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Artigo de método

Produção Rápida de Ribonuclease Humana SLFN14 Recombinante e Análise Estequiométrica por Fotometria de Massa

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DOI:

10.3791/70393

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20 de fevereiro de 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a produção da ribonuclease humana SLFN14 recombinante e sua análise estequiométrica por fotometria de massa.

Resumo

Ribonucleases são uma classe especializada de proteínas de ligação ao RNA que catalisam a clivagem do RNA e contribuem para diversos processos biológicos, incluindo a regulação gênica. No entanto, a estrutura, função e regulação de muitas ribonucleases humanas permanecem pouco caracterizadas devido aos desafios da produção de proteínas recombinantes. Este método descreve uma abordagem eficiente para a expressão transitória, purificação e análise estequiométrica da ribonuclease humana Schlafen 14 (SLFN14). SLFN14 marcado com Flag Recombinante foi expresso em células de suspensão HEK293 e isolado usando um fluxo de trabalho rápido de purificação em duas etapas, consistindo em cromatografia de afinidade anti-Flag seguida de cromatografia de exclusão de tamanho de baixa resolução. A fotometria de massa, uma técnica sensível de molécula única, revelou que, em condições fisiológicas de sal, SLFN14 forma um homodímero estável ligado ao RNA celular, enquanto um alto nível de sal promove a dissociação do RNA enquanto preserva o arranjo de homodímeros. A proteína recombinante humana SLFN14 resultante é adequada para estudos estruturais a jusante e ensaios bioquímicos qualitativos. Essa abordagem rápida para isolamento de proteínas humanas recombinantes e caracterização de amostras é amplamente aplicável à produção de outras ribonucleases de mamíferos e proteínas de ligação a RNA destinadas à caracterização biofísica e bioquímica.

Introdução

Schlafen 14 (SLFN14) é uma ribonuclease pouco estudada e fator de restrição de hospedeiromamífero 1,2,3. A proteína humana SLFN14 pertence a uma família de seis membros reguladores genéticos SLFN, exercendo papéis na imunidade, atividade antiviral, quimiossensibilidade e diferenciação celular 4,5,6,7,8. O entendimento mecanicista sobre o papel dos reguladores genéticos SLFN permanece incompleto; No entanto, muitos membros possuem atividade ribonuclease essencial para o controletranslacional 7,9. As ribonucleases SLFN são ativadas após homodimerização proteica, formando uma fenda composta de ligação ao RNA proficiente na clivagemdo substrato 10,11. Para proteger as células contra clivagem espúrios de RNA, a maioria das ribonucleases SLFN existe predominantemente como monômero e aguarda ativação por sinais moleculares específicos de cada membroda família 5,7,11,12.

A produção recombinante de SLFN14 humano possibilitou estudos moleculares abrangentes dessa ribonuclease anteriormente pouco estudada, fornecendo novos insights sobre sua função eregulação 2,13,14. A proteína recombinante purificada SLFN14 acelerou a caracterização de sua atividade de clivagem de RNA dependente da estrutura usando ensaios in vitro de clivagem deRNA 2,14. Estudos de microscopia eletrônica criogénica (cryoEM) da proteína purificada SLFN14 também revelam um arranjo de homodímeros SLFN14, onde o RNA dupplexado carrega em uma fendacentral 2,13,14. A montagem de ordem superior do SLFN14 foi ainda caracterizada pela fotometria de massa, uma técnica de molécula única para medir massa molecular. Inesperadamente, essa técnica sensível demonstra que SLFN14 forma predominantemente um homodímero resistente ao sal, mas também pode formar um homotetramero sensível ao sal de funçãodesconhecida 2,13,14. Coletivamente, a capacidade de obter proteína purificada humana SLFN14 foi um marco crítico, permitindo insights moleculares precoces que, sem dúvida, impulsionarão uma nova fase empolgante de pesquisa sobre o controle translacional mediado por SLFN14.

