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Artigo de método

In Vivo Imagem de Cálcio com Microscópio Miniaturizado no Hipotálamo para Compreensão de Comportamentos Sociais em Camundongos

963 visualizações

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DOI:

10.3791/70401

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20 de março de 2026

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha a imagem in vivo de cálcio de neurônios hipotalâmicos usando um microscópio miniaturizado (miniscópio) em camundongos que se comportam livremente durante manipulação do estado social (isolamento social e reunião social). Esse método permite a imagem, com resolução de neurônio único, da atividade hipotálmica que representa necessidade social e saciedade social, possibilitando estudos mecanicistas da homeostase social.

Resumo

O comportamento social em vertebrados é rigidamente regulado por circuitos hipotalâmicos. Tipos de neurônios hipotalâmicos definidos molecularmente foram recentemente identificados como codificando necessidades sociais de maneira homeostática. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para realizar imagens de cálcio in vivo no núcleo pré-óptico medial hipotalâmico (MPN) usando um microscópio miniaturizado montado na cabeça (miniscópio) em camundongos que se comportam livremente. Esse método permite registros longitudinais da dinâmica das populações neuronais durante o isolamento social e a reunião, possibilitando assim estudos mecanicistas de necessidade social e saciedade social em resolução de neurônio único. Especificamente, camundongos adultos recebem injeções estereotáxicas de um vírus adeno-associado (AAV) que expressa um indicador de cálcio geneticamente codificado no MPN, seguidas pela implantação de uma lente de índice de gradiente (GRIN) e de uma placa base de miniscópio. Após a recuperação, os camundongos se habituam ao sistema de imagem do miniscópio e são submetidos a isolamento social e reencontro programados, durante os quais as atividades neuronais são registradas por imagem. Sinais de cálcio são sincronizados com os comportamentos dos animais para análise posterior. Este protocolo fornece orientações abrangentes para imagens in vivo de cálcio com miniscópio no hipotálamo do camundongo durante comportamentos sociais. Ele pode ser facilmente adaptado para imagens em outras regiões profundas do cérebro e em diferentes contextos comportamentais. Essa abordagem conecta a atividade neural em nível celular e o comportamento social, avançando nossa compreensão da base neural do comportamento complexo em animais em movimento livre.

Introdução

A capacidade de manter laços sociais é fundamental para a sobrevivênciaanimal 1,2,3. O isolamento social prolongado induz ansiedade, déficits cognitivos e mudanças metabólicas, enquanto o reencontro restaura o engajamento social e as necessidadessociais 4,5,6. O rebote observado no comportamento social após isolamento social de curto prazo sugere a presença de um mecanismohomeostático 7, análogo à regulação dafome 8,9 ou sede 10,11,12. No entanto, os substratos neurais que mediam a homeostase social permanecem pouco compreendidos.

Trabalhos recentes revelaram que populações neuronais hipotalâmicas distintas codificam necessidade social e saciedade social,respectivamente 7. Imagens in vivo de cálcio mostraram que uma população de neurônios glutamatérgicos geneticamente definidos no núcleo pré-óptico medial (MPN) se torna ativa durante o isolamento (neurônios deisolamento MPN), enquanto outra população de neurônios GABAérgicos se torna ativa após a reunião (neurônios dereunião MPN). A ativação optogenética dos neurônios deisolamento MPN imita um estado de isolamento social, e a ativação optogenética dos neurôniosde reunião da MPN atenua o rebote social, sugerindo seus papéis opostos na regulação da necessidade social. Essas populações interagem reciprocamente e se conectam com circuitos neurais em todo o cérebro, formando um ciclo de retroalimentação que modula dinamicamente a necessidade social.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado com o objetivo geral de permitir que pesquisadores registrem a dinâmica do cálcio cerebral profundo com resolução de neurônio único em camundongos em movimento livre durante comportamentos sociais etologicamente relevantes, como isolamento social e reunião13. A combinação dessa técnica de imagem com paradigmas sociais etologicamente relevantes oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar a representação neural de estados sociais distintos. A justificativa para o desenvolvimento desse método adaptado decorre da necessidade de visualizar como a necessidade social e a saciedade são representadas dinamicamente em estruturas cerebrais profundas como a MPN. Embora o uso do miniscópio já tenha sido descritoanteriormente 14, 15, 16, seu uso durante interações sociais irrestritas, especialmente aquelas que envolvem transições entre isolamento e reencontro, requer adaptações técnicas e comportamentais específicas para manter a estabilidade óptica, minimizar artefatos de movimento e garantir uma expressão comportamental naturalista.

