Artigo de método

Mapeamento da morfologia das células estreladas hepáticas em modelos camundongos de fibrose hepática

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 de fevereiro de 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia das células estreladas hepáticas em tecido hepático intacto. Essa abordagem combina marcação fluorescente de fibroblastos usando genética de camundongos, preparação de tecidos baseada em perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza de tecidos iDISCO para alcançar transparência óptica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroblastos residentes no tecido são os motores celulares da fibrose em vários tecidos. Dentro do fígado, as células estreladas hepáticas (HSCs), os pericitos residentes com sua morfologia única "em forma de estrela", ativam-se em miofibroblastos fibrogênicos durante a lesão para produzir a cicatriz hepática. Embora décadas de trabalho tenham elucidado as principais vias de sinalização subjacentes à ativação do HSC, a importância funcional de sua morfologia dendrítica distinta permanece difícil de alcançar devido a limitações técnicas em imagem e análise. Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia do HSC em tecido hepático intacto. Essa abordagem combina marcação fluorescente de HSCs usando genética de camundongos, preparação de tecidos baseada em perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza de tecidos iDISCO para alcançar transparência óptica em amostras de tecido que podem ter vários centímetros de espessura. Amostras liberadas são imagens usando plataformas otimizadas de microscopia confocal, e conjuntos de dados de imagens são processados por meio de um fluxo de trabalho personalizado para reconstrução tridimensional de HSCs individuais em resolução de célula única. Juntos, esse pipeline permite o mapeamento reprodutível da morfologia dos HSC dentro do complexo microambiente hepático, incluindo seus processos dendríticos e relações espaciais com células vizinhas. Além do fígado, o fluxo de trabalho é adaptável a fibroblastos em outros órgãos, como pulmão, rim, intestino e coração, onde as células mesenquimatosas residentes apresentam papéis fibrogênicos semelhantes na doença. Portanto, o quadro proposto estabelece uma base metodológica para estudos comparativos entre órgãos a fim de investigar as relações estrutura-função dos fibroblastos e as vulnerabilidades terapêuticas em doenças fibróticas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fibrose, ou cicatrizes patológicas de tecidos, é o último caminho comum para quase todas as doenças crônicas de órgãos e contribui para aproximadamente 40% das mortes em paísesindustrializados. No fígado, a fibrose surge de insultos crônicos como hepatite viral, uso de álcool ou, cada vez mais, doença esteatótica associada a disfunção metabólica (MASLD), que atualmente afeta de 30 a 40% dos adultos nos EUA. Insultos crônicos ao fígado e a fibrose progressiva resultante aumentam drasticamente o risco de doenças hepáticas em estágio terminal, como cirrose, insuficiência hepática e carcinomahepatocelular 2. 3,4,5.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são centrais para a homeostase hepática e a fibrogênese. Em fígados saudáveis, os HSCs existem em estado de reposo, armazenando vitamina A, e contribuem para a homeostase dos hepatócitos e, no geral, de todo ofígado 6,7. Isso é claramente demonstrado por estudos de depleção de HSCs, onde a remoção de quase todos os HSCs no fígado saudável diminui a massa hepática e limita severamente a regeneração 7,8. Após a lesão, os HSCs se ativam em células semelhantes a miofibroblastos que proliferam, migram para áreas danificadas e produzem matriz extracelular (ECM) excessiva, formando cicatrizes fibróticas. Os HSCs ativados em fígados fibróticos também são a fonte de fibroblastos associados ao câncer e desempenham papéis promotores tumorais no carcinomahepatocelular 9,10,11,12. As HSCs em quiescente possuem uma morfologia única semelhante à neurônica, com pequenos corpos celulares a partir dos quais se estendem projeções de longo alcance. Os HSCs mudam para uma forma plana, semelhante a uma folha, de miofibroblastos quando ativados na fibrose13. Embora décadas de trabalho tenham elucidado as vias de sinalização que controlam a produção de ECM pelos HSCs, o significado funcional de sua morfologia neuronal distinta, como ela é regulada, se poderia facilitar interações dentro do nicho dos HSCs e contribuir para a fibrogenicidade e doença dos HSCs permanecemelusivas 14,15.

