de alojamento adaptativo sob condições padrão (25 ± 1 °C, 50 ± 5% de umidade, ciclo claro-escuro de 12 h), os ratos foram divididos aleatoriamente em grupo controle (grupo C) (n = 24) e grupo modelo (grupo M) (n = 48).

O grupo M foi submetido a modelagem de dois fatores: exposição intermitente à fumaça de cigarro (9 semanas, 6 dias por semana, 3 cigarros de grau de pesquisa por dia divididos em 2 sessões, 30 minutos por sessão) e instilação intratraqueal de LPS (200 μg por instilação, uma vez a cada duas ^{semanas)18,19}. O grupo C recebeu um volume equivalente de soro fisiológico normal. Após modelagem bem-sucedida, os grupos foram divididos aleatoriamente em grupo M (n = 12), grupo BTHTT de alta dose (grupo H) (Alta, 1× dose clínica, n = 12) e grupo BTHTT de baixa dose (grupo L) (Baixa dose, 1/2× dose clínica, n = 12), com intervenção contínua de gavage por 2 semanas. Os grupos C e M receberam água destilada de forma sincrona.

O peso corporal e os parâmetros de atividade espontânea foram registrados semanalmente. Ao final da modelagem e tratamento, foram coletados tecido pulmonar, soro, soro e fluido de lavagem broncoalveolar (BALF). Os níveis de marcadores inflamatórios (ou seja, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN e MCP-1) foram medidos usando ELISA conforme as instruções do kit. Também foram realizadas análises de patologia tecidual e multi-ômicas.

Administração do tratamento

Buti Huatan Tang (BTHTT) consiste em nove ervas medicinais tradicionais chinesas: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix de Astragali, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.), J. Presl (Cortex de Cinnamomi, 15 g), Angelica sinensis (oliveira) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Sêmen de Raphani, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g) e Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Os materiais herbais foram deixados de molho em água a 10 vezes o peso combinado por 30 minutos e posteriormente decoctados por 1 hora. A decocção era filtrada, e o filtrado era coletado e dividido em três porções iguais para administração oral.

Com base na segurança clínica e eficácia, a dose padrão de BTHTT para adultos foi de 1,57 g∙^kg-1∙^day-1 , de acordo com as diretrizes clínicas de medicação. Considerando o fator de conversão de dose para ratos, que indicou que a dose padrão do medicamento para ratos era 6,3× a dose padrão humana, o grupo H correspondente para ratos foi definido em 9,9 g∙kg-1∙day-1, e o grupo L foi fixado na metade dessa dose (4,95 g∙^kg-1∙^day-1). Dado que o volume concentrado final de BTHTT foi de 50 mL, o volume administrado para o grupo H em ratos foi de aproximadamente 1,6 mL, e para o grupo L, aproximadamente 0,8 mL. O medicamento era administrado uma vez ao dia por via oral.

Coleção de tecidos e BALF

Nos desfechos experimentais (Semana 9 e Semana 11), os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 5% (1 mL/100 g). O sangue era coletado da veia porta, deixado repousar por 30 minutos em temperatura ambiente e depois centrifugado a 13.000 × g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante era armazenado a -80 °C. Os tecidos pulmonares foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C. O BALF foi coletado por três lavagens consecutivas com PBS frio.

Análise de transcriptômica

O RNA total foi extraído do tecido pulmonar e controlado pela qualidade usando (A₂₆₀/A₂₈₀ > 1,8) (RIN ≥ 7,0. Bibliotecas de sequenciamento de RNA foram construídas: o mRNA foi enriquecido com oligo(dT), fragmentado e usado para sintetizar cDNA de fita dupla, que então foi ligado a oligonucleotídeos adaptadores e amplificado por PCR. As bibliotecas eram quantificadas e verificadas de qualidade antes do sequenciamento. Incluindo inspeção de distribuição de conteúdo, análise de distribuição de densidade FPKM de cada amostra e análise geral de avaliação de qualidade do^{RNA-seq 20}.

Os dados brutos de transcriptômica gerados pela plataforma de sequenciamento foram processados usando scripts Perl para remover sequências adaptadoras e leituras de baixa qualidade (leituras com Q ≤ 25 bases representando > taxa de 60% ou N > 5%). Leituras limpas foram obtidas após esse processo de filtragem. As leituras limpas foram alinhadas ao genoma de referência usando HISAT2, e os níveis de expressão gênica foram quantificados para calcular os valores FPKM. Foi realizada uma análise diferencial de expressão (com critérios de triagem de |log2FC| > 1 e p-adj < 0,05). A anotação do fator de transcrição foi baseada em bancos de dados Animal TFDB ou Pfam/DBD, correspondendo IDs de genes e informações de domínio^{proteico 21}.