Comparada à fotometria de fibra, a abordagem baseada em miniscópio oferece resolução celular, permitindo a discriminação de distintos tipos funcionais de neurônios dentro da mesma região. Ele permite gravações de longo prazo de animais interagindo livremente, o que é essencial para estudar dinâmicas neurais impulsionadas socialmente. Estudos anteriores usando microendoscopia de um fóton focaram principalmente no córtex ou hipocampo dorsal durante tarefas espaciais ousensoriais 14,15,16. Nosso protocolo estende esses avanços para regiões subcorticais mais profundas durante comportamentos sociais complexos, fornecendo um modelo para investigar circuitos de estado afetivo sob condições naturalistas.

O protocolo é otimizado para regiões cerebrais de até ~5 mm de profundidade, utilizando implantação de lentes GRIN e indicadores de cálcio geneticamente codificados. Considerações-chave incluem precisão cirúrgica, posicionamento de lentes, desenho de paradigmas comportamentais e análise de dados relacionados. Esse método pode ser adaptado a outras áreas profundas do cérebro e contextos comportamentais. Este protocolo orienta os usuários em todas as etapas críticas: preparação cirúrgica, administração viral, implantação de lentes, design comportamental, fixação de miniscópio, imagem e análise de dados (Figura 1A-E). Prevemos que esse fluxo de trabalho acessível e detalhado permitirá o estudo de populações neurais profundas do cérebro em uma ampla gama de comportamentos naturalistas.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética animal da Westlake University com o protocolo animal #25-076-LD-9. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Recursos Animais de Laboratório da Universidade Westlake. Todos os equipamentos e materiais utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cirurgia de injeção de vírus