A ribonuclease SLFN14 recombinante tem sido historicamente difícil de ser adquirida usando estratégias padrão de produção de proteínas. O relatório original que descrevia a atividade enzimática do SLFN14 observava seu baixo rendimento, diminuição da estabilidade e baixasolubilidade 1. A proteína humana SLFN14 é caracterizada por uma longa cadeia polipeptídica, hidrofobicidade pronunciada e citotoxicidade dependente de ribonuclease, que juntos dificultam amplamente o uso de sistemas convencionais de expressãobacteriana 1,13,14. No entanto, sofisticadas máquinas eucarióticas de tradução e chaperona oferecem uma alternativa poderosa que produz eficientemente a proteína SLFN14 humanade comprimento total 15. Tanto sistemas de expressão de baculovírus-insetos quanto de mamíferos foram empregados para obter proteína SLFN14 humana de comprimento completo para estudos criogénicos e ensaiosbioquímicos 2,13,14. No entanto, em alguns casos, a proteína SLFN14 derivada de insetos exigiu mutações estabilizadoras para evitar a agregação daamostra 2. A entrega genética mediada por baculovírus também está associada a um compromisso substancial de esforço e a um longo prazo de antecedência que atrasa o progresso da pesquisa15,16. Por outro lado, a proteína SLFN14 recombinante isolada de um hospedeiro de expressão mamífero oferece a vantagem da velocidade e evita a necessidade de engenharia proteica na otimização da amostra.

Esse método foi projetado para fornecer uma abordagem relativamente rápida e de baixo esforço para produzir proteína SLFN14 recombinante do tipo selvagem, adequada para estudos moleculares posteriores. O uso de células de mamíferos proporciona um ambiente próximo do nativo para preservar o dobramento adequado das proteínas sem a necessidade de engenharia proteica SLFN1413. Um método de entrega genética baseado em produtos químicos, em oposição à estratégia de vetor viral, também acelera o cronograma de produção de meses para odia 15. Para compensar o custo relativamente alto da cultura celular de mamíferos, esse método utiliza o reagente de transfecção de polietilenimina (PEI) e células de rim embrionário humano 293 (HEK293), eficientes em transfecção, cultivadas emsuspensão 17,18. Para minimizar a perda de proteínas durante o processamento da amostra, esse procedimento também utiliza estratégias de baixo consumo de amostras para purificação de proteínas SLFN14 e análise estequiométrica para controle de qualidade da amostra. Este protocolo de quatro dias fornece detalhes específicos sobre como realizar 1) expressão gênica transitória em células HEK293, 2) um fluxo de trabalho de cromatografia em duas etapas usando colunas de spin, e 3) determinação da estequiometria proteica por fotometria de massa. O produto final desse procedimento é uma proteína humana selvagem SLFN14 que abriga uma tag Myc-Flag C-terminal dupla (SLFN14Myc-Flag) que pode ser utilizada para estudos criogénicos posteriores e caracterização bioquímicaqualitativa 13. Essa abordagem versátil pode ser aplicada para isolar e caracterizar outras proteínas de ligação ao RNA humano pouco estudadas, especialmente grandes e citotóxicos genes de ribonuclease, que frequentemente são difíceis de superexpressar em sistemas de expressão heterólogo. Portanto, esse protocolo reduz a barreira para a caracterização molecular abrangente do proteoma humano.

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Protocolo

Experimentos envolvendo cultura celular de HEK293 devem ser realizados sob condições de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2), de acordo com protocolos institucionais aprovados de biossegurança.

