Avaliação dos Efeitos do Triptolídeo na Gefirina, Colibistina e Autofagia do Hipocampo em um modelo de camundongos Aβ1-42

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo agregado de camundongo semelhante à doença de Alzheimer induzida por Aβ1-42 e a avaliação dos efeitos do triptolídeo em proteínas associadas à sinapse inibitórias do hipocampo, sinalização PI3K/Akt/GSK-3β e marcadores relacionados à autofagia.

Resumo

A doença de Alzheimer está associada à disfunção sináptica, mas procedimentos padronizados para avaliar como a patologia induzida por Aβ afeta proteínas inibitórias associadas à sinapse e a sinalização relacionada à autofagia após intervenção candidata permanecem limitados. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para estabelecer um modelo de camundongo semelhante à doença de Alzheimer induzido por Aβ1-42 e avaliar os efeitos do triptolido na Gefirina hipocampal, collibistina, sinalização PI3K/Akt/GSK-3β e marcadores relacionados à autofagia. Camundongos adultos C57BL/6J recebem injeção intracerebroventricular bilateral de Aβ1-42 preparada sob condições indutoras de agregação, seguida pela administração diária intraperitoneal de triptolida, com ou sem o inibidor PI3K LY294002. Aprendizado espacial e memória são avaliados usando o teste Morris Water Labe. Lesão neuronal do hipocampo e deposição de Aβ são avaliadas por coloração de hematoxilina e eosina e imunohistoquímica de Aβ, e lisados do hipocampo são analisados por Western blot para quantificar Gefirina, Gefirina fosforilada, Colibistina, proteínas sinalizadoras PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I e p62. Considerações procedurais chave incluem preparação padronizada de Aβ1-42, injeção estereotáxica precisa, condições consistentes de teste comportamental, seleção cega da região de interesse e análise padronizada de imagem e densitometria. Utilizando esse fluxo de trabalho, a administração de Aβ1-42 produziu déficits de aprendizagem espacial e memória, lesão neuronal do hipocampo, deposição de Aβ, redução da expressão de Gefirina e Colibistina, alteração da sinalização de PI3K/Akt/GSK-3β e aumento do acúmulo de LC3-II/I e p62. O triptolido reverteu parcialmente essas mudanças comportamentais, histológicas e moleculares, enquanto LY294002 atenuou seus efeitos. Esse protocolo pode ser usado para avaliar alterações moleculares do hipocampo induzidas por Aβ e intervenções candidatas, reconhecendo que esse modelo não reproduz a progressão crônica e multifatorial da doença de Alzheimer humana.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado por declínio cognitivo, comprometimento de memória e distúrbios comportamentais, e representa uma das principais causas de demência em adultos mais velhos. Embora a deposição de β amiloide (Aβ), a patologia da tau, a disfunção sináptica, a neuroinflamação e a homeostase proteica comprometida tenham sido amplamente implicados na patogênese da DA, os mecanismos moleculares que ligam a toxicidade associada à Aβ à perturbação inibitória das proteínas sinápticas permanecem incompletamente^{compreendidos} 1,2,3,4 . A disfunção sináptica inibitória pode perturbar o equilíbrio entre excitação e inibição nos circuitos neuronais, contribuindo assim para a instabilidade da rede e para o comprometimento cognitivo. No entanto, os eventos de sinalização intracelular que regulam proteínas de andaimagem associadas à sinapse inibitórias sob condições patológicas semelhantes ao DA, induzidas por Aβ, requerem esclarecimento^{adicional 5}.

A gefirina é uma importante proteína de andamiagem pós-sináptica que ancora e estabiliza receptores de neurotransmissores inibitórios, incluindo receptores de glicina e receptores de ácido γ-aminobutírico tipo A, nos sítios^{pós-sinápticos 6}. A colibistina, codificada por ARHGEF9, é um fator de troca de nucleotídeos de guanina que interage com a Gefirina e promove o agrupamento e a localização de membranas dos componentes sinápticos^{inibitórios 7}. A interação funcional entre Gefirina e Colibistina é, portanto, essencial para a organização, manutenção e plasticidade das sinapses inibitórias. A perturbação desse complexo proteico pode prejudicar a neurotransmissão inibitória e contribuir para déficits cognitivos. Notavelmente, a estabilidade da Gefirina e o agrupamento sináptico podem ser regulados por mecanismos dependentes da fosforilação. A sinalização associada a oligômeros Aβ tem sido relatada como influenciando quinases como a glicosíntese quinase-3β (GSK-3β), que podem promover a fosforilação da Gefirina na serina 270 e, assim, afetar o agrupamento e a degradação da Gefirina. Esses achados sugerem que a regulação mediada por quinase da Gefirina pode representar um importante elo molecular entre a patologia associada à Aβ e a disfunção sináptica^{inibitória 8,9}.

A via PI3K/Akt é uma via de sinalização intracelular chave envolvida na sobrevivência neuronal, plasticidade sináptica, homeostase proteica e regulação da autofagia. A atividade Akt pode suprimir o GSK-3β por meio da fosforilação inibitória, modulando assim substratos a jusante envolvidos na função neuronal e na estabilidade sináptica. A desregulação da sinalização PI3K/Akt/GSK-3β tem sido implicada em lesão neuronal relacionada à Alzheimer e pode contribuir tanto para comprometimento sináptico quanto para degradação anormal das proteínas^10,11. Paralelamente, a autofagia é uma via essencial de degradação intracelular que remove organelos danificados e proteínas mal dobradas. Disfunção autofagia-lisossômica tem sido intimamente associada ao acúmulo de Aβ, patologia tau e dano neuronal na^{AD 12}. No entanto, as alterações do LC3-II/I sozinhas não conseguem distinguir o aumento da formação de autofagossomos da degradação autofágica comprometida; Portanto, marcadores adicionais como o P62 são necessários para avaliar melhor as mudanças de fluxo relacionadas à autofagia. Juntas, essas observações apoiam a necessidade de examinar a atividade PI3K/Akt, a regulação mediada por GSK-3β da Gefirina e marcadores relacionados à autofagia dentro do mesmo quadro experimental.