  1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia com isoflurano a 2-3%.
    NOTA: A indução bem-sucedida da anestesia é confirmada pela ausência do reflexo de beliscão do dedo do pé e pela presença de respiração constante e profunda.
  2. Após 2-3 minutos, ou quando o reflexo de endireitamento for perdido, transfira rapidamente o animal para o instrumento estereotáxico. Fixe o nariz no cone do nariz anestésico e mantenha a anestesia com 1-1,5% de isoflurano durante a cirurgia (Figura 1B). A taxa de fluxo de oxigênio normalmente é ajustada entre 0,8 e 1,2 L/min.
    NOTA: Monitore a frequência respiratória do animal e outros sinais fisiológicos. Se a frequência respiratória do animal aumentar e ele apresentar bigodes e outros sinais de acordar, aumente a concentração de isoflurano para 2-3%.
  3. Prenda os dentes incisivos do mouse através da barra incisiva do instrumento estereotáxico. Aperte o grampo do nariz para fixar a cabeça.
  4. Insira cuidadosamente duas barras auriculares nos canais auditivos externos até que descansem firmemente, garantindo uma fixação estável e rígida da cabeça (Figura 1B).
    NOTA: (1) Colocação inadequada que comprime os tecidos do pescoço pode causar dificuldade respiratória ou fixação instável. (2) Se o animal apresentar sinais de dificuldade respiratória ou dificuldade durante a fixação, libere e reposicione imediatamente as barras auriculares, pois isso indica potencial compressão das vias aéreas. (3) Certifique-se de que ambos os auriculares estejam na mesma altura. Isso é essencial para o nivelamento preciso do crânio posteriormente.
  5. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos do camundongo para evitar que os olhos ressecem.
  6. Remova o pelo da cabeça usando creme depilação. Limpe bem a área com lenços com etanol 75% para remover resíduos de creme e cabelo.
  7. Desinfete a pele exposta com lenços com etanol 75% e betadino. Usando tesouras cirúrgicas finas para fazer uma incisão sagital na linha média pelo couro cabeludo. Retraa a pele para expor totalmente o crânio sobre a região cerebral alvo. Limpe suavemente a superfície do crânio com um cotonete para remover o perióstio.
    NOTA: Expor uma área suficientemente grande do crânio é necessário para fornecer uma âncora robusta para o cimento dentário, garantindo a estabilidade a longo prazo do implante.
  8. Monte uma pipeta de vidro no suporte estereotáxico para medição da superfície do crânio. Sob um estereoscópio, localize a ponta da pipeta na bregma (a interseção das suturas sagital e coronal) e defina-a como origem (X = 0, Y = 0, Z = 0, Figura 1C).
  9. Mova a ponta da pipeta para posições ±2 mm laterais ao bregma e ajuste o nível do crânio até que a diferença de altura entre esses dois pontos seja dentro de ±0,03 mm.
  10. Depois, mova a pipeta para a lambda (a interseção das suturas sagital e lambdóide) e ajuste a inclinação anteroposterior até que a diferença de altura entre bregma e lambda esteja dentro de ±0,03 mm (Figura 1C).
    NOTA: (1) Uma avaliação visual prévia e ajuste do crânio podem agilizar significativamente o processo de nivelamento fino. (2) Secar a superfície do crânio com ar comprimido antes do nivelamento melhora a visibilidade dos pontos cranianos.
  11. Use uma broca manual com cabeça de perfuração de 0,8 mm para fazer uma craniotomia sobre a região cerebral alvo (por exemplo, para camundongos C57BL6/J). As coordenadas são em antero-posterior (AP) 0 mm, medial-lateral (ML) 0,3 mm e dorso-ventral (DV) -4,8 mm para atingir a região da MPN; para camundongos FVB/NJ, a craniotomia é realizada em AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm e DV -4,8 mm) (Figura 1C).
    NOTA: Em caso de sangramento, aumente temporariamente a concentração de isoflurano para 2-2,5%. Use uma ponta de algodão estéril ou uma esponja hemostática para absorver o sangue, depois aplique imediatamente soro fisiológico estéril. Devolva o isoflurano ao nível de manutenção (1-1,5%) após a hemostasia e remova o excesso de líquido.
  12. Após a craniotomia, realize a injeção estereotáxica do vírus que expressa o indicador de cálcio na região cerebral alvo.
  13. Diluir o AAV-hSyn-jGCaMP7f, um vírus adenoassociado usado para expressar um indicador de cálcio geneticamente codificado nos neurônios e permitir a imagem da atividade neuronal por meio de sinais de cálcio, até um título final de aproximadamente 5 × 10¹² genomas virais por mililitro antes da injeção.
  14. Encha uma pipeta de vidro com óleo mineral primeiro, depois com a solução viral, garantindo a ausência de bolhas de ar. Posicione a pipeta nas coordenadas do alvo na superfície do crânio e abaixe-a lentamente até a profundidade do alvo.
  15. Injetar o vírus unilateralmente em uma taxa lenta e constante (por exemplo, 30 nL/min), com um volume total de 400 nL7, para garantir a infecção de neurônios suficientes na região da MPN. Essa quantidade pode ser ajustada de acordo com tamanhos específicos das regiões cerebrais e se existem restrições adicionais, como o sistema Cre-loxP.
  16. Ao concluir, deixe a pipeta no lugar por 10-15 minutos para facilitar a difusão viral adequada e minimizar o refluxo ao longo da linha da injeção, antes de ser retirada lentamente.
    NOTA: (1) Alíquotas virais com títulos apropriados e consistentes são fundamentais para a expressão bem-sucedida e consistente entre animais. Título excessivamente alto pode causar neurotoxicidade, enquanto título insuficiente leva a expressão fraca e baixa relação sinal-ruído para imagem. (2) A lenta velocidade de injeção e o tempo suficiente de espera antes de retirar a pipeta são críticos para minimizar danos nos tecidos e prevenir o refluxo viral, garantindo expressão viral precisa e robusta na área alvo.
  17. Após a injeção do vírus, costure a pele acima do crânio com suturas absorvíveis.
  18. Injetar carprofeno subcutâneo (5 mg/kg) imediatamente após a cirurgia para analgesia, com monitoramento contínuo e administração extra conforme necessário nos 3 dias seguintes.
  19. Aloje o camundongo individualmente após a cirurgia de injeção viral por pelo menos 2-3 semanas para permitir a recuperação suficiente do animal e a expressão viral.
    NOTA: A implantação da lente GRIN (Seção 2) pode ser realizada no mesmo dia da injeção viral ou 2-3 semanas após a injeção viral. Neste protocolo, descrevemos o método de duas etapas, que permite ao experimentador avaliar a expressão viral durante a implantação da lente GRIN.