1. Expressão transitória doMyc-Flag de SLFN14 em células de mamíferos

  1. Células de suspensão de HEK293 de mamíferos semente a 0,5 x 106 células/mL em meio de crescimento pré-aquecido e sem soro, para um volume final de 320 mL em um frasco de 1 L ventilado e com defletores.
  2. Incube as células a 37 °C, 125 rpm, 8% de CO2, 75-80% de umidade por 24-32 horas.
  3. Verifique se a contagem de células é 1,2-1,8 x 106 células/mL e a viabilidade é superior a 90% usando a coloração com tripan blue e um contador de células19.
  4. Decante 40 mL de cultura em oito tubos cônicos.
  5. Colhe as células por centrifugação a 400 x g por 5 minutos a 20-25 °C.
  6. Descarte o meio de crescimento.
  7. Ressuspenda suavemente cada pellet celular em 38 mL de meio de transfecção pré-aquecido e sem soro, para um volume final de 304 mL.
    NOTA: Os 16 mL restantes do volume original de cultura descrito no passo 1.1 serão fornecidos pela mistura de transfecção descrita no passo 1.12.
  8. Transfira as células para um novo frasco ventilado de 1 L com defletores.
  9. Em um tubo cônico, adicione 320 μg de DNA plasmídico purificado que codifica o generecombinante SLFN14 Myc-Flag a 8 mL de meio de transfecção sem soro e incube por 5 minutos a 20-25 °C.
    NOTA: A concentração de plasmídeos é tipicamente de 500 ng/μL em volume final de 640 μL.
  10. Simultaneamente ao passo 1.9, adicione 960 μg de PEI esterilizado com filtro de 0,22 μm a 8 mL de meio de transfecção sem soro e incube por 5 minutos a 20-25 °C.
    NOTA: O material de trabalho é tipicamente de 1 mg/mL em volume final de 960 μL.
  11. Adicione lentamente a mistura PEI (veja passo 1.10) gota a gota à solução de DNA plasmídico recombinante (veja passo 1.9) e incube por 15 minutos a 20-25 °C.
  12. Adicione lentamente 16 mL da mistura de DNA/PEI em gota às células preparadas na etapa 1.8.
  13. Incube as células a 37 °C, 125 rpm, 8% de CO2, 75-80% de umidade por 48 horas.
  14. Decante 40 mL de células transfectadas em oito tubos cônicos.
  15. Colhe as células transfectadas por centrifugação a 400 x g por 5 minutos a 20-25 °C.
  16. Decante o sobrenadante e armazene os oito pellets celulares a -80 °C.