Os métodos atuais para visualizar a morfologia dos HSCs são limitados a imagens bidimensionais (2D) de células cultivadas in vitro ou seções de tecido in vivo , e raramente capturam toda a morfologia dos HSCs com projeções que estendem vários comprimentos do corpo celular em todas as direções. Além disso, o marcador HSC mais comumente utilizado, a desmina, não consegue capturar totalmente a morfologia neurônica única dos HSCs na coloração por imunofluorescência, pois a desmina é uma proteína do citoesqueleto que marca apenas filamentos intermediários dentro dosHSCs 16. Esses desafios metodológicos até então dificultaram a capacidade de capturar completamente a morfologia dos HSC e suas interações celulares de forma tridimensional (3D) em seu contexto natural com resolução de célula única. Como resultado, questões fundamentais sobre como a morfologia dos HSC se relaciona com seu estado funcional e interações com tipos celulares vizinhos permaneceram sem solução.

Este artigo apresenta um pipeline inovador e abrangente de imagem e análise para visualizar e modelar a morfologia dos HSCs em tecido hepático intacto. Esse método integra várias inovações chave: (1) marcação fluorescente de HSCs usando modelos genéticos de camundongos repórteres, (2) otimização da perfusão e fixação in situ do fígado para preservar a arquitetura tecidual intacta e as relações celulares, (3) um protocolo modificado de limpeza de tecidos baseado em iDISCO para alcançar transparênciaóptica 17, (4) microscopia confocal de alta resolução para captura de imagens profundas, e (5) um fluxo de trabalho computacional personalizado para reconstrução de imagens 3D e quantitativa análise de HSCs individuais. O protocolo impõe certas restrições sobre o tamanho do tecido e o tempo que precisam ser levadas em consideração. Juntos, esse protocolo fornece uma estrutura robusta e reprodutível para capturar a complexa estrutura 3D dos HSCs e para mapear suas relações espaciais com células vasculares, imunes e parênquimas vizinhas. As estratégias e pipelines apresentados aqui para o fígado também são facilmente adaptáveis a outrosórgãos 17,18,19.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos com camundongos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Escola de Medicina Icahn do Mount Sinai. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Geração de camundongos com HSCs marcados com tdTomato (TdT)

  1. Crie criadores de Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (cepa #00791420 dos Laboratórios Jackson e Cepa #06959521-JAX do Centro de Recursos e Pesquisa de Ratos Mutantes (MMRRC), respectivamente).
    NOTA: Espere areia após 3 semanas. Use fêmeas de LratCre para reprodução, pois alguma expressão de Cre foi detectada na linhagem germinativa dos machos.
  2. Coletar caudas e a ninhada do genótipo F1 para identificar Tg(Lrat:Cre); Camundongos Tg(LSL-TdT) que expressam seletivamente o fluoróforo TdTomato em células estreladas hepáticas.

