Gerando culturas de organoides tumorais a partir da linha celular de adenocarcinoma pulmonar

Resumo

Aqui, apresentamos um método rápido, puro e econômico para estabelecer organoides tumorais a partir da linha celular A549, adequados para testes preliminares e fins educacionais.

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar Organoides Tumorais Derivados de Linhas Celulares (CDTOs) a partir da linha celular de adenocarcinoma pulmonar humano A549. O protocolo envolve a incorporação de células A549 expandidas 2D no Matrigel e a manutenção em meio de cultura 3D para cultivo a longo prazo. A densidade de semeadura recomendada de 500 células/μL foi determinada como favorável à formação consistente de organoides. Os CDTOs resultantes foram caracterizados por coloração por hematoxilina e eosina (H&E) e imunofluorescência (IF). Os organoides mantiveram alta expressão dos marcadores adenocarcinomas pulmonares Fator de Transcrição Thyroid 1 (TTF-1), proteína de adesão E-Cadherin (ECAD) e proteína do citoesqueleto Keratin 7 (KRT7). Além disso, a expressão da proteína de junção apertada Zona Occludens 1 (ZO-1) mostrou polaridade desregulada dos organoides tumorais. Esse protocolo oferece uma plataforma tecnicamente simples, econômica e puramente tumoral para pesquisa em adenocarcinomas pulmonares. Sua simplicidade e reprodutibilidade também o tornam adequado para o ensino laboratorial de graduação, onde pode ajudar os estudantes a adquirir técnicas fundamentais de cultura de organoides tumorais 3D dentro de um cronograma laboratorial limitado.

Introdução

Organoides são in vitro. estruturas tridimensionais (3D) auto-organizadas que se originam de células-tronco e são capazes de recapitular complexidades biológicas de órgãos reais em grande^{medida 1}. As células que constituem organoides podem derivar de células-tronco pluripotentes induzidas ou células derivadas de tecidos, estas últimas incluindo células-tronco/progenitoras normais, células diferenciadas e células^{tumorais 2}. Comparados aos sistemas tradicionais de cultura bidimensional e modelos animais, os organoides podem imitar mais de perto as características fisiológicas do corpo humano, ao mesmo tempo em que oferecem maior flexibilidade experimental. Consequentemente, a tecnologia organoide tem sido amplamente aplicada no desenvolvimento de medicamentos³, medicina^{personalizada 4} e modelagem^{de doenças 5}.

Numerosos estudos estabeleceram modelos organoides para um amplo espectro de cânceres, incluindo^{colorretal 6},^{próstata 7}, pâncreas⁸,^{gástrico 9}, hepático¹⁰,^{biliar 11},^{mama 12} e tumores neuroendócrinos. No entanto, um dos principais desafios na pesquisa com organoides tumorais é manter a pureza. Por exemplo, um estudo sobre câncer de pulmão não de pequenas células revelou que apenas 17% dos organoides estabelecidos eram puramente tumorais, já que as amostras tumorais frequentemente contêm uma mistura de células normais e malignas que são difíceis de separar totalmente antes da cultura¹³. Esse problema de impureza pode causar a eliminação de células tumorais pelo crescimento de células não tumorais, interferir nas leituras dos testes de suscetibilidade a medicamentos e levar a análises moleculares imprecisas, como RT-qPCR ou Western blot, onde RNAs e proteínas das células tumorais são diluídos por proporções incontroláveis de células contaminantes.

Para enfrentar essa questão, pesquisadores exploraram o design de meios de cultura seletiva que exploram a redução da dependência das células tumorais em certos fatores de crescimento, inibindo assim o crescimento celular normal enquanto promovem a expansão das células^{tumorais 14}. Além disso, estratégias como separação celular ou identificação monoclonal estão sendo desenvolvidas para construir organoides tumorais puros.

Este protocolo descreve a geração de Organoides Tumorais Derivados de Linhagens Celulares (CDTOs) usando a linha celular de adenocarcinoma pulmonar humano A549, que foi relatada como apresentando parcialmente propriedades semelhantes às células-tronco cancerígenas, além de clonogenicidade aprimorada, potencial proliferativo e tumorigenicidade in vitro.¹⁵. Os CDTOs resultantes mantiveram a expressão de biomarcadores específicos de linhagem Fator de Transcrição Tireoide 1 (TTF-1)¹⁶, proteína de adesão E-Cadherina (ECAD⁾¹⁷ e proteína do citoesqueleto Queratina 7 (KRT7)¹⁶ , apresentando características fisiológicas características dos organoides tumorais. Esse modelo é fácil de estabelecer e contém componentes definidos das células cancerígenas, tornando-o adequado para pesquisadores iniciantes no campo dos organoides tumorais ou para aqueles que enfrentam dificuldades com perda de identidade tumoral em culturas primárias de organoides. As aplicações potenciais incluem testes preliminares de suscetibilidade a medicamentos¹⁸, estudos de microambientes^{tumorais 19} e treinamento educacional em técnicas de cultura 3D.