2. Purificação recombinante em dois passos comSLFN14 Myc-Flag

  1. Cromatografia de afinidade anti-bandeira.
    Execute o protocolo de cromatografia de afinidade anti-Flag em duplicidade, usando quatro pellets celulares do passo 1.16 para cada preparação.
    1. Preparação de Resina.
      1. Equilibre a resina de agarose anti-Flag a 20-25 °C por 15 minutos.
      2. Ressuspenda suavemente a resina invertendo a garrafa imediatamente antes de transferir 40 μL de uma mistura de resina a 50% para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
        NOTA: Corte a ponta da pipeta para coletar facilmente a pasta viscosa.
      3. Resuspenda a resina em 1 mL de tampão de lavagem de alto sal, (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Incube por 45 minutos a 4 °C.
      5. Centrifuge a pasta de resina a 8.000 x g por 2 minutos a 4 °C.
      6. Aspire e descarte o tampão de lavagem de alto sal, tomando cuidado para não atrapalhar a resina.
    2. Esclarecimento sobre lisado celular.
      1. Resuspenda cada pellet celular transfectado com 225 μL de Tampão de Resuspensão resfriado (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,5% Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL de Leupeptina, 1 mM de Benzamidina, 0,7 μg/mL de Pepstatina A, 0,25 U/mL de nuclease Genius) para um volume total de 900 μL em quatro pellets celulares.
      2. Transfira as células para um tubo microcentrífuga de 2 mL que foi pré-resfriado no gelo.
      3. Incube o tubo da microcentrífuga horizontalmente sobre um nutator por 30 minutos a 4 °C.
        NOTA: Armazene uma alíquota de 20 μL de lisado total a -20 °C para diagnóstico em caso de baixa expressão proteica.
      4. Clarifique o lisado celular por centrifugação a 21.300 x g por 20 min a 4 °C.
    3. Captura e Lavagem por Afinidade de Proteína.
      1. Combine o lisado clarificado (veja o passo 2.1.2.4) com a resina anti-Flag equilibrada (veja o passo 2.1.1.6).
      2. Incube a mistura lisato-resina em um tubo microcentrífuga posicionado horizontalmente sobre um nutator por 60 minutos a 4 °C.
      3. Centrifuge a mistura lisato-resina a 8.000 x g por 2 minutos a 4 °C para formar um pellet de resina.
      4. Descarte aproximadamente 700 μL de sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a cápsula de resina.
        NOTA: Armazene uma alíquota de 20 μL de sobrenadante a -20 °C após a ligação da resina para diagnóstico em caso de baixa eficiência de captura.
      5. Resuspenda a mistura restante de resina e supernadante e transfira a solução para uma coluna de spin vazia com capacidade de 800 μL, que foi inserida em um tubo vazio de microcentrífuga de 2 mL.
      6. Centrifuge a coluna de spin a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo.
      7. Enxágue o tubo vazio da microcentrífuga do passo 2.1.3.5 com 500 μL de tampão de lavagem de alto sal, e transfira a solução para a coluna de spin.
        NOTA: Esta etapa ajuda a recuperar qualquer resina residual restante no tubo da microcentrífuga.
      8. Centrifuge a coluna de spin a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo.
      9. Adicione 500 μL de tampão de lavagem de alta qualidade de sal à coluna de spin. Centrifuge a coluna de spin a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo. Repita essa etapa para um total de quatro lavagens com alto teor de sal.
      10. Adicione 500 μL de Low Salt Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20) à coluna de spin. Centrifuge a coluna de spin a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo. Repita esse passo para um total de duas lavagens com baixo teor de sal.
      11. Adicione 500 μL de Tampão de Lavagem ATP (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 10 mM ATP) à coluna de spin. Tampe a parte inferior da coluna de spin e incube por 5 minutos a 4 °C. Desligue a coluna de rotação e a centrífuga a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo. Repita essa etapa para um total de quatro lavagens de ATP.
      12. Realize uma lavagem final adicionando 500 μL de Low Salt Wash Buffer à coluna de spin. Centrifuge a coluna de spin a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo.
    4. Elução de proteínas pelo peptídeo 3xFlag.
      1. Limpe a parte inferior da coluna de centrifugação com uma lanche de baixo fiapo para remover o excesso de líquido e tampar a parte inferior da coluna de centrifugação.
      2. Adicione 55 μL de 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptide) diretamente sobre a resina.
