Alterações induzidas por eletroacupuntura nas vias motoras das proteínas na incontinência urinária de esforço pós-parto

Resumo

A eletroacupuntura melhorou os parâmetros urodinâmicos em um modelo de rato de incontinência urinária de esforço pós-parto e esteve associada à modulação de vias motoras relacionadas à proteína. Essas descobertas sugerem potenciais mecanismos moleculares subjacentes aos seus efeitos terapêuticos.

Resumo

A incontinência urinária de esforço pós-parto (IUE) impacta significativamente a qualidade de vida das mulheres, mas os mecanismos moleculares subjacentes dos tratamentos eficazes permanecem difíceis de alcançar. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos terapêuticos e as vias moleculares da eletroacupuntura (EA) em um modelo de IUE em ratos. Estabelecemos o modelo IS usando dilatação vaginal com balão (VBD) e randomizamos os participantes em grupos modelo e tratados com EA. A recuperação funcional foi avaliada por meio de testes urodinâmicos, que mostraram que a EA aumentou significativamente a pressão no ponto de fuga (LPP) e a capacidade máxima da bexiga (MBC). Análises histopatológicas usando hematoxilina e eosina e a coloração tricromática de Masson revelaram melhora na arquitetura muscular e uma redução de 42,3% na deposição de colágeno, além de respostas inflamatórias suprimidas. A proteômica quantitativa identificou 2.907 proteínas diferencialmente expressas (DEPs), com o banco de dados STRING destacando vias motoras de proteínas como alvos centrais. Especificamente, a EA reduziu seletivamente proteínas centrais, incluindo MYL1, TNNI2, MYLPF, TNNT3 e TNNT1. Esses achados, validados pelo western blot e qPCR, sugerem que a EA alivia a SIBI modulando a contratilidade muscular e remodelando o assoalho pélvico, fornecendo insights sobre os possíveis mecanismos subjacentes à terapia direcionada para IUE.

Introdução

A incontinência urinária de esforço (IS) é um distúrbio comum do assoalho pélvico que afeta de 15 a 35% das mulheres no pós-parto ^1,2, impactando significativamente sua qualidade de vida e saúde mental. Além dos sintomas físicos, a IUE pós-parto gera uma carga psicossocial considerável; Muitas mulheres sentem constrangimento, baixa autoestima e isolamento social. Essa condição pode diminuir sentimentos de feminilidade e levar à relutância em se envolver em diversas atividades, o que pode agravar o sentimento de isolamento e contribuir para a depressão^{pós-parto 3}. A IS também apresenta desafios econômicos devido aos custos associados a produtos de continência e consultas médicas. Embora existam opções de tratamento como treinamento do assoalho pélvico e intervenções cirúrgicas, suas limitações em eficácia e risco de recidiva destacam a necessidade de terapias mais eficazes e menos invasivas que mirem as causas subjacentes da IUE^{pós-parto 4,5}. A patogênese da IUE é multifatorial, envolvendo disfunção muscular do assoalho pélvico, degradação dos tecidos conjuntivos e lesões neuromusculares. O trauma mecânico durante o parto vaginal é um dos principais fatores que contribuem para a IUE^{pós-parto 6,7}. Além disso, a desregulação da remodelação da matriz extracelular — marcada por depleção das fibras de colágeno e metabolismo anormal da elastina — compromete as estruturas de suporte^{pélvico 8}. Evidências emergentes sugerem que a contratilidade comprometida dos músculos esfíncter uretral estriados é um fator crítico impulsionado pela expressão aberrante de proteínas específicas do músculo, incluindo proteínas motoras que regulam as interações^{actina-miosina 9}.