Uma estratégia de mapeamento gênico ortólogo foi empregada para garantir rigor metodológico para validação entre espécies. Essa estratégia envolvia a recuperação de ortólogos em ratos para genes humanos centrais (por exemplo, SRPX2, IL-1R2, TFF3) usando os bancos de dados NCBI HomoloGene e Ensembl BioMart. A seleção foi restrita a pares de genes que apresentavam uma clara relação de mapeamento "um-para-um" e alta identidade de sequência proteica. Em casos em que múltiplos candidatos estavam presentes, foi dada preferência a pares ortologos certificados pelo HGNC. Para garantir alta precisão na detecção, foram projetados primers específicos RT-qPCR com base nas sequências de mRNA dos ortólogos de ratos identificados. Os critérios de validação foram definidos pela consistência na direção da expressão e pela verificação funcional. Consistência na Direção da Expressão: Em um modelo de DPOC induzida por fumaça em ratos, a RT-qPCR mostrou que as tendências de expressão dos genes-alvo no tecido pulmonar de rato eram totalmente consistentes com as observadas em conjuntos de dados clínicos de GEO humanos. Genes que exibiam a mesma polaridade de mudança entre espécies eram considerados conservadores que biomarcadores de doenças. Verificação Patológica: Após a consistência da expressão, foi realizada uma análise de correlação para verificar o envolvimento desses genes na evolução patológica da DPOC.

Fluxo de trabalho de metabolômica

O tecido pulmonar (20–50 mg) foi homogeneizado em metanol-acetonitrila-água pré-fria (2:2:1, v/v) e sonicado em banho de gelo. O homogenado foi centrifugado a 13.000 × g por 20 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi concentrado em vácuo, redissolvido em acetonitrila-água (1:1, v/v) e filtrado através de uma membrana de 0,22 μm para análise^{LC-MS 22}.

A separação cromatográfica foi realizada usando uma coluna UPLC à base de amida (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). A temperatura da coluna foi mantida em 25 °C. A fase móvel consistia em (A) água contendo 25 mM de acetato de amônio e 25 mM de amônia, e (B) acetonitrila. A vazão foi definida em 0,5 mL/min, e o volume de injeção foi de 2 μL. O programa de elução do gradiente foi o seguinte: 0–0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, diminuição linear de B de 95% para 65%; 7–8 min, diminuição linear de B de 65% para 40%; 8–9 min, B mantido em 40%; 9–9,1 min, aumento linear de B de 40% para 95%; 9,1–12 min, B se manteve em 95%. Durante toda a análise, as amostras foram mantidas a 4 °C no autoamostrador. Para garantir a estabilidade do sistema e a confiabilidade dos dados experimentais, as amostras foram analisadas em sequência aleatória, com amostras de controle de qualidade (QC) intercaladas na fila. A análise por espectrometria de massa foi realizada usando um sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC) acoplado a um espectrômetro de massas. As amostras foram ionizadas usando ionização por eletrospray (ESI) tanto em modos de íons positivos quanto negativos. As configurações da fonte e MS do ESI eram as seguintes: gás nebulizador (Gás 1) ajustado para 50, gás auxiliar (gás 2) para 2, temperatura da fonte de íons para 350 °C e tensão de spray (ISVF) para 3.500 V no modo íon positivo e 2.800 V no modo íon negativo. A faixa de massa para MS1 foi definida de 70 a 1.200 Da, com resolução de 60.000 e tempo de acumulação de varredura de 100 ms. Para o MS2, foi utilizada aquisição dependente de dados (DDA) com energia de colisão escalonada. A faixa de massa para MS2 também foi definida de 70 a 1.200 Da, com resolução de 60.000 e tempo de acumulação de varredura de 100 ms. O tempo de exclusão dinâmica foi definido em 4 s.

Os dados brutos de metabolômica foram convertidos para o formato mzXML e então processados para alinhamento de picos, correção do tempo de retenção e extração da área de pico. O fluxo de trabalho de pré-processamento de dados incluía as seguintes etapas: Primeiro, os picos de íons com taxa de > 50% ausentes foram removidos. Segundo, os valores restantes ausentes foram imputados usando o algoritmo KNN. Terceiro, características metabólicas com desvio padrão relativo (RSD) >50% foram descartadas. A qualidade dos dados experimentais foi avaliada utilizando análise de componentes principais (PCA) e agrupamento de amostras de controle de qualidade. Análises subsequentes incluíram estatísticas univariadas (por exemplo, testes t), estatísticas multivariadas (PLS-DA), triagem diferencial de metabólitos (VIP > 1 e p < 0,05) e análise de enriquecimento de vias KEGG (teste hipergeométrico)^23,24.