      3. Sele a abertura da coluna de spin com parafilme e coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      4. Incube a coluna de spin verticalmente sobre um nutator por 60 minutos a 4 °C.
        NOTA: Para manter a coluna de rotação vertical, monte um suporte de tubos de microcentrífuga no nutator com elásticos.
      5. Remova o parafilme e o plugue da coluna de rotação. Colete a proteína recombinante eluída SLFN14Myc-Flag em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,7 mL por centrifugação a 1.000 x g por 2 minutos a 4 °C.
      6. Manter 50 μL de eluato de resina anti-Flag para cromatografia de exclusão de tamanho subsequente e 5 μL para análise SDS-PAGE.
  2. Cromatografia por Exclusão de Tamanho.
    Realize o protocolo de cromatografia de exclusão de tamanho usando o Low Salt Desalting Buffer (150 mM NaCl) para análise padrão deproteína Myc-Flag de SLFN14 ou o High Salt Desalting Buffer (500 mM NaCl) para caracterização apo SLFN14Myc-Flag .
    1. Combine dois eluados de resina anti-Flag de 50 μL do passo 2.1.4.6 para um total de amostra de 100 μL.
    2. Prepare uma coluna de dessalinização por spin de 0,5 mL com corte de peso molecular de 40 kDa afrouxando a tampa, removendo o fecho inferior e inserindo a coluna em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
    3. Centrifuge a coluna de dessalinização de rotação a 700 x g por 1 min a 4 °C para remover a solução de armazenamento da coluna. Descarte o fluxo contínuo.
    4. Adicione 300 μL de tampão de dessalinização de baixo ou alto teor de sal (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mMMgCl 2, 1 mM TCEP) à coluna de dessalinização de spin. Centrifuge a coluna de rotação a 700 x g por 1-2 minutos a 4 °C e descarte o fluxo contínuo. Execute essa etapa três vezes para equilibrar completamente a coluna.
    5. Limpe a base da coluna de dessalinização com um lenço de fiapo baixo.
    6. Transfira a coluna de dessalinização de spin para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,7 mL.
    7. Adicione 100 μL de eluato combinado de resina anti-Flag (veja o passo 2.2.1) ao centro da cama da coluna sem interromper a resina.
    8. Elute a proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 centrifugando a coluna de dessalinização de spin a 700 x g por 2 minutos a 4 °C.
    9. Manter 95 μL da proteína recombinante recuperada para caracterização molecular e 5 μL para análise SDS-PAGE.
  3. Caracterizar a amostra purificada de proteína recombinante SLFN14Myc-flag .
    1. Realize eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).
      1. Combine 5 μL de 2x tampão de amostra de Laemmli com 5 μL de alíquotas coletadas em estágios distintos ao longo do protocolo de purificação.
      2. Aqueça as amostras a 95 °C por 5 minutos.
      3. Resolva uma escada proteica de ampla faixa junto com 10 μL de mistura tampão de amostra-Laemmli por 4-15% de SDS-PAGE a 200V por 30 minutos.
      4. Visualize as bandas proteicas tingindo o gel com solução de coloração Coomassie G-250 por 30 minutos em um agitador orbital e desanime o gel com água desionizada em um agitador orbital até que o fundo fique claro.
      5. Inspecione as faixas de proteínas resultantes para garantir que a amostra recuperada do passo 2.2.9 seja uma única faixa proteica que corresponde ao peso molecular teóricodo SLFN14 Myc-Flag de 107,5 kilodalton (kDa).
    2. Quantifique proteínas e ácidos nucleicos por espectrofotometria UV/vis.
      1. Apague um espectrofotômetro de microvolume com 2 μL de tampão de dessalgação de baixo ou alto sal, correspondendo ao tampão de armazenamento de proteínas.
      2. Meça a absorção em 260 nm e 280 nm a partir de 2 μL da proteínarecombinante Myc-Flag SLFN14 recuperada (veja passo 2.2.9) usando um espectrofotômetro de microvolume.
      3. Calcule a concentração da proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 usando a absorção registrada em 280 nm e seu coeficiente de extinção (93330 M-1 cm-1) usando a Leide Beer-Lambert 20.
      4. Calcule a razão de absorção da amostra A260/280 dividindo o valor de absorção registrado em 260 nm pelo valor de absorção medido em 280 nm para determinar se o ácido nucleico está co-purificando com a proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14.
        NOTA: Uma razão A260/280 acima de 0,7 provavelmente indica a presença de ácidonucleico 21.
    3. Quantifique o RNA Celular por Fluorometria.
      1. Quantifique o conteúdo de RNA usando 1-3 μL de proteína recombinante recuperada da etapa 2.2.9 usando um corante fluorescente específico deRNA de alta sensibilidade 22.