A eletroacupuntura (EA), uma adaptação moderna que integra acupuntura tradicional com estimulação elétrica, aumenta a eficácia terapêutica ao modular circuitos neurais e promover processos de reparação^tecidual 10,11,12,13. A EA tem demonstrado sucesso no manejo da dor, doenças neurodegenerativas e distúrbios urológicos, incluindo bexiga hiperativa e prostatite crônica. Seus efeitos são mediados por mecanismos duplos: (1) neuromodulação, que envolve a ativação dos nervos sensoriais somáticos e das vias centrais inibidoras^{da dor 14}, e (2) regulação em nível tecidual, promovendo a angiogênese, reduzindo a inflamação e restaurando a homeostase da matriz^{extracelular 15,16,17}. Notavelmente, a EA melhorou a função muscular do assoalho pélvico em pacientes com IUE, como demonstrado pelo aumento da pressão de fechamento da uretra e pelo aumento da atividade eletromiográfica. No entanto, as vias moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos do EA sobre a UE — particularmente seu papel na regulação das proteínas associadas à contratilidade muscular — permanecem inadequadamente compreendidas.

Durante o armazenamento na urina, a contração sustentada do esfíncter uretral é mantida pela regulação precisa das proteínas motoras e suas subunidades regulatórias, que orquestram as interações actina-miosina no músculo^estriado 18,19,20. No estado de repouso, subunidades inibitórias como a troponina I2 (TNNI2) — uma isoforma específica do músculo esquelético de contração rápida — se ligam aos filamentos de actina, estabilizando o complexo troponina-tropomiosina para bloquear os sítios de ligação à miosina e reforçar o relaxamento muscular^21,22. Simultaneamente, a cadeia leve de miosina 1 (MYL1), uma subunidade reguladora que modula a atividade da ATPase da miosina, permanece não fosforilada sob condições de baixo cálcio, o que limita a eficiência do ciclo de ponte^{cruzada 23}. Com a ativação neural durante o estresse físico, o influxo de cálcio desencadeia mudanças conformacionais no complexo da troponina: o cálcio se liga à troponina C (TNNC), deslocando o TNNI2 da actina, retraindo a tropomiosina e expondo os sítios de ligação à miosina. Simultaneamente, a miosina quinase de cadeia leve dependente de cálcio e calmodulina (mLCK) fosforila a MYL1, aumentando a atividade da ATPase da miosina e facilitando a formação de pontes cruzadas de actina e miosina com força. Subunidades estruturais, como a troponina T1 (TNNT1), garantem o alinhamento adequado do complexo de troponina na actina, permitindo respostas sincronizadas aos sinais de^{cálcio 24,25}. Na incontinência urinária de esforço (IUE), a superexpressão patológica de subunidades inibitórias (por exemplo, TNNI2) prolonga o bloqueio de actina-miosina, enquanto a desregulação de MYL1 e TNNT1 interrompe a montagem da miosina e a sensibilidade ao cálcio, prejudicando coletivamente a contratilidade do^{esfíncter 5,26}. Essas anomalias moleculares correlacionam-se com características histológicas da SU, incluindo fibras musculares desorganizadas e redução da resistência uretral. Restaurar a expressão fisiológica de TNNI2, MYL1 e TNNT1 surge assim como uma prioridade terapêutica, pois recalibra o equilíbrio contração-relaxamento, aumentando a capacidade adaptativa do esfíncter de gerar pressão de fechamento durante eventos de estresse.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., com número de aprovação IACUC-MIS2023045.

Estabelecimento do Modelo Rat SUI
Um total de 20 ratas Sprague-Dawley (SD), com idades entre 6 e 8 semanas, foram utilizadas para criar um modelo de lesão do assoalho pélvico, simulando o parto. Para induzir a dilatação vaginal por balão (DBV), os ratos foram anestesiados por meio de injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Um cateter de Foley de 10 Fr desinflado foi cuidadosamente inserido no canal médio vaginal, e então o balão foi inflado com 3 mL de soro fisiológico estéril. O balão foi mantido no lugar por 4 horas para replicar o prolongado alongamento mecânico dos músculos do assoalho pélvico e a compressão do nervo pudendo associada ao trabalho de parto. O período de modelagem foi de 7 dias. No 8º dia, 6 animais foram selecionados aleatoriamente para testes urodinâmicos.