Estabelecimento de métodos analíticos para componentes in vivo e in vitro

Preparação de amostras de BTHTT para testes in vitro : O BTHTT foi extraído por decocção em água (2 x 30 min), concentrado em 1,1–1,2 g/mL e depois liofilizado. Antes da análise, 600 μL da solução em pó liofilizada foram misturados com 400 μL de metanol, redissolvidos em metanol a 40% e centrifugados para coletar o sobrenadante.

Preparação de amostras de BTHTT para testes in vivo : O soro foi desproteinizado misturando com metanol (1:1) e precipitando a −20 °C por 30 minutos, seguido por centrifugação por 20 minutos. O sobrenadante foi secado a vácuo e redissolvido em 40% de metanol para obter a amostra final. Para a preparação de amostras de soro em branco + BTHTT, uma quantidade adequada de soro em branco foi adulterada com o sobrenadante in vitro BTHTT, e as etapas restantes foram realizadas conforme descrito.

As amostras foram separadas usando um sistema UHPLC equipado com uma coluna UPLC de fase reversa (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). A temperatura da coluna foi mantida em 35 °C, e a vazão foi ajustada em 0,3 mL/min. A fase móvel consistia em (A) 0,1% de ácido fórmico na água e (B) 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. A elução por gradiente foi realizada conforme mostrado na Tabela 1.

Um espectrômetro de massa foi usado para a aquisição dos espectros MS1 e MS2. O espectrômetro de massa era acoplado ao sistema UHPLC e operava tanto em modos ESI positivo quanto negativo. Os parâmetros do ESI eram os seguintes: tensão de pulverização 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), pressão do gás da bainha 45 arb, pressão do gás auxiliar 20 arb, temperatura do tubo de transferência de íons 320 °C e temperatura do vaporizador 350 °C. O modo de detecção foi configurado para varredura completa/dependente de dados MS2 (Full-MS/dd-MS2) com resoluções de 60.000 para MS1 e 15.000 para MS2. Os 10 principais íons MS1 foram selecionados para fragmentação MS/MS com energias de colisão normalizadas em etapas de 20, 40 e 60. A faixa de massa para o MS1 foi ajustada de 90 a 1.300 Da.

Para análises in vivo , incluindo amostras de grupo em branco, amostras de grupo dosado e amostras de grupo em branco + BTHTT, 6 μL de cada amostra foram injetados com precisão. Para a análise in vitro do BTHTT, 2 μL da amostra foram injetados. Cada lote de amostras em branco e do grupo dosado foi injetado uma vez, enquanto as amostras do grupo em branco + BTHTT foram injetadas em triplicado, e as amostras de BTHTT foram injetadas em quintuplicado.

Dados no formato mzXML foram processados e compostos identificados com base em um banco de dados local de espectrometria de massa TCM comercial de alta resolução. Os critérios de identificação foram definidos da seguinte forma: erro de massa de <25 ppm para MS1 e pontuação de correspondência > 0,7 para MS2 (onde a Pontuação refletiu a semelhança dos íons fragmentados, sendo ≥0,7 um limiar confiável)^25,26. A análise estatística incluiu contagem e classificação de compostos (por exemplo, flavonoides, alcaloides), realizadas em conjunto com anotações do banco de dados de espectrometria^{de massa 27}.

Acoplamento molecular e simulação MD

Para investigar os modos potenciais de ligação entre as proteínas características identificadas e seus ligantes correspondentes, foi realizado acoplamento molecular in silico . As estruturas tridimensionais das pequenas moléculas foram recuperadas do banco de dados PubChem, e suas configurações geométricas otimizadas. As estruturas cristalinas das proteínas-alvo foram obtidas do Banco de Dados de Proteínas (PDB) do RCSB. Usando PyMOL, moléculas de água e heteroátomos foram removidos, e ligandos cocristalizados foram extraídos para definir as coordenadas do sítio ativo. Átomos de hidrogênio foram adicionados e cargas de Gasteiger foram atribuídas por software. Simulações de acoplamento foram executadas, gerando 15 conformações independentes por execução. A conformação com a menor energia de ligação foi selecionada para análise posterior. Para caracterizar rigorosamente as interações não covalentes, os complexos receptor-ligante foram analisados usando o Profilador de Interação Proteína-Ligante (PLIP). NOTA: É importante enfatizar que esses resultados de acoplamento fornecem suporte estrutural para potenciais interações moleculares e servem como base para um refinamento dinâmico adicional; no entanto, eles não constituem evidência isolada de eficácia biológica.