3. Análise da massa molecularde SLFN14 Myc-Flag por fotometria de massa

  1. Configuração do Instrumento do Fotômetro de Massa.
    1. Ligue o laser usando o interruptor na parte de trás da caixa eletrônica do fotômetro de massa.
    2. Ligue o deck de isolamento e clique no botão "isolamento" para minimizar as vibrações dos instrumentos.
    3. Abra o software AcquireMP.
    4. Espere 1 hora para o instrumento atingir o equilíbrio térmico.
  2. Preparação para o Slide de Cobertura.
    1. Segure uma tampa de vidro deslizante em posição vertical usando uma pinça de ponta macia.
    2. Enxágue ambos os lados da lâmina da tampa de vidro com água ultrapura Tipo I seguida de álcool isopropílico. Repita esse passo por um total de três vezes.
    3. Enxágue cada lado da lâmina da tampa de vidro uma última vez com água ultrapura Tipo I por 45 segundos.
    4. Remova suavemente o excesso de gotas de água da tampa do vidro por aspiração usando uma ponta de pipeta limpa conectada a uma linha de vácuo.
    5. Armazene a lâmina de vidro limpa em uma caixa plástica forrada com papel de lente para transporte até o fotômetro de massa.
  3. Monte o ferrolho da tampa no instrumento.
    1. Coloque uma junta de silício de 6 poços na ferramenta de alinhamento metálica usando uma pinça de ponta macia.
    2. Coloque a tampa de vidro limpa do passo 3.2.5 sobre a vedação de silicone e use a pinça de ponta macia para pressionar levemente ao redor da junta de silicone.
      NOTA: Não aplique pressão sobre os poços de amostragem.
    3. Coloque uma gota de óleo de imersão no óculo do fotômetro de massa.
    4. Vire o ferrolho da tampa de vidro para que a vedação de silicone fique apontando para cima e coloque delicadamente o deslizador da tampa de vidro sobre o oculus usando pinças de ponta macia.
    5. Fixe os cantos superior esquerdo e inferior direito do slide da tampa de vidro usando ímãs.
    6. Sob controle lateral, selecione o poço superior esquerdo no software AcquireMP para alinhar o laser com o centro do poço.
  4. Analise padrões proteicos de ampla faixa de dados.
    1. Prepare uma solução calibrante de 50x ampla faixa (90 kDa por 1 MDa) diluindo 1 μL de um estoque calibrante 500x em 9 μL 1x soro tamponado com fosfato.
    2. Prepare um material de trabalho calibrante 5x combinando 2 μL da solução calibrante de 50x ampla faixa do passo 3.4.1 em 18 μL 1x soro tamponado com fosfato.
    3. Adicione 10 μL de tampão de dessalinização filtrado de baixo ou alto teor de sal de 0,22 μm no poço vazio.
      NOTA: É importante comparar o buffer filtrado nesta etapa com o buffer usado para preparar a amostraMyc-Flag SLFN14 na etapa 2.2.9.
    4. Feche a tampa.
    5. Em Buscar foco, clique em "diluição de gotas" no software AcquireMP para determinar o foco correto do poço da amostra.
    6. Adicione 10 μL do material de trabalho calibrante 5x à gota tampão (veja o passo 3.4.3) e faça uma pipete suave para cima e para baixo para misturar a solução.
    7. Feche a tampa.
    8. Examine as configurações do instrumento para confirmar que os valores de movimento, sinal, saturação e nitidez estão estáveis e ideais.
      NOTA: Valores ótimos aparecerão azuis, e os valores atípicos são coloridos de laranja.
    9. Clique em "gravar" no software AcquireMP para gravar um vídeo de 60 segundos.
    10. Salve o arquivo de resultado (.mpr) com um título descritivo e carimbo de data.
  5. Crie uma curva de calibração.
    1. Abra o software DiscoverMP.
    2. Na seção de medições, clique no botão "+ abrir" e navegue até o arquivo de resultados do calibrante a partir do passo 3.4.10.