Triptolide, um diterpeno bioativo triepóxido isolado de Tripterygium wilfordii, foi relatado como exercendo efeitos anti-inflamatórios, imunomoduladores e^{neuroprotetores 13}. Estudos anteriores sugeriram que o triptolido pode melhorar o desempenho cognitivo e preservar proteínas inibitórias associadas à sinapse em modelos semelhantes a DA. No entanto, a relação mecanicista entre o tratamento com triptolido, ativação da via PI3K/Akt, fosforilação da Gefirina mediada por GSK-3β, expressão de colibistina e mudanças em proteínas relacionadas à autofagia não foi totalmente definida. Se o triptolido regula a expressão hipocampal de Gefirina e Collybitina por meio de um mecanismo associado a PI3K/Akt/GSK-3β em um modelo de camundongo semelhante ao DA, induzido por Aβ1-42, ainda^{não está claro 14,15}.

Comparado a modelos transgênicos crônicos de Alzheimer, como camundongos APP/PS1 ou 5xFAD, e modelos baseados em tauopatia, a injeção intracerebroventricular de Aβ1-42 agregado oferece uma abordagem relativamente rápida e tecnicamente acessível para induzir lesão do hipocampo associada à Aβ e comprometimento cognitivo. Esse protocolo é adequado quando o objetivo experimental é avaliar neurotoxicidade induzida por Aβ de curto prazo, alterações moleculares do hipocampo e efeitos relacionados à intervenção em vias de sinalização definidas. No entanto, esse modelo não reproduz a produção crônica de amiloide, a patologia da tau, as alterações vasculares, a complexidade neuroimune ou a progressão dependente da idade da Alzheimer humana. Portanto, achados obtidos usando este protocolo devem ser interpretados como patologia semelhante à DA, induzida por Aβ, e idealmente validados em modelos transgênicos crônicos, modelos relacionados à tau ou sistemas neuronais derivados de humanos. Apesar das evidências anteriores que ligam a patologia Aβ, sinalização PI3K/Akt/GSK-3β, proteínas associadas a sinapses inibitórias e anormalidades relacionadas à autofagia a patologias semelhantes ao DA, poucos protocolos integram testes comportamentais, avaliação histológica hipocampal, imunohistoquímica Aβ, análise de proteínas associadas a sinapses inibitórias, avaliação de sinalização quinase e detecção de marcadores relacionados à autofagia dentro de um único modelo de intervenção induzido por Aβ1-42. Essa lacuna metodológica limita a avaliação reprodutível de saber se compostos candidatos modulam as mudanças em proteínas associadas às sinapses inibitórias por meio de vias de sinalização intracelular definidas.

O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho reprodutível para avaliar a expressão hipocampal de Gefirina e Colibistina e seus mecanismos regulatórios associados em um modelo de camundongo semelhante ao DA, induzido por Aβ1-42, tratado com triptolido, com ou sem o LY294002 inibidor de PI3K. A contribuição original deste trabalho é a integração da administração estereotáxica de Aβ1-42, modulação farmacológica das vias de sinalização, testes do labirinto aquático de Morris, avaliação histológica e imunohistoquímica, e análise Western blot de proteínas associadas a sinapses inibitórias, sinalização PI3K/Akt/GSK-3β e marcadores relacionados à autofagia. A hipótese de trabalho era que a patologia semelhante à DA, induzida por Aβ1-42, estaria associada a sinalização comprometida de PI3K/Akt, alteração da fosforilação da Gefirina associada a GSK-3β, redução da expressão de Gefirina e Colibistina no hipocampo, e acúmulo anormal de proteínas relacionadas à autofagia, enquanto o tratamento com triptolídeo reverteria parcialmente essas anormalidades comportamentais e moleculares.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica da Universidade de Medicina de Hubei e realizados de acordo com as diretrizes institucionais para cuidados e uso dos animais (Nº SYXK2019-0031.). Todos os procedimentos envolvendo animais, Aβ1-42, triptoleto, LY294002, paraformaldeído, xileno, etanol e reagentes quimioluminescentes devem ser realizados com equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo jaleco, luvas e óculos de proteção. Carcaças de animais, tecidos cerebrais, consumíveis contaminados com Aβ, resíduos de paraformaldeído, resíduos de xileno e materiais contaminados com ECL devem ser coletados separadamente e descartados de acordo com as regulamentações institucionais de biossegurança e descarte de resíduos químicos. A análise de imagem foi realizada usando o ImageJ. Para análise imunohistoquímica, as imagens foram convertidas para escala de cinza de 8 bits ou submetidas a deconvolução de cor para isolar a coloração DAB-positiva. O mesmo limiar foi aplicado a todas as imagens dentro do mesmo experimento. A área positiva de coloração, a área total da região de interesse e a densidade integrada foram medidas. Para Western bloting, as intensidades das bandas foram medidas usando a ferramenta de análise em gel após a subtração de fundo. Os níveis de proteína alvo foram normalizados para β-actina, enquanto proteínas fosforiladas foram normalizadas para seus níveis totais correspondentes de proteína.

Os reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais, incluindo nomes de produtos, fabricantes, números de catálogo ou modelo, e descrições genéricas.

Animais e agrupamento experimental
Quarenta e oito camundongos adultos C57BL/6J, incluindo 24 machos e 24 fêmeas, com idades entre 10 e 12 semanas e pesando entre 22 e 28 g, foram adquiridos do Centro Experimental de Animais da Universidade de Medicina de Hubei. Os camundongos foram alojados sob condições específicas livres de patógenos a 22 ± 2 °C, com acesso livre a água autoclavada e comida padrão para roedores. Após 1 semana de aclimatação, os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos: o grupo controle, o grupo modelo tipo DA-Aβ1-42, o grupo tratado com triptolido e o grupo de co-tratamento LY294002 mais triptolida, com 12 camundongos por grupo. Ratos machos e fêmeas foram equilibrados entre os grupos de forma o mais equilibrada possível.

O peptídeo Aβ1-42 foi dissolvido em soro fisiológico normal estéril até uma concentração final de 10 μg/μL. Para preparar Aβ1-42 em condições indutoras de agregação, a solução foi incubada a 37 °C por 7 dias em um banho-maria circulante, misturada suavemente antes do uso e mantida no gelo durante a injeção. Essa condição de preparação foi adaptada a partir de procedimentos de agregação Aβ42 publicados anteriormente. No presente estudo, o estado de agregação do lote exato de Aβ1-42 injetado não foi caracterizado independentemente por fluorescência de Tioflavina T, SDS-PAGE/Western blot ou microscopia eletrônica de transmissão. Portanto, o termo "Aβ1-42 agregado" neste protocolo refere-se a Aβ1-42 preparado sob condições de incubação que induzem agregação.