2. Implantação da lente GRIN

  1. Repita os passos 1.1-1.10 para reabrir a craniotomia. Raspe a superfície do crânio com um bisturi para melhor pegar o cimento dentário no passo 2.8. Para a nova craniotomia, o diâmetro deve ser ligeiramente maior que o da lente GRIN (tipicamente ~1 mm) para permitir uma implantação suave. Limpe meticulosamente todos os detritos ósseos após a perfuração.
  2. Para mitigar a compressão tecidual durante a implantação da lente GRIN, insira uma pipeta de vidro na região cerebral alvo e mova lentamente a pipeta de forma mediolateral para criar uma incisão. Esse microcorte tem ~1 mm de comprimento para criar espaço para implantar a lente GRIN (Figura 2A).
    NOTA: Esta etapa é fundamental para o sucesso de todo o protocolo.
  3. Antes de implantar a lente GRIN, desinfete a lente com etanol 75%, depois lave com soro fisiológico estéril e limpe suavemente com papel de lente.
  4. Segure a lente GRIN com um suporte e prenda o miniscópio no topo da lente.
  5. Posicione todo o conjunto na bregma e defina todas as coordenadas a zero (ou seja, X = 0, Y = 0, Z = 0). Depois, posicione-a nas coordenadas X-Y do alvo acima da craniotomia.
  6. Umedecida a superfície do crânio com soro fisiológico estéril. Abaixe muito lentamente a lente GRIN para dentro do tecido cerebral a uma taxa de aproximadamente 100 μm/min até que ela alcance o alvo (Figura 2B).
    NOTA: (1) Se a implantação da lente GRIN for realizada 2-3 semanas após a injeção viral, durante a inserção da lente, ligue o miniscópio para observar as mudanças de fluorescência em tempo real. À medida que a lente se aproxima da região alvo, o sinal fluorescente geral no campo de visão fica mais brilhante, e essa mudança pode ser lida diretamente do histograma do sinal em tempo real usando o software de imagem (Figura 2C, D). (2) Tome cuidado para evitar sangramentos durante a implantação, pois coágulos sanguíneos degradam significativamente a qualidade do sinal. (3) Se o sangramento for inevitável e severo, retire a lente GRIN, limpe a lente e reimplante-a após o sangramento parar.
  7. Após a implantação do cristalino, seque bem a superfície do crânio absorvendo o líquido residual e soprando com ar comprimido.
  8. Aplique cuidadosamente cimento dental para fixar a base da lente GRIN no crânio e construa uma touca completa que cubra o crânio exposto (Figura 2B). Tenha cuidado para evitar que o cimento entre em contato com os tecidos musculares ao redor. Depois, afluixa cuidadosamente o suporte da lente e remova o suporte junto com o miniscópio.
    NOTA: (1) Misture cimento dental em uma laje resfriada sobre gelo para desacelerar o processo de solidificação e proporcionar mais tempo de trabalho. (2) Recomenda-se adicionar uma barra de cabeça atrás da lente para segurar o mouse durante a conexão do miniscópio. (3) Tenha muito cuidado para não aplicar o cimento no suporte da lente ou no miniscópio.
  9. Prepare o adesivo de silicone em duas partes misturando seus dois líquidos. Aplique na parte superior da lente GRIN para formar uma vedação protetora contra poeira e riscos durante o período de recuperação.
  10. Após a implantação da lente GRIN, coloque o camundongo individualmente para evitar possíveis danos à lente por seus companheiros de gaiola durante a recuperação.