    3. Clique duas vezes no arquivo listado de padrões proteicos para ver os resultados.
    4. Na configuração do gráfico, ajuste os limites de contraste para 0,00000 e -0,03000, respectivamente.
    5. Defina manualmente uma curva Gaussiana para os quatro primeiros picos padrão de proteína, arrastando o cursor por cada pico individual.
    6. Clique em "Criar" e selecione "calibração de massa".
    7. No cabeçalho do calibrante, atribua a cada pico calibrante ajustado do passo 3.5.5 à sua massa molecular conhecida de 86, 172, 258 e 344 kDa, respectivamente.
    8. Verifique se a curva de calibração tem umR2 próximo a 1,0 e um erro máximo de massa (MME) inferior a 2%.
    9. Clique em "confirmar calibração" e salve o arquivo da curva de calibração (.mc).
      NOTA: O fotômetro de massa deve ser recalibrado a cada hora.
  6. Analise a proteínaMyc-flag recombinante SLFN14 em condições de baixo e alto teor de sal.
    1. Prepare uma solução de 50 μL de proteína recombinante SLFN14Myc-Flag de 50 nM (veja o passo 2.2.9) usando Low Salt Desalting Buffer para análise padrão da amostra sob condições fisiológicas de sal ou High Salt Desalting Buffer para caracterização da amostra de proteína apo.
    2. Centrifuge a mistura proteica recombinante SLFN14Myc-Flag de 50 nM a 21.300 x g por 10 minutos a 20-25 °C para remover agregados proteicos potenciais e poeira.
    3. Sob controle lateral, clique em "poço próximo" no software AcquireMP.
    4. Coloque 10 μL de tampão de dessalinização de baixo ou alto sal, filtrado de 0,22 μm, no poço e feche a tampa.
      NOTA: É importante comparar o buffer filtrado nesta etapa com o buffer usado para preparar a diluição daamostra Myc-Flag do SLFN14 na etapa 3.6.1.
    5. Em encontrar foco, clique em "diluição de gotículas" para determinar o foco correto do novo poço da amostra.
    6. Carregue 10 μL da solução proteica recombinante de 50 nMde proteína Myc-Flag SLFN14 do passo 3.6.2 até a gota tampão e pipete suavemente para misturar a amostra.
    7. Feche a tampa e garanta as configurações ideais do instrumento conforme descrito no passo 3.4.8.
    8. Clique em "gravar" no software AcquireMP para gravar um vídeo de 60 segundos.
      NOTA: A resolução de massa ideal é alcançada a partir de um vídeo de 60 segundos com aproximadamente 1.000 a 4.000 contagens totais.
    9. Salve o arquivo de resultado (.mpr) com um título descritivo e carimbo de data.
  7. Calcule a massa molecular e a estequiometria da proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14.
    1. Na seção de medições dentro do software DiscoverMP, clique no botão "+ abrir" para selecionar o arquivo de resultado da etapa 3.6.9.
    2. Em calibrações, clique duas vezes no arquivo da curva de calibração criado no passo 3.5.9 para aplicar a calibração.
    3. Defina manualmente uma curva Gaussiana para cada espécie observada de SLFN14Myc-Flag , arrastando o cursor por cada pico para obter um valor calculado de massa molecular.
    4. Calcule a massa molecular média de cada espécie oligomérica a partir de três medições independentes, juntamente com seu desvio padrão correspondente.
    5. Determine a estequiometria da proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 avaliando a massa molecular média calculada com inteiros do valor teórico de massa do protómeroMyc-Flag SLFN14.
      NOTA: A massa teórica de um monômeroMyc-Flag de SLFN14 é de 107,5 kDa, de um dímero de 215 kDa, de um trimer de 322,5 kDa, e de um tetramero de 430 kDa.