Para o estabelecimento do modelo, os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 10% de pentobarbital sódico em uma dose de 0,04 mL/10 g de peso corporal. Anestesia adequada foi confirmada pela ausência de retirada dos pedais e reflexos corneanos. Cada camundongo foi então fixado em um aparelho estereotáxico, e o couro cabeludo foi raspado e desinfetado com iodóforo ou etanol 75%. Foi feita uma incisão na linha média para expor o crânio, e a brema foi identificada sob um estereoscópio. O crânio foi ajustado para que bregma e lambda ficassem posicionados no mesmo plano horizontal.

Injeções bilaterais nos ventrículos laterais foram realizadas usando as seguintes coordenadas em relação ao bregma: anteroposterior, −0,50 mm; mediolateral, ±1,00 mm; e dorsoventral, −3,00 mm da superfície do crânio. Um volume total de 2 μL de solução agregada de Aβ1-42 foi injetado lentamente (2 μL/min) em cada ventrículo lateral usando uma micro seringa. A injeção foi realizada em baixa velocidade constante para reduzir danos teciduais e refluxo. Após a injeção, a agulha era deixada no lugar por aproximadamente 5 minutos, depois retirada lentamente. Os camundongos controle receberam um volume igual de soro fisiológico normal estéril nas mesmas coordenadas e utilizando o mesmo procedimento cirúrgico. Após a injeção, a incisão no couro cabeludo era fechada com suturas ou clipes para feridas, e os camundongos eram colocados em uma gaiola de recuperação aquecida até que recuperassem a consciência. A recuperação pós-operatória, peso corporal, cicatrização de feridas, comportamento de cuidado, atividade locomotora e sinais de dor ou sofrimento foram monitorados diariamente.

A intervenção medicamentosa foi iniciada 2 semanas após a injeção estereotáxica, depois que o modelo foi considerado estável. O triptolido foi dissolvido em soro fisiológico normal contendo 4% de propilenoglicol e administrado intraperitonealmente uma vez ao dia por 30 dias consecutivos. O grupo tratado com triptolido recebeu triptolida a 0,2 mg/kg diário, enquanto o grupo LY294002 mais triptolido co-tratamento recebeu triptolida junto com o inibidor de PI3K LY294002 a 0,3 mg/kg uma vez ao dia por 30 dias consecutivos. O grupo de controle e o grupo de modelos tipo AD induzido por Aβ1-42 receberam volumes iguais de solução veicular usando o mesmo esquema^{de injeção 16}.

Teste do labirinto aquático de Morris
A aprendizagem espacial e a memória foram avaliadas usando o labirinto aquático de Morris 24 horas após a administração final de medicamentos. O labirinto de água consistia em uma piscina circular cheia de água mantida entre 22 °C ± 1 °C. Pistas visuais foram colocadas ao redor da piscina e mantidas inalteradas durante todo o experimento. Durante a fase de navegação por lugares, a plataforma oculta era fixa no quadrante alvo. Antes dos testes de cada dia, os camundongos foram deixados se aclimatar à sala de testes por aproximadamente 30 minutos.

O teste de navegação por locais foi realizado por 6 dias consecutivos. Em cada teste, o rato era cuidadosamente colocado na água, de frente para a parede da piscina a partir de um dos quadrantes iniciais, e podia procurar a plataforma oculta por até 60 segundos. Se o mouse encontrasse a plataforma em até 60 s, ele podia permanecer na plataforma por 15 s. Se o mouse não conseguisse localizar a plataforma em até 60 s, ele era guiado até a plataforma e permitido permanecer lá por 20 s para facilitar a consolidação da memória espacial. Cada mouse passou por 4 testes por dia, e a latência de fuga, distância de natação e velocidade de natação foram registradas usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo.

No sétimo dia, a plataforma foi removida para o teste da sonda. O rato era colocado na água a partir do quadrante oposto à plataforma original e permitido nadar livremente por 60 segundos. O número de passagens de plataforma e a porcentagem de tempo gasto no quadrante-alvo foram registrados. Após cada teste, o camundongo era seco e devolvido a uma gaiola aquecida para evitar^{hipotermia 17,18}.

Coleta de tecidos
Após testes comportamentais, os camundongos foram profundamente anestesiados por injeção intraperitoneal de 10% de sódio pentobarbital em uma dose de 0,04 mL/10 g de peso corporal. Oito camundongos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para extração proteica do hipocampo. Seus cérebros foram rapidamente removidos sobre gelo, e tecidos bilaterais do hipocampo foram dissecados em uma superfície gelada. As amostras do hipocampo eram colocadas em crioviais pré-marcados, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 °C até a extração da proteína.

Os quatro camundongos restantes de cada grupo foram usados para análises histológicas e imunohistoquímicas. Sob anestesia profunda, os camundongos foram perfundidos transcardicamente com soro tampão fosfatado até que o fígado ficasse pálido, seguido por 4% de paraformaldeído. Os cérebros foram cuidadosamente removidos e fixados em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 horas. Após a fixação, os tecidos cerebrais foram submetidos à plataforma experimental de patologia, onde foram realizados a incorporação de parafina e a subsequente secção. O paraformaldeído era manuseado em uma exaustão química, e resíduos contendo paraformaldeído eram coletados separadamente, de acordo com os requisitos institucionais de descarte de resíduos químicos.

Coloração de hematoxilina e eosina
Tecidos cerebrais embutidos com parafina foram cortados em seções coronais de 4 μm contendo o hipocampo. As seções foram cozidas a 60 °C por 1 hora, desparafinizadas duas vezes em xileno por 10 minutos cada, e reidratadas por soluções de etanol graduadas (100%, 95%, 85% e 75%), seguidas por água destilada (5 minutos para cada etapa). Após a reidratação, as seções eram tingidas com hematoxilina por 10 minutos, enxaguadas em água da torneira corrente, brevemente diferenciadas em álcool ácido (2 s), quando necessário, e azuladas em água da torneira corrente. As seções foram então contra-tingidas com eosina por 5 minutos, desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno duas vezes por 5 minutos cada e montadas com resina neutra.