3. Instalação da base

  1. Duas a três semanas após a implantação da lente GRIN, é realizada a instalação da placa base. Anestesie e fixe o rato no instrumento estereotáxico conforme descrito acima.
  2. Remova o selo de silicone da parte superior da lente GRIN e limpe suavemente a superfície da lente com um pedaço de papel de lente.
  3. Prenda a base ao miniscópio. Monte todo o conjunto da placa base do microscópio no braço manipulador estereotáxico por meio de um suporte.
  4. Conecte o miniscópio à caixa de aquisição de dados e ligue a imagem ao vivo.
  5. Alinhe a objetiva do miniscópio e a lente GRIN implantada ajustando finamente o manipulador para alcançar um alinhamento coaxial óptico preciso entre o miniscópio e a lente GRIN.
  6. Posicione a objetiva do miniscópio paralela à superfície superior da lente GRIN e certifique-se de que a borda de toda a lente GRIN esteja incluída na janela de imagem, com um visual circular perfeito, e que o centro da lente fique no centro da janela de imagem.
  7. Abaixe o miniscópio para uma distância de trabalho ótima para obter imagens claras dos neurônios no plano focal alvo.
  8. Use cimento dentário para encapsular a base na tampa de cimento existente (Figura 2B).
    NOTA: (1) Um passo crítico é elevar o miniscópio em uma pequena distância empiricamente determinada (aproximadamente 50-100 μm) antes da fixação final para compensar o possível deslocamento do plano focal causado pela retração do cimento durante a solidificação. (2) Tenha muito cuidado para evitar que o cimento dentário entre em contato com qualquer parte do miniscópio que deve ser destacada após a instalação da base.
  9. Depois que o cimento dental estiver totalmente solidificado, afrouxe o suporte, desconecte cuidadosamente o microscópio da placa base e imediatamente rosqueie uma tampa na placa para proteger a interface óptica.
  10. Abrigue individualmente o rato por 3 a 5 dias após a instalação da base e depois reúna o rato com seus companheiros de gaiola por pelo menos 1 semana antes da manipulação do estado social (por exemplo, isolamento social).

4. Configuração de parâmetros de habituação e imagem

  1. Habitue os camundongos implantados a um restritor temporário de cabeça para fixação do miniscópio e ao sistema de imagem por 2 a 3 vezes antes das sessões formais de imagem.
  2. Para montar o miniscópio na placa base, prenda a cabeça dos camundongos implantados, remova a tampa da placa base e acople o miniscópio à placa base por meio de uma interface magnética. Depois, aperte o parafuso lateral para fixar o miniscópio. Realize imagens de cálcio por 10 minutos, durante os quais o animal se movimenta livremente na área de gravação ou na gaiola.
  3. Introduza estímulos, como um toque suave e um novo rato, durante esta sessão piloto de imagem. Analise os dados (veja detalhes na Seção 6) para verificar se sinais de neurônio único podem ser extraídos. Durante a habituação, determine as configurações ótimas de imagem ajustando o plano focal do miniscópio ao longo de sua distância de trabalho para maximizar o número de neurônios observados e a nitidez da imagem.
  4. Ajuste a potência de iluminação para ~10% do valor máximo e o ganho do sensor para ~10-20% do valor máximo para obter sinais claros sem saturação. Imagem na resolução espacial de 1280 x 800 com taxa de amostragem de 20 Hz. Salve essas configurações para cada animal e reutilize as configurações durante as sessões de imagem seguintes.