Para avaliar a estabilidade e a evolução conformacional dos complexos proteína-ligante previstos sob condições fisiologicamente relevantes, simulações de dinâmica molecular foram realizadas usando o pacote de software GROMACS. Arquivos de topologia tanto para proteínas quanto para ligantes foram gerados com base no campo de força GROMOS96 43a1. Cada complexo foi posicionado no centro de uma caixa dodecaedral, mantendo uma distância mínima de 1,0 nm das bordas da caixa, e solvizado usando o modelo de água SPC. Para garantir a neutralidade elétrica, íons de sódio ou cloreto eram adicionados ao sistema conforme necessário. A minimização de energia foi realizada usando o algoritmo de descida mais íngreme até que a força máxima fosse inferior a 1.000,0 kJ^∙mol-1∙^nm-1. O sistema foi então equilibrado em dois estágios: primeiro, um conjunto NVT foi empregado para aquecer o sistema a 300 K sobre 100 ps usando um termostato de escala em V; segundo, um conjunto NPT foi usado para estabilizar a pressão em 1 bar acima de 100 ps usando um barostato Parrinello-Rahman. As simulações de produção foram realizadas com duração total de 10 ns com um intervalo de tempo de 2 fs. Interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas usando o método Particle Mesh Ewald (PME), enquanto interações de van der Waals de curto alcance e eletrostáticas foram gerenciadas com um raio de corte de 1,2 nm. Para garantir a confiabilidade das simulações, três execuções independentes foram realizadas sempre que possível. A estabilidade dos complexos foi avaliada quantitativamente calculando o Desvio Quadrático Médio Radicular (RMSD) e a Flutuação Quadrática Média Radicular (RMSF) dos átomos da espinha dorsal da proteína em relação à estrutura inicial. A obtenção de um platô no perfil RMSD foi utilizada como critério principal para o equilíbrio do sistema e estabilidade estrutural.

Análise estatística geral

Neste experimento, os cálculos em grupo foram realizados usando testes t ou análise unidirecional da variância (ANOVA).

Resultados

Previsão de genes característicos chave na DPOC

Após a correção por efeito lote de dados clínicos de múltiplas plataformas de microarray (Arquivo Suplementar 1–Figura Suplementar S1), foi realizada uma análise diferencial de expressão. 34 genes candidatos (32 regulados para cima e 2 para baixo) foram identificados, incluindo SRPX2, CLDN10 e TFF3 (Figura 1A).

...

Discussão

A síntese e manutenção dos níveis de hormônios tireoidianos são significativas para pacientes com DPOC e vão muito além da mera função endócrina, influenciando profundamente a progressão da doença, o estado nutricional, a função pulmonar e o prognóstico^geral 31,32,33^. Particularmente durante exacerbações agudas, pacientes com DPOC frequentemente apresentavam um estado semelhante ao hipotireoidis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrila (grau cromatográfico)	Merck, Alemanha	1499230-935
Bioanalisador Agilent 4150	Agilent Technologies, EUA
Acetato de amônio	SIGMA, Alemanha	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix Astragali),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240601
ChemOffice		Software de desenho de estrutura química e modelagem molecular
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Córtex de Cinnamomi),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240901
Centrífuga Eppendorf 5430 R	Eppendorf, Alemanha
Cigarros experimentais	Harbin Taihua, China	20230208
GraphPad Prism 8		Software de análise estatística e gráficos
Cigarros Huangshan		Experimentos de cigarro de grau de pesquisa para exposição à fumaça
IL-1 e beta; Kit ELISA	Biotecnologia Ligada a Enzimas de Xangai, China	E-EL-R0012c-20230522
Plataforma de sequenciamento Illumina Novaseq 6000	Illumina, EUA
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240201
Lepidium sativum L. (Sêmen Raphani)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Lipopolissacarídeo (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, China	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Metanol (grau cromatográfico)	Fisher, EUA	DK745764
Espectrofotômetro Nanodrop ND-2000	Thermo Scientific, EUA
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20250201
Fluorômetro Qubit 4.0	Thermo Fisher Scientific, EUA
Kit de construção de biblioteca de RNA	ABclonal, EUA	RK20301-20230415
SMINA		Software de acoplamento molecular
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae miltiorrhizae radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240902
Registrador de atividades espontâneas de pequenos animais (KW-ZF)	Nanjing Karlvin Biotechnology, China
Pentobarbital sódico	Empresa de Aquisição de Reagentes Experimentais de Xangai, China	20230412
TNF-&alfa; Kit ELISA	Biotecnologia Ligada a Enzimas de Xangai, China	E-EL-R2856c-20230522
Banco de dados de Esclerose Múltipla de Medicina Tradicional Chinesa (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		Banco de dados espectral de massas da medicina tradicional chinesa comercial
Reagente Trizol	Magen, China	20230508
Coluna AMIDA BEH do UPLC		Coluna analítica UHPLC baseada em amida
Coluna UPLC HSS T3		coluna analítica UHPLC de fase reversa (tipo T3)
Sistema Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	Thermo Scientific, EUA
Vanquish sistema MS UHPLC-Q-Exactive HF-X	Thermo Scientific, EUA