A morfologia do hipocampo foi observada sob um microscópio óptico. Imagens foram obtidas da mesma sub-região hipocampal em todos os grupos, utilizando os parâmetros de ampliação e imagem de 20×. O dano neuronal foi avaliado com base na densidade neuronal, picnose nuclear e arranjo desordenado usando software de análise de imagem por um pesquisador cegamente para a alocação do grupo¹⁹.

Imunohistoquímica Aβ
Para a imunohistoquímica Aβ, as seções de parafina foram desparafinizadas e reidratadas conforme descrito para a coloração de hematoxilina e eosina. A recuperação de antígeno foi realizada no tampão de recuperação de antígenos EDTA a pH 8,0, aquecendo as seções em um micro-ondas em alta potência por 3 minutos duas vezes. As seções foram deixadas esfriar até a temperatura ambiente e depois lavadas três vezes com PBS por 5 minutos cada. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% por 15 minutos em temperatura ambiente, seguida por lavagem com PBS três vezes por 5 minutos cada. A ligação inespecífica foi bloqueada com 5% de soro normal de cabra por 30 minutos em temperatura ambiente. As secções foram incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo primário contra Aβ diluído em 1:200 em PBS. Após a incubação, as seções foram lavadas três vezes com PBS por 5 minutos cada, depois incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS, aplicava-se substrato DAB e o desenvolvimento das cores era monitorado ao microscópio. A reação foi interrompida com água destilada assim que a coloração marrom-positiva se tornou visível. As seções foram contra-tingidas com hematoxilina, desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno e montadas com resina neutra. Imagens foram capturadas da mesma sub-região hipocampal em todos os grupos, usando configurações idênticas de microscópio a 20× de ampliação. A imunocoloração Aβ foi quantificada usando software de análise de imagem. O limiar de coloração positiva foi mantido consistente em todas as imagens, e a deposição de Aβ foi calculada como a área de coloração positiva dividida pelo número total de células em cada campo microscópico.

Extração de proteínas do Hipocampo e análise de western blot
Tecidos hipocampais congelados foram mantidos em gelo e homogeneizados em tampão de lise RIPA gelado, contendo protease e inibidores de fosfatase. Os homogenados foram incubados no gelo por 30 minutos e em vórtices intermitentes para garantir uma lise suficiente. Os lisados foram então centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C, e os supernadados foram coletados para análise de proteínas. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, padrões de BSA e amostras de proteína foram preparados em duplicado, misturados com reagente de trabalho BCA, incubados a 37 °C por 30 minutos e medidos a 562 nm usando um leitor de microplacas. As concentrações de proteínas foram calculadas de acordo com a curva padrão, e todas as amostras foram ajustadas para a mesma concentração final antes da^{eletroforese 20}.

20 μg de proteína total de cada amostra do hipocampo foram separados por 12% de SDS-PAGE e transferidos para as membranas do PVDF. A eletroforese foi realizada a 80 V para empilhamento e 120 V para separação. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF ativadas no metanol usando transferência úmida a 100 V por 90 minutos a 4 °C. Após a transferência, as membranas foram bloqueadas com 5% de BSA por 1 hora em temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Gefirina (diluição 1:1000), Gefirina fosforilada (diluição 1:500), Colibitina (diluição 1:1000), PI3K (diluição 1:1000), Akt (diluição 1:1000), Akt fosforilado (diluição 1:1000), GSK-3β (diluição 1:1000), GSK-3β fosforilado (diluição 1:1000), LC3 (diluição 1:1000), p62 (diluição 1:1000) e β-actina (diluição 1:5000). Após a lavagem com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP por 1 hora em temperatura ambiente (diluição 1:5000). As bandas proteicas foram visualizadas usando substrato quimioluminescente ECL e capturadas com um sistema de imagem quimioluminescente. As intensidades das bandas foram quantificadas usando software de análise de imagem. Os níveis totais de expressão proteica foram normalizados para β-actina. Imagens de Western blot de alta resolução não recortadas foram incluídas nos materiais suplementares.

Dados Estatísticos
A análise estatística foi realizada usando software de análise estatística e geração de grafos. Os dados foram expressos como média ± SD, conforme indicado nas legendas das figuras. Testes de comportamento e quantificação de imagens foram realizados por pesquisadores cegos quanto à alocação em grupo. A latência de escape durante a fase de treinamento do labirinto aquático Morris foi analisada usando medidas repetidas bidirecionais ANOVA, com grupo e dia de treinamento como fatores. Os dados do ensaio de sonda, quantificação histológica, quantificação imunohistoquímica e densitometria por Western blot foram analisados usando um teste ANOVA unidirecional. A significância estatística foi definida como p < 0,05. A notação padrão de significância foi usada da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Tamanhos exatos das amostras foram informados nas legendas correspondentes das figuras. Ratos machos e fêmeas estavam distribuídos uniformemente entre os grupos experimentais. No entanto, a análise estatística estratificada por sexo não foi realizada porque o estudo não foi projetado ou alimentado para detectar efeitos específicos de sexo. Essa limitação é reconhecida na seção de Discussão.

Resultados

Aprendizagem e memória prejudicadas em camundongos semelhantes ao DA induzidos por Aβ1-42 e melhora parcial após o tratamento com triptolídeo

Para estabelecer um modelo de camundongo semelhante ao Alzheimer induzido por Aβ1-42, Aβ1-42 agregado foi injetado estereotaxicamente nos ventrículos laterais bilaterais de camundongos C57BL/6J. Após o estabelecimento do modelo, os camundongos foram tratados com veículos, triptolido ou triptolida, combinados com o inibidor PI3K LY294002. O aprendizado espacial e a memória foram então avaliados usando o labirinto aquático Morris.

Durante a fase de navegação de lugares de 6 dias, a latência de escape diminuiu gradualmente em todos os grupos, indicando que os camundongos adquiriram a tarefa de aprendizado espacial com treinamentos repetidos (Figura 1A). No entanto, camundongos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42 apresentaram latências de fuga consistentemente maiores do que camundongos controle, especialmente em dias de treinamento posteriores, sugerindo aprendizado espacial prejudicado. O tratamento com triptolido reduziu a latência de escape em comparação com o grupo modelo tipo AD induzido por Aβ1-42, enquanto o co-tratamento com LY294002 enfraqueceu essa melhoria. Esses achados indicam que o triptolídeo melhorou parcialmente o prejuízo de aprendizagem espacial induzido por Aβ1-42, e esse efeito foi atenuado pela inibição do PI3K.