5. Ensaios sociais comportamentais para imagem de cálcio em miniscópios

  1. Ensaio de reunião social (Figura 3A)
    1. Isole o camundongo implantado no miniscópio por 1, 3 ou 5 dias antes da imagem. Realize imagens de cálcio durante a linha basal, reunião e reisolamento.
    2. Base: Conecte o mouse ao miniscópio e grave por 10 minutos, durante os quais o mouse permanece isolado.
    3. Reencontro: Adicione um antigo colega de prisão à câmara de gravação e grave por 10 minutos.
    4. Re-isolamento: Remova o colega de cagem após a reunião de 10 minutos e imagine por mais 10 minutos durante o re-isolamento.
  2. Ensaio de isolamento social (Figura 3B)
    1. Isole o camundongo implantado no miniscópio por 6 horas e registre sinais de cálcio no início de cada hora por 15 minutos.
    2. Adicione um ex-colega de cagem à câmara de gravação e registre por 10 minutos ao final de toda a sessão de imagem para identificar neurônios significativamente modulados pela reunião social (veja detalhes nas Seções 6 e 7).
      NOTA: (1) Este esquema específico de imagem é utilizado para minimizar o fotobranqueamento do sinal e permitir o monitoramento da atividade neuronal durante as primeiras 6 horas de isolamento social. (2) O miniscópio fica conectado durante todo o procedimento. (3) Essa abordagem permite o acompanhamento do mesmo conjunto neuronal durante toda a sessão de imagem. (4) Alimentos e hidrogel são fornecidos durante a imagem de imagem.

6. Pré-processamento de dados

  1. Importar vídeos brutos de imagem para o software de processamento de dados.
  2. Reduza espacial e temporalmente o vídeo original quando necessário para reduzir a carga computacional para a análise dos dados.
    NOTA: Para esta análise, os dados brutos de imagem são capturados com resolução espacial de 1280 x 800 a 20 Hz; Reduza espacialmente o vídeo por um fator de 4 e diminua temporalmente por um fator de 2.
  3. Aplique um filtro passa-banda espacial com a subtração média global para reduzir o ruído de alta frequência e a deriva de fundo de baixa frequência.
  4. Corriga artefatos de movimento usando o algoritmo de correção de movimento no software de processamento de dados. Inspecione visualmente o filme corrigido por movimento para garantir a estabilidade do somata neuronal e o mínimo de artefatos residuais de movimento.
  5. Clique no botão "Identificar Células" e escolha "CNMFe" na lista para extrair traços de atividade de cálcio de neurônios individuais com o algoritmo CNMF-E17 (Consttrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic Data).
  6. Clique no botão da régua no software de processamento de dados e meça os diâmetros dos somas (em pixels) de neurônios representativos. Insira o tamanho médio na caixa "Diâmetro médio da célula (pixels)". Depois, clique no botão Aplicar para rodar o CNMF-E.
  7. Ajuste as configurações de inicialização do CNMF-E quando a detecção de células é insuficiente, aparecem componentes excessivos não celulares ou ocorre segmentação excessiva.
  8. Inspecione todos os componentes extraídos e aceite/rejeite com base na morfologia celular e na dinâmica do cálcio biologicamente plausível. Exclua componentes com formas irregulares e espinhosas. Exclua traços dominados por ruído ou artefatos de movimento.
    NOTA: (1) As Figuras 2E e 2F mostram dois neurônios aceitos com morfologia clara dos neurônios, bem como os típicos transientes de cálcio. (2) As Figuras 2G e 2H mostram dois neurônios rejeitados com flutuações basais pronunciadas e ausentes de transientes típicos de cálcio.
  9. Exportar traços de fluorescência dos neurônios aceitos do software de processamento de dados para identificação posterior de neurônios modulados pelo estado social (Seção 7).