2. Perfusão e fixação hepática in situ

  1. Configuração pré-cirúrgica
    1. Prepare uma mistura de cetamina/xilazina para anestesia de camundongos misturando 2 mL de cetamina, 1 mL de xilazina e 7 mL de água.
      NOTA: A cetamina é uma substância controlada e requer licenciamento e regulamentação adequados para uso laboratorial.
    2. Prepare a solução de perfusão de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x Soro Tamponado com Fosfato (PBS).
    3. Configure a bomba peristáltica permitindo que 1x PBS flua pelo tubo e ajuste a vazão em 2 mL/min.
      NOTA: Certifique-se de que não haja bolha de ar no tubo.
  2. Pese o rato para determinar a quantidade da mistura de cetamina/xilazina a ser injetada.
  3. Injete a mistura de cetamina/xilazina intraperitonealmente no camundongo.
    NOTA: Injete 200 μL da mistura para cada 20 g de peso do camundongo.
  4. Coloque o rato em um recipiente com tampa e espere aproximadamente 20 minutos para que ele seja totalmente anestesiado.
    NOTA: Belisque o dedo do rato para verificar a ausência de reflexo. Certifique-se de que o camundongo ainda esteja vivo quando a perfusão começar.
  5. Transfira o rato do recipiente de vidro para a plataforma cirúrgica em posição supina.
    ATENÇÃO: A PFA é tóxica e volátil; Portanto, realize o procedimento de perfusão em um capuz químico. Coletar e descartar corretamente o fluxo de PFA conforme as diretrizes institucionais de biossegurança.
  6. Aperte as palmas do pé do rato com pinças para garantir que ele não tenha movimentos reflexos ou espasmos.
  7. Espetar 4 palmas com agulhas para abrir o abdômen do rato.
  8. Borrife o abdômen com etanol 70% para molhar o pelo.
  9. Use pinças para levantar a pele no meio do abdômen, alinhar com as patas traseiras e começar a cortar a pele (ambas as camadas) para revelar o abdômen.
  10. Use cotonetes úmidos com PBS para mover intestinos e outros órgãos para o lado e levantar o lobo esquerdo.
  11. Corte cuidadosamente a membrana presa entre o lobo esquerdo e o lobo caudado.
  12. Use um ponto para amarrar na base superior do lobo esquerdo.
  13. Corte o lobo esquerdo abaixo do nó de sutura e reserve o lobo esquerdo para coleta e processamento de amostras de tecido, dependendo das necessidades experimentais (como congelamento direto em nitrogênio líquido, incorporação em composto de Temperatura Óptica de Corte (OCT) ou fixação de formalina).
  14. Use cotonetes úmidos com PBS para mover o fígado e revelar a veia porta.
  15. Insira cuidadosamente a agulha do cateter na veia porta aproximadamente na metade do comprimento da veia porta.
    NOTA: Para auxiliar na inserção do cateter, levante o corpo do rato colocando uma pinça sob o corpo para garantir uma superfície mais plana. Alinhe cuidadosamente a agulha do cateter o mais paralela possível à veia porta antes da inserção.
  16. Remova a agulha do cateter.
    NOTA: Garanta um retorno de sangue pelo cateter para indicar a inserção bem-sucedida.
  17. Ligue a bomba de perfusão com uma vazão de 2 mL/min, conecte o tubo ao cateter e perfunda o fígado com 20 mL de PBS 1x.
    NOTA: Certifique-se de que o cateter esteja completamente cheio de sangue e que o tubo esteja completamente cheio com o buffer de perfusão, antes de conectá-los para garantir que nenhuma bolha de ar seja introduzida no sistema.
  18. Clampe a artéria pulmonar acima do fígado com um hemostado para impedir que o PBS 1x passe pelo coração.
  19. Corte a veia cava inferior para liberar o acúmulo de pressão.
  20. Ajuste a velocidade da bomba para 5 mL/min.
    NOTA: Deixe aproximadamente 15 minutos para terminar a perfusão.
  21. Pare a bomba para trocar o reservatório para 4% de PFA.
    NOTA: Certifique-se de não introduzir bolhas de ar no tubo parando a bomba quando ainda houver líquido no reservatório.
  22. Perfunde o fígado com 25 mL de PFA a 4%.
  23. Após a perfusão estar concluída, remova o fígado dos órgãos ao redor cortando os tecidos conectados.
  24. Coloque o fígado em um tubo cônico de 50 mL, preenchido com 25 mL de PFA a 4%.
  25. Coloque o tubo horizontalmente sobre uma plataforma de balanço por 1 hora em temperatura ambiente a 1,5 rpm, para garantir o movimento da solução.
  26. Lave o fígado 3 vezes em 1x PBS em uma plataforma de balanço de banco por 30 minutos cada em temperatura ambiente, a 1,5 rpm.
  27. Armazene o fígado em 20 mL 1x PBS com 0,02% deNaN 3 a 4 °C.
    NOTA: Armazene o fígado a longo prazo nesta fase, até pelo menos um ano.

3. Limpeza de tecidos baseada em iDISCO+

NOTA: A descrição original do protocolo iDISCO+ está acessível em 17

Dia 1: Desidratação da amostra

  1. Corte as amostras de fígado em pedaços com tamanhos aproximadamente 0,5-1cm 3.
    NOTA: Corte diferentes amostras em formatos diferentes para facilitar a detecção durante as etapas de imagem.
  2. Prepare diluições de metanol 20% (vol/vol), 40%, 60% e 80% em água em garrafas de vidro separadas.
  3. Coloque amostras de fígado em frascos de vidro com tampas roscadas (por exemplo, 4-7 mL).
    NOTA: Coloque até 6 pedaços de amostra de fígado em um frasco de vidro de 7 mL.
  4. Desidrate a amostra usando a diluição de metanol na sérieH2O, 20% (vol/vol), 40%, 60% e 80% por 1 hora cada em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  5. Lave a amostra com outro metanol 100% em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação por 1 hora em temperatura ambiente.
  6. Resfrie a amostra a 4 °C por 30 minutos a 1 hora.
  7. Prepare diluições DCM a 66% (vol/vol) em metanol em um frasco de vidro.
    NOTA: Prepare novas diluições toda vez. Use cilindros de vidro para preparar a solução, pois o DCM pode dissolver plástico, como o poliestireno.
  8. Incube amostras em solução de DCM/metanol a 66% durante a noite em um rotador de roda a 8 rpm em temperatura ambiente, sem centrifugação ocorrendo.
    NOTA: Cuidado com amostras flutuando para o topo assim que a solução for adicionada.