Trilhas representativas de natação reforçaram ainda mais essas mudanças comportamentais (Figura 1B). Os camundongos controle apresentaram um padrão de busca mais direto, orientado ao alvo, ao redor da localização da plataforma, enquanto camundongos do tipo AD induzido por Aβ1-42 apresentaram uma trajetória de natação dispersa e ineficiente. Ratos tratados com triptolídeo apresentaram melhor comportamento de busca, com trajetórias mais concentradas ao redor da área alvo. Em contraste, camundongos tratados com LY294002 e triptolida mostraram busca menos eficiente do que aqueles tratados apenas com triptolida. No teste da sonda realizado após a remoção da plataforma, camundongos do tipo AD induzidos por Aβ1-42 cruzaram a localização original da plataforma menos vezes do que os camundongos controle, indicando retenção espacial prejudicada (Figura 1C). O tratamento com triptolido aumentou o número de passagens de plataforma, enquanto LY294002 co-tratamento reduziu esse efeito. Da mesma forma, a porcentagem de tempo no quadrante-alvo foi reduzida em camundongos semelhantes à Alzheimer induzidos por Aβ1-42 em comparação com camundongos controle, aumentou após o tratamento com triptolídeo e diminuiu novamente após LY294002 co-tratamento (Figura 1D).

Juntos, esses resultados comportamentais demonstram que a injeção bilateral intraventricular de Aβ1-42 agregado induziu déficits de aprendizagem espacial e memória em camundongos. O triptolido reverteu parcialmente esses défices comportamentais, enquanto LY294002 atenuou o efeito protetor do triptolido, sugerindo que a sinalização PI3K/Akt pode contribuir para os efeitos comportamentais observados neste modelo.

A injeção de Aβ1-42 induziu lesão neuronal do hipocampo e deposição de Aβ, que foram atenuadas pelo triptolido

Para verificar ainda mais o estabelecimento de alterações patológicas semelhantes ao AD induzidas por Aβ1-42 e avaliar o efeito do triptolida na lesão hipocampal, foram realizadas colorações de hematoxilina e eosina e imunohistoquímica de Aβ em seções cerebrais de cada grupo.

A coloração com HE mostrou que os neurônios do grupo controle estavam densamente e regularmente organizados, com morfologia celular e estrutura nuclear relativamente claras (Figura 2A). Em contraste, camundongos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42 apresentaram óbvio dano neuronal no hipocampo, caracterizado por arranjo celular desordenado, redução da densidade neuronal e aumento da condensação nuclear. O tratamento com triptolídeo melhorou parcialmente a morfologia neuronal do hipocampo, com arranjo celular mais preservado e piknose nuclear menos aparente em comparação com o grupo modelo induzido por Aβ1-42. No entanto, o cotratamento com LY294002 atenuou o efeito protetor do triptolido, refletido por uma desorganização e lesão neuronal mais pronunciadas em comparação com o grupo tratado com triptolida.

A imunohistoquímica Aβ foi então realizada para avaliar a deposição de Aβ no hipocampo (Figura 2B). Coloração mínima para Aβ positiva foi observada no grupo controle, enquanto o grupo modelo tipo AD induzido por Aβ1-42 apresentou sinais marrons Aβ-positivos marcadamente aumentados. O tratamento com triptolido reduziu a coloração Aβ-positiva em comparação com o grupo modelo, indicando que o triptolido atenuou a deposição de Aβ neste modelo. Em contraste, camundongos tratados com LY294002 mais triptolido apresentaram aumento na coloração Aβ-positiva em comparação com camundongos tratados apenas com triptolida. A análise quantitativa confirmou ainda mais essas observações histológicas. A área de sinal Aβ-positiva normalizada ao número total de células em cada campo microscópico aumentou no grupo modelo tipo AD induzido por Aβ1-42 em comparação com o grupo controle, reduzida após o tratamento com triptolídeo e parcialmente aumentada novamente após LY294002 co-tratamento (Figura 2B).

Esses resultados indicam que a injeção de Aβ1-42 induziu lesão neuronal do hipocampo e acúmulo de Aβ, enquanto o triptolido aliviou parcialmente essas mudanças patológicas. A reversão observada após LY294002 co-tratamento sugere que a sinalização PI3K/Akt pode contribuir para o efeito protetor do triptolido.

O triptolido restaurou a expressão da Gefirina e da Colibitina do hipocampo e modulou a sinalização PI3K/Akt/GSK-3β

Para determinar se as mudanças comportamentais e histológicas foram acompanhadas por alterações nas proteínas associadas à sinapse inibitórias e em sua sinalização regulatória a montante, lisados hipocampais de cada grupo foram analisados por Western bloting. Comparados ao grupo controle, camundongos semelhantes a DA induzidos por Aβ1-42 apresentaram uma redução significativa na expressão de Gefirina hipocampal, enquanto os níveis fosforilados de Gefirina aumentaram (Figura 3A). O tratamento com triptolido restaurou parcialmente a expressão total de Gefirina e reduziu os níveis fosforilados de Gefirina. Em contraste, LY294002 co-tratamento enfraqueceu o efeito do triptolido, como demonstrado pela redução da expressão de Gefirina e pelo aumento da Gefirina fosforilada em comparação com o grupo tratado com triptolido. Esses resultados sugerem que a patologia induzida por Aβ1-42 esteve associada não apenas à redução da abundância de Gefirina hipocampal, mas também à fosforilação aumentada da Gefirina, enquanto o triptolido reverteu parcialmente essas alterações.