7. Identificar neurônios modulados pelo estado social

  1. Use MATLAB ou Python para analisar melhor os dados pré-processados.
  2. Alinhe os traços de atividade de cálcio dos neurônios aceitos a carimbos comportamentais.
  3. Encontre o momento da reunião social no vídeo de comportamento. Para cada neurônio, a atividade segmentada é um período de isolamento social pré-reunião de 300 s e um período de reunião social de 300 s.
  4. Para cada neurônio, quantifique as distribuições de atividade do cálcio durante os períodos de isolamento e reunião.
  5. Realize a análise da Característica Operacional do Receptor (ROC)18 para avaliar a capacidade da atividade neuronal de discriminar entre estados de isolamento e de reunião, obtendo um valor AUC que calcula a área sob a curva ROC.
  6. Avalie a significância estatística usando um teste de permutação. Para cada neurônio, os valores da atividade do cálcio são alternados circularmente entre estados comportamentais em bins de tempo de 1 s por 1.000 vezes para gerar uma distribuição nula dos valores AUC. Neurônios com valores observados de AUC superiores ao 95º percentil de sua distribuição nula embaralhada são considerados significativamente modulados pelo estado social.
  7. Classifique os neurônios significativamente modulados com base na direção da modulação. Classifique os neurônios inibidos pela reunião como os Neurônios de Isolamento e ativados pela reunião como os Neurônios da Reunião (Figura 4).

8. Verificação pós-experimento

  1. Perfunda os camundongos e faça uma histologia padrão para verificar a trajetória da lente GRIN e a expressão viral (veja um exemplo de imagem histológica na Figura 2I).
  2. Use o PFA de 4% para fixar toda a cabeça do rato junto com o implante, depois remova a lente GRIN para visualizar uma trilha clara da lente.
    NOTA: Inclua apenas os dados dos animais com a mira correta.

9. Solução de problemas e dicas práticas

  1. Fixe uma barra de cabeça com cimento dentário atrás do miniscópio para facilitar a montagem e remoção do miniscópio.
    NOTA: A barra de cabeça não deve ser muito longa e pode ser colocada em um ângulo levemente inclinado para evitar interferência no comportamento social.
  2. Aloje individualmente os camundongos implantados durante o período de recuperação após a cirurgia por pelo menos uma semana. Isso dá tempo suficiente para que os camundongos se recuperem e evita danos ao implante por outros camundongos.
  3. Reunisse os camundongos implantados com seus antigos colegas de cagem assim que estiverem totalmente recuperados. Verifique e aperte regularmente as tampas da tampa da capa. Prepare algumas tampas extras e substitua-as quando forem perdidas durante a manutenção do animal.
  4. Verifique os sinais de cálcio 3-4 semanas após a injeção do vírus GCaMP. Se os sinais forem muito fracos ou pouco claros, um período mais longo de recuperação às vezes melhora a qualidade dos sinais.
  5. Tenha cuidado com as superfícies da lente do lado da lente GRIN ou do lado do miniscópio. Mantenha as lentes limpas e livres de riscos. Cubra a lente quando não estiver usando.
  6. Antes da imagem, ajuste o comprimento do cabo de sinal para que fique longo o suficiente para que o animal alcance os cantos da área de imagem e curto o bastante para permitir interações sociais suaves.
  7. Proteja o cabo com uma camada de material resistente quando necessário para evitar que outros ratos mordam durante interações sociais. Verifique o cabo de sinal regularmente para monitorar se ele está torcido por interação social intensa.
  8. Para identificar o mesmo conjunto neuronal a partir de sessões consecutivas de imagem (por exemplo, na Figura 3B), os vídeos brutos de imagem poderiam ser concatenados para extrair traços de cálcio.
  9. Para sincronizar múltiplos sinais, por exemplo, os vídeos comportamentais e os sinais de cálcio, entradas TTL comuns e lanternas sincronizadas geralmente são usadas para alinhar diferentes arquivos de gravação.