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Resultados

Um vetor mamífero projetado para expressão gênica transitória da proteína recombinante humana SLFN14Myc-Flag de comprimento total é ilustrado na Figura 1. Um fluxo de trabalho de purificação em duas etapas mostra o isolamento da proteínaMyc-Flag de SLFN14 a partir das células HEK293 (Figura 2A). Um gel representativo desnaturalizante bem-sucedido da proteínaMyc-Flag purificada de SLFN14 é mostrad...

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Discussão

Vários passos críticos ressaltam o desempenho e a versatilidade desse protocolo de produção de proteínas. Para maximizar o rendimento de proteínas recombinantes, utilizamos células HEK293 que possuem alta absorção de DNA plasmídico estranho e podem ser cultivadas em suspensão para maximizar a densidade celular em todo o volume23 do meio. O reagente de transfecção PEI é utilizado neste protocolo de entrega de transgenes em grande escala porque pode alcançar alta ef...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório Pillon pela leitura crítica deste manuscrito. Esse trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Extramural do Instituto Nacional de Saúde dos EUA, pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS; R35GM147123 para M.C.P.) emitido para o Baylor College of Medicine e transferido para a State University of New York em Buffalo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-mercaptoetanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M soluções tack
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Software de aquisição de dados
Adenosina-5'-trifosfato sal dissódico triidrato (ATP)Chem-Impex International00015-100Gajustar a solução para pH 7,0
Gel de afinidade anti-Flag M2MilliporeA2220Resina de afinidade anti-bandeira
Hidrato de cloridrato de benzamidinaSigmaB6506-25GInibidor de protease
Padrões de proteína de ampla faixa (10-250 kDa)Bio-RadP7719SPadrões de proteína prestained
Condessa 3InvitrogenA49862contador automático de células
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Software de análise de dados
Soro tampão fosfatado de DulbeccoCorning21-031-CVCoronha solução 1x
Peptídeo DYKDDDKThermo Fisher ScientificA36805Peptídeo 3xFlag
Células FreeStyle 293-FThermo Fisher ScientificR79007Células de suspensão de mamíferos
Nuclease Geniust M DMF arquivadaSanta CruzSC-391121BNuclease universal
HyClone CDM4HEK293 mídiaCytivaSH3085802Meio de crescimento sem soro
Mídia HyClone SFM4Transfx-293CytivaSH3086002Meio de transfecção transitório
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Óleo de imersão
Álcool isopropílicoMacron Fine Chemicals3032-02
Buffer de amostras de LaemmliBio-Rad1610737Coronha de solução 2x
LeupeptinVWRJ580-25MGInibidor de protease
Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033Coronha calibrante 500x
Kit de preparação de amostras UC da MassGlassRefeynMP-CON-21022Ferrolho e Junta
Coluna micro biospinBio-Rad7326204Coluna vazia de spin de polipropileno
Sistema Milli-Q IQ 7000MilliporeZIQ7000T0CÁgua ultrapura tipo I
Mini géis TGX Protean sem manchasBio-Rad45680864-15% SDS-PAGE
Minitron com umidade, resfriamento e CO2Infors72175Shaker incubador
Kit de alinhamento MPRefeynMP-CON-21019ferramenta de alinhamento, pinça de ponta macia, ímã
NanofotômetroImpleteNP80Espectrofotômetro UV-vis
NutatorClay Adams Brand421105
Pepstatina ASanta CruzSC-45036BInibidor de protease
Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)Produtos de Pesquisa InternacionalP20270-25.0Inibidor de protease
Frasco de shake de policarbonato  Duran Wheaton KimbleWPFBC1000Sfrasco de base ventilado e defletido
Polietilenemina (PEI) MW 40.000Policiências24765reagente de transfecção
Fluorômetro Qubit 4Thermo Fisher ScientificQ33226
Kit de ensaio de alta sensibilidade para RNA QubitThermo Fisher ScientificP32852quantificação usando corante específico de RNA
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
DNA plasmídico de expressão de SLFN14OrígenesRC226257clone ORF marcado por humanos
Cloreto de sódio (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K2Material de solução bufferizado de 1 M
Tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina (TCEP)Biotecnologia do OuroTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldetergente
Coloração azul de TripanThermo Fisher ScientificT102820,4% ações de solução
Tween 20VWR0777-1Ldetergente
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Fotômetro de massa
Coluna Zeba 40K DesaltinThermo Fisher ScientificA57759Cromatografia de exclusão de tamanho

Referências

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