A colibistina apresentou padrão de expressão semelhante ao da Gefirina total. Camundongos do tipo AD induzidos por Aβ1-42 apresentaram diminuição na expressão de Colibistina hipocampal em comparação com camundongos controle, enquanto o tratamento com triptolídeo restaurou a expressão de Colibistina. LY294002 co-tratamento reverteu parcialmente esse efeito (Figura 3B). Esses achados indicam que o triptolido preservou a expressão de proteínas de andaimes associadas à sinapse inibitórias no hipocampo, e esse efeito foi atenuado pela inibição do PI3K. A via de sinalização PI3K/Akt/GSK-3β foi então examinada para elucidar melhor as mudanças moleculares subjacentes à fosforilação da Gefirina. No grupo modelo tipo AD induzido por Aβ1-42, a expressão de PI3K e a razão p-Akt/Akt foram reduzidas em comparação com o grupo controle, indicando atividade de sinalização PI3K/Akt comprometida (Figura 3B). A proporção p-GSK-3β/GSK-3β também foi reduzida no grupo de modelos. Como a fosforilação do GSK-3β no local inibitório reflete a supressão da atividade do GSK-3β, essa redução sugere um aumento relativamente maior da atividade do GSK-3β no hipocampo semelhante ao DA, induzido por Aβ1-42. O tratamento com triptolídeo aumentou a expressão de PI3K, restaurou a razão p-Akt/Akt e elevou a relação p-GSK-3β/GSK-3β. Esses efeitos foram enfraquecidos pelo LY294002 co-tratamento.

Em conjunto, esses resultados sugerem que a patologia semelhante à DA, induzida por Aβ1-42, estava associada à redução da expressão hipocampal de Gefirina e Colibistina, aumento da fosforilação da Gefirina e deteriorada fosforilação inibitória de GSK-3β mediada por PI3K/Akt. O triptolido reverteu parcialmente essas mudanças moleculares, enquanto LY294002 atenuou os efeitos do triptolide, apoiando o envolvimento da sinalização PI3K/Akt/GSK-3β na regulação da Gefirina e Colibitina do hipocampo neste modelo.

Triptolídeo atenuou anomalias proteicas relacionadas à autofagia no hipocampo de camundongos semelhantes à DA, induzidos por Aβ1-42

Para determinar se a patologia semelhante à DA, induzida por Aβ1-42, e o tratamento com triptolídeos estavam associados a alterações nas proteínas relacionadas à autofagia, a expressão de LC3 e p62 foram examinadas em lisados hipocampais por Western bloting. Comparados ao grupo controle, camundongos do tipo AD induzidos por Aβ1-42 apresentaram uma razão aumentada de LC3-II/I, indicando maior acúmulo de LC3-II associado a autofagossomos. Paralelamente, a expressão de p62 também foi elevada no grupo modelo, sugerindo acúmulo de substratos relacionados à autofagia no hipocampo. O tratamento com triptolídeo reduziu tanto a razão LC3-II/I quanto a expressão de p62 em comparação com o grupo modelo tipo DA, induzido por Aβ1-42. Esses resultados indicam que o triptolido atenuou o acúmulo anormal de proteínas relacionadas à autofagia induzido por Aβ1-42. Em contraste, LY294002 cotratamento aumentou a razão LC3-II/I e a expressão de p62 em comparação apenas com o tratamento com triptolido, sugerindo que a inibição de PI3K atenuou o efeito do triptolídeo nas alterações proteicas relacionadas à autofagia (Figura 4).

No geral, o grupo controle forneceu o perfil comportamental, histológico e molecular de base, enquanto o grupo modelo do tipo DA, induzido por Aβ1-42, confirmou que a administração intracerebroventricular de Aβ1-42 produziu comprometimento cognitivo, lesão neuronal do hipocampo, deposição de Aβ, redução de proteínas inibitórias associadas à sinapse, alterações na sinalização PI3K/Akt/GSK-3β e acúmulo de proteínas relacionadas à autofagia. A comparação entre o grupo modelo induzido por Aβ1-42 e o grupo tratado com triptolídeo mostrou que o triptolídeo reverteu parcialmente essas anormalidades. A comparação entre o grupo tratado com triptolido e o grupo de co-tratamento LY294002 mais triptolido mostrou ainda que a inibição de PI3K atenuava os efeitos do triptolido. Esses resultados apoiam a hipótese de trabalho de que o triptolídeo modula mudanças em proteínas relacionadas à Gefirina, Colibistina e autofagia do hipocampo em um modelo semelhante ao DA, induzido por Aβ1-42, por meio de um mecanismo associado a PI3K/Akt/GSK-3β.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Todos os dados brutos necessários para reproduzir os achados deste estudo são fornecidos como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2. Esses incluem as imagens originais do western blot e do gel, dados de blot não recortados, valores numéricos brutos usados para análises estatísticas e os gráficos gerados. (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) Esses arquivos fornecem os dados brutos que apoiam os resultados quantitativos relatados nas Figuras 1–4.