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Resultados

Identificação de populações neuronais
Expressamos o vírus GCaMP e implantamos uma lente GRIN na MPN de um rato C57BL/6J. Após a cirurgia, o rato se recuperou individualmente e foi reunido com seus companheiros de gaiola por pelo menos uma semana. O camundongo ficou então alojado sozinho por 3 dias antes da sessão de imagem de cálcio. Durante a imagem de imagem, foi registrado primeiro um ponto de partida de isolamento de 10 minutos, seguido por uma reunião social de 1...

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Discussão

Este protocolo detalha uma abordagem integrada que combina imagens de cálcio in vivo em miniscópio com paradigmas sociais comportamentais para avaliar o perfil de atividade dos neurônios hipotalâmicos. Ele possibilita imagens de cálcio de longo prazo e resolução celular a partir de estruturas profundas do cérebro durante interações sociais naturais. As seções seguintes discutem os passos críticos, a importância metodológica, as limitações e o potencial futuro dessa abordagem.

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou conflito de interesses. O ChatGPT foi utilizado no processo de edição do manuscrito, com revisão cuidadosa e detalhada por todos os autores.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Professora Catherine Dulac pelo apoio ao treinamento inicial dos experimentos com miniscópios e a Yang Sun pela ajuda na realização da cirurgia. Esse trabalho foi apoiado pelo financiamento inicial da Westlake University e pela NOMIS Foundation, pelo Tan-Yang Center for Autism Research da Universidade de Harvard, pelo Jane Coffin Childs Medical Research Award para D.L. e pela Charles A. King Trust Postdoctoral Fellowship para D.L. Agradecemos a todos os membros do Liu Lab pelos comentários sobre o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pATaitoolS0587-9Vetores virais, cirurgia
Esponja de Gelatina Hemostática AbsirbávelFUKANGSENFKS-ACirurgia
Solução de betadina (10% iodadoPovidona) 500mLHYNAUTQ13702855HNW002Cirurgia
Câmera para vídeo comportamentalDAHENGMER2-160-227-U3CComportamento
CarprofenoMCEHY-B1227Cirurgia
Instrumentos Estereotaxicos DigitaisRWD68803Cirurgia
Etanol (75%)Reagente químico Sinopharm Co.,Ld801769610Cirurgia
Pomada para os OlhosFODUH37022025Cirurgia
Software de Processamento de Dados Inscopix (IDPS)Inscopix1000-006551Análise de Dados
IsofluranoRWDR510-22-10Cirurgia
Pacote adesivo Kwik-Sil de 2Instrumentos de Precisão MundialKWIK-SILCirurgia
MicrodrillRWD78001Cirurgia
Puxador de Micropipeta MP-1000RWDMP-1000Cirurgia
Soluções Multifuncionais de Anestesia AnimalRWDTAIJI-IECirurgia
Bomba de Microinjeção de NanolitrosRWDR-480Cirurgia
Miniscópio nVista 3.0Inscopix1000-004323Imagem
Pinça oftalmótricaRWDF12006-10Cirurgia
Tesouras de OperaçãoRWDS14001-15Cirurgia
Kit de Implante ProViewInscopix1000-004238Cirurgia e Imagem
Cimento de resina (Super-bond)Sun MedicalSuper Bond C & BCirurgia
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Referências

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