Protocolo

A temperatura ambiente no laboratório é de 22–24 °C e é chamada de RT. Recomenda-se o uso de uma centrífuga de balde oscilante. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de organoides primários A549

1. Preparação e colheita de células A549
   1. Prepare um prato de 6 cm contendo células A549 a 70% de confluência. Pré-aqueça TrypLE e PBS a 37 °C. Calcule a quantidade de células e o volume do Matrigel de acordo com o desenho experimental e a Tabela 1.
      1. O descongelamento exigiu alíquotas Matrigel com redundância para pelo menos dois poços no gelo por pelo menos 60 minutos. Prepare placas tratadas com poliestireno e TC para permitir que as cúpulas permaneçam hemisféricas.
      2. Preparo um meio 2D fresco (Meio Modificado de Águia Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal) e meio 3D (Meio Organoide de Adenocarcinoma Pulmonar Humano). O meio 3D pode ser gerado a partir de kits comerciais ou, segundo os trabalhos de Sachs, N. et al., do laboratório²⁰ de Hans Clever.
         NOTA: Um prato de 6 cm geralmente pode produzir cerca de 5.000.000 de células após a digestão. Reduzir o número de células de entrada para o desenho experimental. Placas projetadas para imagem confocal usando fundo de vidro não são adequadas para que o Matrigel forme uma forma 3D adequada.
   2. Aspire o meio 2D gasto e lave as células uma vez com 1 mL de PBS para remover o soro residual. Aspire PBS, adicione 1 mL de TrypLE pré-aquecido e incube a placa a 37 °C por 4 minutos.
   3. Observe as células ao microscópio. Quando o citoplasma se retrai e as células perdem conexões intercelulares, adicione um volume igual (1 mL) de meio 2D novo para terminar a reação enzimática.
   4. Pipete suavemente para desprender e ressuspender as células aderentes da superfície da cultura. Transfira a suspensão da célula para tubos centrífugos de 1,5 mL e centrifuge a 300 × g. por 3 minutos em RT para pelletar as células.
   5. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pastilha celular em meio 2D de 1 mL. Diluir a suspensão de células de 10 μL para 100 μL e contar o número de células com um hemocitômetro. Calcule o volume necessário conforme a etapa 1.1.1 e aspire para um tubo centrífuga de 1,5 mL com pontas pré-enxaguadas.
2. Semeadura das células colhidas em Matrigel
   1. Prepare gelo e pré-resfrie as ponteiras da pipeta na geladeira a -20 °C por 1 minuto e use ponteiras de baixa retenção, se possível. Certifique-se de que não restam cristais nas aliquotas do Matrigel e que nenhuma bolha se forme quando a ponta entra na solução.
   2. Centrifuge o tubo contendo as células colhidas a 300 × g em RT e descarte o sobrenadante. Coloque o tubo no gelo. Use pontas de pipeta pré-resfriadas para aspirar lentamente o volume necessário de Matrigel e adicioná-lo ao pellet no gelo. Resuspenda usando apenas a primeira parada da pipeta, lentamente sobre gelo. Por favor, não deixe gelo por mais de 10 segundos se for necessário observar.
   3. Use pontas de pipeta pré-resfriadas e mantenha a mistura no gelo. Dispense uma aliquota da mistura no centro de cada poço. Retire a pipeta lentamente durante a dispensação, usando apenas a primeira parada para evitar a formação de bolhas.
      NOTA: A mistura deve formar uma estrutura 3D em forma de cúpula no centro. Suspenda novamente a mistura antes de seguir para o próximo poço. Se possível, evite usar os poços de borda e adicione PBS a esses poços.
   4. Incube a placa a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 40 minutos para permitir a polimerização em gel. Após a solidificação do Matrigel, adicione cuidadosamente um meio 3D ao longo da parede do poço e continue a cultivar a 37 °C.
      NOTA: Evite gerar bolhas durante a dispensação. Se forem geradas bolhas, evite usar essa parte da mistura.
   5. Durante a cultura, substitua o meio 3D a cada 3 dias ou sempre que uma mudança de cor (de rosa para amarelo) for observada. Examine o crescimento dos organoides sob um microscópio invertido a cada mudança de meio e documente a morfologia fotograficamente para monitorar o desenvolvimento estrutural.
      NOTA: Os organoides devem ser densos e convolutos, com diâmetros maiores que 30 μm, em vez de desintegrados ou fragmentados, como indicado por 5000 células/μL (Figura 1D).