Figura 1: Triptolida, melhorou parcialmente os déficits de aprendizagem espacial e memória em camundongos semelhantes a Alzheimer induzidos por Aβ1-42. (A) Latência de escape durante a fase de navegação de 6 dias do labirinto aquático Morris. (B) Trajetórias representativas de natação durante o teste de sonda. (C) Número de travessias sobre a localização original da plataforma após a remoção da plataforma. (D) Porcentagem do tempo passado no quadrante-alvo durante o teste da sonda. Os dados são apresentados como média ± SD. A latência de escape foi analisada por ANOVA de medidas repetidas bidirecionais, e os dados do teste de sonda foram analisados por teste ANOVA unidirecional. Ctr, grupo de controle; AD, grupo de modelos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42; TP, grupo tratado com triptolida; Grupo de co-tratamento com LY, LY294002 mais triptolida. n = 6 por grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Lesão neuronal do hipocampo atenuada pelo triptolídeo e deposição de Aβ em camundongos semelhantes ao DA, induzidos por Aβ1-42. (A) Imagens representativas de coloração de hematoxilina e eosina de seções do hipocampo de cada grupo. Barra de escala = 50μm. (B) Imagens representativas de coloração imunohistoquímica Aβ e análise quantitativa da deposição Aβ-positiva no hipocampo. Barra de escala = 50μm. Os dados são apresentados como média ± DS. A análise estatística foi realizada usando um teste ANOVA unidirecional. Ctr, grupo de controle; AD, grupo de modelos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42; TP, grupo tratado com triptolida; Grupo de co-tratamento com LY, LY294002 mais triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Triptolidato restaurou a expressão hipocampal de Gefirina e Collybitina e modulou a sinalização associada a PI3K/Akt/GSK-3β em camundongos semelhantes a DAs induzidos por Aβ1-42. (A) Imagens representativas de Western blot e análise quantitativa da expressão total de Gefirina e Gefirina fosforilada em lisados do hipocampo de cada grupo. (B) Imagens representativas de Western blot e análise quantitativa de Colibistina, PI3K, Akt, Akt fosforilada, GSK-3β e GSK-3β fosforilada em lisados hipocampais. A colibistina e a PI3K foram normalizadas para β-actina. Akt fosforilado e GSK-3β fosforilado foram quantificados como proporções p-Akt/Akt e p-GSK-3β/GSK-3β, respectivamente. Os dados são apresentados como média ± DS. A análise estatística foi realizada usando um teste ANOVA unidirecional. Ctr, grupo de controle; AD, grupo de modelos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42; TP, grupo tratado com triptolida; Grupo de co-tratamento com LY, LY294002 mais triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Triptolídeo atenuou anormalidades proteicas relacionadas à autofagia no hipocampo de camundongos semelhantes ao AD induzidos por Aβ1-42. Imagens representativas de Western blot e análise quantitativa da expressão de LC3-I/II e p62 em lisados do hipocampo de cada grupo. A razão LC3-II/I foi calculada dividindo a intensidade da banda LC3-II pela intensidade da banda LC3-I, e a expressão de p62 foi normalizada para β-actina. Os dados são apresentados como média ± DS. A análise estatística foi realizada usando um teste ANOVA unidirecional. Ctr, grupo de controle; AD, grupo de modelos semelhantes a AD induzidos por Aβ1-42; TP, grupo tratado com triptolida; Grupo de co-tratamento com LY, LY294002 mais triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Imagens de manchas ocidentais não recortadas. As bandas usadas para quantificação são indicadas, e marcadores de peso molecular são mostrados quando disponíveis. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Valores numéricos brutos usados para análises estatísticas neste artigo. Este arquivo contém os conjuntos de dados numéricos brutos usados para gerar os gráficos quantitativos na Figura 1–4, incluindo medições comportamentais do labirinto aquático de Morris, quantificação de imunohistoquímica Aβ e valores de densitometria Western blot. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A proposta mecanicista central deste estudo é que a patologia induzida por Aβ1-42 suprime a sinalização PI3K/Akt, reduz a fosforilação inibitória do GSK-3β, promove a fosforilação da Gefirina, diminui a expressão da Gefirina e da Colibistina no hipocampo e contribui para o acúmulo de proteínas relacionadas à autofagia, enquanto o triptolido contrabalança parcialmente essas mudanças por meio de uma via associada a PI3K/Akt/GSK-3β. Este estudo mostra que a patologia semelhante à DA, induzida por Aβ1-42, é acompanhada de comprometimento do aprendizado espacial e da memória, lesão neuronal do hipocampo, aumento da deposição de Aβ, redução da expressão de Gefirina e Colibistina, aumento da fosforilação da Gefirina, alteração da sinalização PI3K/Akt/GSK-3β e acúmulo de proteínas relacionadas à autofagia. O triptolido reverteu parcialmente essas anomalias comportamentais, histológicas e moleculares, enquanto LY294002 atenuou seus efeitos. Esses achados apoiam um modelo no qual o triptolídeo protege proteínas associadas à sinapse inibitórias do hipocampo, ao menos em parte, por meio da regulação mediada por PI3K/Akt/GSK-3β da fosforilação da Gefirina e das alterações em proteínas relacionadas à autofagia. Deve-se notar que o modelo de injeção intracerebroventricular Aβ1-42 reflete principalmente neurotoxicidade induzida por Aβ e patologia semelhante à DA, em vez da progressão crônica e multifatorial completa da AD²¹ humana.

Gefirina e Colibitina são componentes centrais da organização sináptica inibitória. A Gefirina ancora receptores inibitórios de neurotransmissores em locais pós-sinápticos, enquanto a Colibitina promove o agrupamento e a localização da membrana. A redução da expressão dessas proteínas pode, portanto, prejudicar a estabilidade sináptica inibitória e contribuir para a função prejudicada da rede^{hipocampal 8}. Neste estudo, Aβ1-42 reduziu a expressão de Gefirina e Collybistina do hipocampo, enquanto o triptolido restaurou ambas as proteínas. O aumento da Gefirina fosforilada fornece um mecanismo plausível para a perda de Gefirina, já que a fosforilação em Ser270 foi associada à dispersão da Gefirina, redução do agrupamento e desestabilização de proteínas. A redução paralela na expressão de PI3K, fosforilação de Akt e fosforilação inibitória de GSK-3β sugere que Aβ1-42 enfraquece a sinalização PI3K/Akt e pode aumentar a atividade de GSK-3β, o que é consistente com o aumento da fosforilação de Gefirina. Por outro lado, o triptolido restaurou a fosforilação do Akt, aumentou a fosforilação inibitória do GSK-3β e reduziu a fosforilação da Gefirina, enquanto LY294002 enfraqueceu esses efeitos. Esses resultados sugerem que o triptolido pode preservar a expressão de Gefirina e Colibistina por meio da regulação associada à PI3K/Akt/GSK-3β da fosforilação da Gefirina. No entanto, como foram usados lisados completos do hipocampo, esses achados refletem mudanças na abundância e fosforilação de proteínas do hipocampo, em vez de evidências diretas de localização^{sináptica 22,23}.

Anormalidades relacionadas à autofagia também podem contribuir para as mudanças moleculares observadas neste modelo. A autofagia é importante para a proteostase neuronal, mas degradação autofágica comprometida na Alzheimer pode levar ao acúmulo de autofagossomos e substratos proteicos^{patológicos 24,25}. No presente estudo, Aβ1-42 aumentou tanto a razão LC3-II/I quanto a expressão de p62, sugerindo acúmulo de substratos LC3-II e relacionados à autofagogômica associados. O triptolido reduziu ambos os marcadores, enquanto LY294002 reverteu parcialmente esse efeito, sugerindo que o triptolido pode aliviar o acúmulo de proteínas relacionadas à autofagia por meio de um mecanismo dependente de PI3K/Akt. Juntamente com as mudanças na sinalização de Gefirina, Colibistina e PI3K/Akt/GSK-3β, esses achados ampliam a compreensão dos efeitos neuroprotetores do triptolito além das ações anti-inflamatórias ou neuroprotetoras gerais, sugerindo que o triptolido também pode influenciar proteínas de andaimes associadas à sinapse inibitórias, sinalização quinase e vias relacionadas à proteostase na patologia semelhante ao^{DA-associada a Aβ 26}.