Dia 2: Amostra de branqueamento

  1. Lave a amostra duas vezes com metanol 100% em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação por 1 hora a cada vez em temperatura ambiente.
  2. Resfrie a amostra a 4 °C por 30 minutos a 1 hora.
  3. Branqueie a amostra em 5% deH2O 2 refrigerado em metanol (1 volume de 30%H 2O2 a 5 volumes de metanol), em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação ocorrendo, a 4 °C durante a noite.
    NOTA: Prepare uma nova solução toda vez.

Dias 3-5: Permeabilização da amostra

  1. Reidratar com metanol/H2O series: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  2. Lave a amostra duas vezes em PTx.2 (Tabela 1) por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  3. Incube as amostras na Solução de Permeabilização (Tabela 1) a 37 °C por 2 dias.

Dias 5-17: Imunomarcação

  1. Bloqueie as amostras em Solução de Bloqueio (Tabela 1) por 2 dias a 37 °C.
    NOTA: Prepare uma solução bloqueante nova toda vez devido à instabilidade do soro de burro. Armazene a solução bloqueadora restante a 4°C por até 1 mês.
  2. Incubar as amostras em anticorpos primários diluídos em PTwH (Tabela 1) com 5% de DMSO e 3% de Soro de Burro a 37 °C em um rotador de roda a 5 rpm, sem ocorrer centrifugação por 4 dias.
    NOTA: Comece com uma diluição primária de anticorpos de 1:500.
  3. Lave as amostras em PTwH 4-5 vezes por 1 hora cada em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação ocorrendo.
    NOTA: Opcionalmente, deixe as amostras para lavar durante a noite.
  4. Incubar as amostras em anticorpos secundários e iodeto de propidium diluído em PTwH com soro de burro a 37 °C em um rotador de roda a 5 rpm, sem ocorrer centrifugação por 4 dias.
    NOTA: Comece com uma diluição secundária de anticorpos 1:500. Use uma diluição de iodeto de propidium 1:250 a partir de uma solução de caldo de iodeto propidiano de 5 mg/mL.
  5. Lave as amostras em PTwH 4-5 vezes por 1 hora cada em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação ocorrendo.
  6. Deixe a amostra lavada em PTwH durante a noite, em temperatura ambiente, em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.

Dia 18: Limpeza

  1. Desidrate a amostra usando diluição de metanol na sérieH2O, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% por 1 hora cada em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  2. Lave a amostra duas vezes com metanol 100% em rotação por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  3. Incube a amostra em diluições DCM a 66% (vol/vol) em metanol por 3 horas em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem ocorrer centrifugação.
  4. Lave a amostra duas vezes em 100% DCM por 15 minutos em temperatura ambiente em um rotador de roda a 8 rpm, sem centrifugação ocorrendo.
  5. Incube a amostra em DBE durante a noite em temperatura ambiente antes da imagem.
  6. Armazene as amostras a longo prazo em DBE até 1 ano sem impactar o sinal de coloração.

4. Imagem por microscopia confocal

  1. Coloque a amostra limpa em um recipiente de fundo de vidro de 35 mm com fundo de vidro #1,5.
  2. Encha o recipiente com etílico e caninato para submergir completamente a amostra.
  3. Coloque o prato no confocal e ajuste o foco para identificar o melhor plano que emite o sinal mais brilhante.
  4. Adquira uma imagem de tile no plano mais brilhante para capturar uma grande área da amostra, usando formato 1024 x 1024 e velocidade 600.
    NOTA: Use um objetivo inferior (10x ou 20x) para a imagem do tile para diminuir o tempo de imagem e o tamanho do arquivo.
  5. Com base na imagem do tile, selecione regiões de interesse para coletar um z-scan de resolução mais alta.
  6. Capture uma varredura em Z através do tecido limpo, cobrindo toda a profundidade do tecido na melhor resolução do microscópio, usando o formato 1024 x 1024 e velocidade 600.
    NOTA: Use uma meta 40x em imersão em óleo para obter a melhor resolução para HSC.
  7. Salve arquivos de imagem em formato LIF e visualize arquivos usando Fiji ou ImarisViewer 11.0.0.