2. Fixação, embedding e seccionamento de organoides

1. Prepare culturas organoides nos dias 6–9. Remova o meio de cultura da placa de cultura celular. Desprenda suavemente os organoides pipeteando com 1 mL de PBS frio e transfira-os para um tubo de 1,5 mL pré-enxaguado com 5% de BSA para evitar a aderência. Permita que os organoides se assentem naturalmente pela gravidade sobre o gelo e remova cuidadosamente o sobrenadante.
2. Adicione 1 mL de PBS frio para resuspender o pellet. Deixe os organoides se estabilizarem naturalmente pela gravidade por pelo menos 5 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante. Se alguns organoides não se sedimentarem, centrifuge brevemente a 200 × g por 1 minuto a 4 °C para coletá-los. Essa etapa será realizada várias vezes e será chamada de 'small wash'.
3. Realize a lavagem pequena duas vezes para remover o Matrigel residual. Se o Matrigel residual persistir, adicione uma concentração final de 10 mM de EDTA ao PBS frio durante a lavagem.
   ATENÇÃO: Transfira as amostras para a exaustão. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) suficiente para cobrir os organoides e fixe no gelo por 1 hora em uma exaustão exaustiva. Descarte o fixador e faça a lavagem pequena duas vezes. Prossiga com o passo 4.1 para a mancha de jejum intermitente.
4. Após os organoides se depositarem no fundo do tubo, descarte o sobrenadante e pré-aqueça as amostras em um banho metálico a 70–75 °C por 5 minutos para evitar a rápida solidificação de agarose durante a etapa 2.7.
5. Prepare 3% (p/v) de agarose em 1× PBS e aqueça a mistura em banho-maria no micro-ondas até estar totalmente dissolvida e transparente. Evite ferver para evitar perda de volume ou mudanças na concentração de agarose.
6. Ressuspenda rapidamente os organoides fixos em 30–50 μL de 3% de agarose, garantindo distribuição uniforme, e resfrie no gelo por 20–30 minutos até solidificar, evitando a formação de bolhas.
7. Depois que a mistura de agarose-organoide estiver solidificada, remova cuidadosamente o bloco de agarose do tubo usando uma agulha e transfira-o para um fita cassete de tecido marcado.
8. Imerga sequencialmente a fita cassete contendo o bloco de agarose em soluções de etanol graduadas (30%, 50%, 70% [pode ser armazenado durante a noite a 4 °C], 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) para desidratação. Incube cada passo em uma plataforma de tremor a 20 rpm por 30 minutos.
9. Pré-derreter os blocos de cera de parafina em um forno antes do uso a 65 °C. Transfira os organoides desidratados embutidos em agarose para xileno para eliminação. Imerga duas vezes, cada uma por 15–20 minutos, para remover o etanol residual.
10. Transfira as fitas de tecido sequencialmente para o banho 1 de parafina por 45 minutos, e depois para o banho 2 por mais 45 minutos.
11. Coloque os cassetes de tecido e os moldes metálicos na câmara de parafina derretida da estação de incorporação. Remova o organoide ou amostra de tecido da fita cassete e posicione-a no centro do molde metálico. Coloque o molde sobre uma placa fria para fixar a orientação da amostra.
12. Posicione o fita de seda sobre o molde de metal, encha com parafina derretida adicional e deixe esfriar na placa fria por pelo menos 60 minutos. Uma vez que o bloco de parafina esteja totalmente solidificado, remova o molde metálico e armazene o bloco organoide embutido na parafina a 4 °C até a secção.
13. Seccione os blocos organoides embutidos em parafina usando um microtomo. Certifique-se de que a espessura de cada seção seja uniforme para facilitar a coloração e a obtenção de imagens subsequentes.
14. Deixe as seções cortadas flutuando em banho-maria mantido a 40 °C para permitir a expansão completa das fitas de parafina. Certifique-se de que cada seção se espalhe como uma única camada sem rugas; descarte quaisquer seções dobradas ou sobrepostas.
15. Monte as seções expandidas em lâminas adesivas de microscópio mergulhando a lâmina em um leve ângulo abaixo da seção e levantando-a verticalmente para capturar o tecido. Rotule as lâminas com um lápis para preservar a identificação da amostra durante o processamento subsequente.

3. Coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E)

1. Asse as lâminas contendo tecido ou seções organoides em um forno a 60 °C por 1–2 horas para garantir a adesão adequada e remover parafina residual.
2. Faça um dewax sequencial nas seções mergulhando-as no xileno I por 15 minutos, no xileno II por 15 minutos, e depois reidrate através de uma série graduada de etanol de 100%, 100%, 95%, 90%, 80% e 70%, cada por 5 minutos. Depois, enxágue os slides em água duplamente destilada (ddH₂O) duas vezes, cada uma por 5 minutos.
3. Tinga as seções com hematoxilina por 5 minutos, enxágue em água da torneira corrente por 1–2 minutos e depois diferencie em álcool ácido a 1% por 2 segundos. Lave novamente em água da torneira por 1–2 minutos, depois alveje os núcleos em água com 1% de amônia por 5 segundos, e depois um enxágue final em água da torneira por 1–2 minutos.
4. Desidrate as seções por uma série graduada de etanol de 70%, 80%, 90% e 95% cada por 3 minutos, e depois contra-tinga com eosina em uma solução à base de álcool por 10 minutos.
5. Enxágue as seções duas vezes com etanol absoluto, cada uma por 5 minutos.
   NOTA: Para a eosina à base de álcool, certifique-se de desidratação de até 95% de etanol antes da coloração. Para a eosina solúvel em água, faça a coloração antes da desidratação.
6. Limpe as seções mergulhando-as duas vezes em xileno, cada uma por 5 minutos, e mantenha-as no xileno até montar.
7. Monte os ferrolhos imediatamente após a remoção do xileno usando um meio de montagem de resina neutra, evitando cuidadosamente bolhas de ar.
8. Seque as lâminas montadas ao ar por 30–60 minutos, depois observe sob um microscópio óptico.
   NOTA: A montagem imediata após a limpeza do xileno previne a oxidação e garante clareza óptica.

4. Coloração imunofluorescente de montagem completa

1. Continue a partir do passo 2.4. Adicione 1 mL de solução de bloqueio e permeabilização (5% BSA + 0,3% Triton X-100) ao pellet e incube em RT por 60 minutos ou a 4 °C como ponto de parada por 1–2 dias.
2. Diluir anticorpos primários e secundários seguindo a proporção recomendada pelo fabricante na solução de bloqueio e permeabilização. Lave uma vez e adicione 200 μL de anticorpos primários diluídos ao pellet. Incube a 4 °C durante a noite.
3. Realize a lavagem pequena 3 vezes e adicione 200 μL de anticorpos secundários diluídos ao pellet. Incubar em RT por 60 minutos.
4. Em seguida, faça a lavagem pequena 3 vezes. Adicione 15 μL de meio de montagem para resuspender o pellet e coloque o meio contendo organoides sobre uma lâmina de vidro. Aplique lentamente um engobe de cobertura no meio e fele o engobe com esmalte. Não comprima manualmente o deslizamento da tampa e deixe o meio de montagem se espalhar pela tensão superficial.

Resultados

O processo geral deste protocolo inclui a expansão das células A549 2D para o estágio exponencial (Figura Suplementar 1A) e a passagem para o Matrigel 3D para formar organoides (Figura 1A). Após a encapsulação em Matrigel, as células proliferaram e se auto-montaram, formando predominantemente organoides monoclonais (Figura 1B). Sua morfologia densa e complexa era uniforme ao longo do percurso (Figura Suplementar 1C). Em comparaç...

Discussão

Este protocolo descreve um método para gerar organoides tumorais derivados de linhas celulares de adenocarcinoma pulmonar A549, otimizados para simplicidade técnica, reprodutibilidade e uso educacional. Três parâmetros determinam criticamente o sucesso: estado inicial da célula, formulação do meio e composição da matriz. Além disso, a duração da cultura não é recomendada exceder 14 dias. Abaixo estão listados os principais parâmetros e a solução de problemas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL Micro Centrifuge tube	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cells	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin antibody	Abcam	ab231303
Anti-Fade Mounting Medium	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab51608
Biological Safety Cabinet	Nuaire LABGARD	NU-540
Biological Tissue Embedding Machine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Swing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tube	Biofil	CFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Donkey Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	i60
Hematoxylin Bluing Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1004
Hemocytometer	Solarbio	YA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)	PMO Bio	HC1001
Immunohistochemistry (IHC) Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000	Olympus	FV3000	Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary Microtome	Leica	RM2235
Metal Bath	ALLSHENG	MK-3000
Microwave Oven	Galanz
Nail Polish	Lete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)	Beyotime	C0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase Blocking Solution	Beyotime	P0100A
Pipettes	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettes tips	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional Shaker	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Low speed.
Tissue Flotation Water Bath	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypan Blue	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal Antibody	HUABIO	HA720067