Vários passos críticos determinam o sucesso e a reprodutibilidade desse protocolo. Primeiro, o estado de agregação de Aβ1-42 deve ser cuidadosamente controlado e verificado antes da injeção, pois a preparação peptídica pode influenciar fortemente os desfechos patológicos. Segundo, a injeção estereotáxica precisa nos ventrículos laterais é essencial; refluxo, colocação incorreta da agulha ou velocidade excessiva de injeção podem resultar em exposição variável ao Aβ e resultados comportamentais ou histológicos inconsistentes. Terceiro, o teste em labirintos aquáticos Morris requer pistas visuais estáveis, temperatura da água consistente e monitoramento da velocidade de natação para excluir comprometimento motor como fator de confusão. Quarto, a quantificação histológica e imunohistoquímica deve ser realizada usando regiões hipocampais de interesse pré-definidas e análise cega. Por fim, os resultados do Western blot dependem de carga proteica igual, concentração adequada em gel, transferência eficiente e uso de imagens de blot não recortadas para confirmar a especificidade da banda.

Várias limitações devem ser consideradas. Primeiro, o modelo de injeção Aβ1-42 não reproduz a progressão crônica, a patologia tau, as alterações vasculares ou a complexidade neuroimune da Alzheimer humana. Segundo, embora camundongos machos e fêmeas estivessem distribuídos uniformemente entre os grupos, o estudo não foi desenvolvido para análise estratificada^{por sexo 27}. Terceiro, lisados inteiros do hipocampo não conseguem determinar se mudanças na Gefirina e na Colibitina ocorrem especificamente nas sinapses inibitórias. Quarto, o mecanismo proposto PI3K/Akt/GSK-3β–Gefirina permanece associativo, pois a atividade do GSK-3β e a fosforilação da Gefirina Ser270 não foram manipuladas diretamente. Por fim, LC3-II/I e p62 são leituras estáticas de Western blot e não podem definir totalmente o fluxo autofágico dinâmico. Estudos futuros devem usar fracionamento sinpesômico, colocalização imunofluorescente com marcadores pós-sinápticos inibitórios, abordagens de ganho ou perda de função com GSK-3β, construções mutantes Gephyrina Ser270 e ensaios de fluxo baseados em inibidores lisossomales. Validação em modelos de Alzheimer transgênico crônico, modelos relacionados à tau e sistemas neuronais de origem humana também será necessária para determinar se essa via é amplamente relevante para a patologia¹⁴ da DA. Uma limitação adicional é que o estado de agregação da preparação exata Aβ1-42 usada para injeção estereotáxica não foi validado independentemente pela fluorescência da Tioflavina T, SDS-PAGE/Western blotting ou microscopia eletrônica de transmissão. Embora o peptídeo tenha sido preparado usando um procedimento prolongado de incubação a 37 °C comumente usado para promover a agregação de Aβ1-42, a variação de lote para lote no estado de agregação pode afetar os desfechos patológicos. Estudos futuros devem validar esse fluxo de trabalho em modelos crônicos de Alzheimer transgênico, modelos relacionados à tau e sistemas neuronais derivados de humanos. Experimentos adicionais devem incluir validação direta do status de agregação de Aβ1-42, avaliação da precisão da injeção estereotáxica usando contraste com corante ou verificação anatômica, fracionamento sinpesômico, colocalização imunofluorescente com marcadores pós-sinápticos inibitórios, abordagens de ganho ou perda de função de GSK-3β, experimentos com mutantes Gephyrina Ser270 e ensaios de fluxo autofágico baseados em inibidores lisossomal. Estudos de dose-resposta e segurança do triptolido também são necessários antes que aplicações translacionais possam ser consideradas

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Anticorpo primário para detecção por Western blot de Gephyrin total.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Anticorpo primário para detecção por Western blot de Gephyrin fosforilada.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Anticorpo primário para detecção por Western blot de Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Anticorpo primário para detecção por Western blot de PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de Akt total.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de Akt fosforilada.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de GSK-3β total.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de GSK-3β fosforilada.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Anticorpo de controle de carga para normalização de Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de LC3-I e LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Anticorpo primário para detecção por Western blot de p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Anticorpo primário para detecção de Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Anticorpo secundário para anticorpos primários de camundongo em Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Anticorpo secundário para anticorpos primários de coelho em Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Anticorpo primário para imunohistoquímica de Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Peptídeo amilóide-β usado para preparar a solução de injeção indutora de agregação.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Composto de teste administrado intraperitonealmente.
LY294002	ab120243	abcam	Inibidor de PI3K usado para o grupo de co-tratamento.
paraformaldeído	P0099	Beyotime	Fixativo para perfusão transcardíaca e pós-fixação de tecido.
xileno	108298	Merck	Reagente de desparafinização e esclarecimento de tecido.
etanol	100983	Merck	Reagente de reidratação e desidratação para secções de parafina.
propilenoglicol	294004	Merck	Componente de veículo para preparação da solução do medicamento.
inibidores de protease e fosfatase	P1045	Beyotime	Aditivo do tampão de lise usado para preservar proteínas e estados de fosforilação.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Tampão de lise para extração de proteína total do tecido hipocampal.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Tampão de recuperação de antígeno mediado por calor para imunohistoquímica.
pentobarbital sódico	P3761	Sigma	Anestésico usado para cirurgia e coleta de tecido.
Soro de cabra	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Reagente de bloqueio para imunohistoquímica.
membranas PVDF	ISEQ00010	Merck Millipore	Membrana usada para transferência de Western blot.
Labirinto aquático de Morris	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Aparelho comportamental e sistema de rastreamento de vídeo para avaliação de aprendizagem espacial e memória.
sistema de imagem de quimioluminescência	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Sistema de imagem para aquisição de sinal de Western blot quimioluminescente.
aparelho estereotáxico	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Aparelho usado para injeção intraventricular estereotáxica.
kit de dosagem de proteína BCA	P0006	Beyotime	Kit de dosagem colorimétrico para medição de concentração total de proteína.
leitor de microplaca	Synergy2	Biotek	Leitor de absorbância usado para medição do ensaio BCA.
ImageJ	versão 9.0.1	National Institutes of Health	Software de análise de imagem para histologia, imunohistoquímica e densitometria de Western blot.
GraphPad Prism	versão 8.5	GraphPad Software	Software de análise estatística e geração de gráficos.