5. Análise de imagens para reconstrução 3D e análise quantitativa de HSCs individuais

  1. Converta arquivos de imagem para o formato IMS usando o ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Use o modelo Surface no Imaris 10.2.0 para detectar o objeto nas imagens.
  3. Use o assistente de Criação para realizar uma análise em uma região 3D selecionada de interesse, depois aplique isso à imagem inteira.
    NOTA: Use isso para acelerar o processo de análise.
  4. Selecione o canal de origem, intensidade absoluta e desmarque o botão smooth para definir o limiar de intensidade para toda a imagem.
  5. Modifique o limiar para capturar todos os objetos da imagem.
  6. Use o número de voxels para filtrar os objetos detritos.
  7. Finalize o assistente, pressione o botão de estatística para obter todas as medições estatísticas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A perfusão e fixação bem-sucedidas do fígado do camundongo são representadas por uma cor uniforme pálida, bege-amarelada do fígado, refletindo a remoção eficiente do sangue e a penetração do fixador (Figuras 1A,B). Perfusão inadequada resulta em regiões vermelhas escuras ou marrons de coágulos sanguíneos, que reduzem a clareza óptica e levam a um sinal de fundo alto nessas regiões amostrais (Figura 1C).

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um pipeline de preparação de amostras reproduzível e adaptável, levando à visualização tridimensional e à análise quantitativa da morfologia do HSC em tecido hepático intacto. A integração da marcação genética de células fluorescentes, perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza iDISCO+ permite a obtenção de imagens de grandes volumes de tecidos com resolução de célula única, preservando a arquitetura espacial do microambiente hepático.

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado pelo 1R01 DK136016-01 e 5P30CA196521 (subsídio do centro NCI). Microscopia e/ou análise de imagem foram realizadas no CoRE de Microscopia e Bioimagem Avançada da Escola de Medicina Icahn em Mount Sinai. Essa pesquisa foi apoiada em parte pelo Instituto de Câncer Tisch em Mount Sinai, P30 CA196521 - Cancer Center Support Grant.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-RFP, coelho, pré-adsorvidoRockland600-401-379
Prato inferior de vidro de 35mm de 4 câmaras com micropoço de 20 mm, vidro de cobertura #1.5CellvisD35C4201.5N
Injeção de AnaSed (injeção de xilazina)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Tubos cônicos de centrífuga: 50ml Falcon352098
CotonetesMedlineMDS202000
Trava Curva   HemostatsFisher Scientific16-100-117
IgG Anti-Rato conjugado AffiniPure Donkey (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Tesoura de Operação Delicada 4,75" Curva Afiada/RombaInstrumento Cirúrgico Roboz
728501
Éter Dibenzílico (DBE), 98%Sigma Aldrich108014
Diclorometano (DCM),  ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimetil sulfóxido (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado contra IgG do Coelho Donkey anti-Bun, Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Soro de BurroEMD MilliporeS30
Etil-cinnamato, 99%Sigma Aldrich112372
Tesoura Microdissecante Extra Fina; Lâmina 24 mmFisher ScientificNC9232515
Rato com Anticorpos Monoclonais F4/80ThermoFisher Scientific14-4801-82
FijiNIH
PinçasFisher ScientificNC9214139
GlicinaBio-Rad1610718
Heparina Sal de SódioChem-Impex29984
Forno de Hibridização HibaidTriad ScientificMaxi 14
Peróxido de hidrogênio, 30 %Sigma Aldrich31642
Software Imaris 10.2.0Oxford Instruments
Software ImarisFileConverter 10.2.0Oxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
Cateter IVExel International Inc.EXE 26751
Cetamina, Injeção de cloridratoDechraB8U4100 mg/mL
Software LAS X 4.4.0.24861Leica
Microscópio Confocal Leica Stellaris 8Leica
Metanol, grau HPLCFisherA452-2
Rotador multiusoIndústrias Científicas, Inc.Modelo 151
Agulhas (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehila, pó, 95%Sigma Aldrich158127
Bomba peristálticaGilsonModelo Minipuls 3
Tubo da bomba peristáltica, MasterFlexTermo Científica96400-16Tubo de bomba de silicone curado com peróxido de 3,1mm de diâmetro de diâmetro x 7,6m L/S, tamanho L/S 16, espiga de mangueira de 1/8 pol
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)CytivaSH30256.01Estéril, pH 7,0 - 7,2, sem cálcio, magnésio
Iodeto de propidium, ≥ 94,0% (HPLC)Sigma AldrichP4170
Lâminas de barbearAmerican Line66-0362
Plataforma de balançoVWRModelo 200
Azida de Sódio, ≥ 99.5%Sigma AldrichS2002
SuturaEthiconJ109T
Seringa (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Pré-adolescente-20Termo CientíficaJ20605-AP
Frascos, tampa roscada com tampa sólida e revestimento de alumínio, pré-montadosSigma Aldrich27470-Uvolume 7 mL, frasco de vidro âmbar, O.D. & times; H 17 mm e horários; 60 mm, rosca para 15-425

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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