O estabelecimento bem-sucedido do modelo foi verificado por meio de testes urodinâmicos e da medição dos níveis séricos de lactato desidrogenase (LDH), que servem como indicadores de lesão muscular. Após confirmar a modelagem bem-sucedida, os ratos SUE foram divididos aleatoriamente em um grupo operado por simulação e um grupo de tratamento, com cinco ratos em cada grupo. Ao mesmo tempo, cinco ratos SD normais foram fornecidos como grupo controle. No grupo simulado, agulhas de acupuntura foram inseridas nos pontos de acupuntura BL23 (localizados 6 mm laterais ao processo espinhoso L2) e GB30 (localizados na parte posterior da articulação do quadril) sem qualquer estimulação elétrica. No grupo de eletroacupuntura, os mesmos pontos de acupuntura foram estimulados usando um dispositivo de eletroacupuntura, seguindo o método padrão de tratamento clínico. O dispositivo de eletroacupuntura foi ajustado para uma forma de onda densa e esparsa de 1 Hz a 2 V. Cada intervenção durou 30 minutos por dia durante 10 dias consecutivos. Todos os animais eram monitorados diariamente e alojados em condições laboratoriais padrão. Ao final do experimento, foram realizados testes urodinâmicos nos animais de cada grupo. Posteriormente, cada grupo de ratos foi anestesiado com uma mistura de isoflurano a 3% e oxigênio de 1,0 L/min. Após a perda da consciência dos ratos, a concentração de isoflurano foi ajustada para 5%, e amostras foram coletadas após a morte dos ratos por insuficiência respiratória.

Testes urodinâmicos
Após anestesia induzida por isoflurano, os animais foram posicionados em posição supina e fixados. Uma incisão na linha média inferior do abdômen expôs a^{bexiga 18}. Um cateter epidural foi implantado através de uma fístula de 2 mm de diâmetro na cúpula da bexiga, avançado 0,5–1,0 cm para dentro do lúmen e fixado com uma sutura 11-0 por meio da técnica de cordão da bolsa. O cateter foi conectado a um sistema de monitoramento de pressão e perfundido com soro salino tingido com azul metileno a 37 °C a 10 mL/h via bomba de microseringa, com monitoramento simultâneo de pressão intravesical. A capacidade máxima da bexiga foi calculada como o produto da duração da infusão (o intervalo entre o início da infusão e a primeira gotícula do líquido uretral) e a taxa de fluxo. A pressão do ponto de vazamento (LPP) foi determinada registrando o pico de pressão intravesical imediatamente após a liberação abrupta da compressão abdominal aplicada manualmente. Todos os parâmetros foram adquiridos usando um sistema de análise urodinâmica, com medições triplicadas por métrica. Todas as amostras foram codificadas aleatoriamente e analisadas de forma simples-cega por três operadores independentes, cada um realizando uma única medição. Os resultados das três medições independentes foram usados para análise estatística.

Meça o nível sérico de lactato desidrogenase (LDH)
No sétimo dia pós-operatório, aproximadamente 1 mL de sangue total foi obtido da veia caudal de cada rato. As amostras coletadas foram deixadas em temperatura ambiente por 1 hora para permitir a formação de coágulos, após o que foram centrifugadas a 2.000 × g por 15 minutos. Aproximadamente 0,5 mL de sobrenadante foi cuidadosamente coletado como soro. Os níveis séricos de lactato desidrogenase (LDH) foram determinados quantitativamente usando um kit de ensaio de D-lactato desidrogenase, de acordo com os protocolos do fabricante.

Perfilamento Proteômico e Análise Bioinformática
Uma análise proteômica quantitativa foi realizada em tecidos musculares lisos uretrais isolados dos grupos modelo e de tratamento. As proteínas foram identificadas a partir de dados brutos de espectrometria de massa usando o Proteome Discoverer 2.4, com um limiar de taxa de falsa descoberta de 1%. A análise bioinformática de proteínas diferencialmente expressas (DEPs) foi realizada usando pacotes baseados em R: a análise de expressão diferencial foi realizada usando o pacote limma (|log2FC| > 1, ajustado p < 0,05), a análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) e a análise de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas usando o pacote clusterProferer, com termos/vias enriquecidos considerados significativos no p ajustado < 0,05 e valor q < 0,2; O agrupamento hierárquico foi visualizado usando o pacote pheatmap. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída usando o banco de dados STRING (v11.5, pontuação de confiança > 0.7).

Coloração por hematoxilina-eosina
Os tecidos do músculo liso do rato estavam fixados com 4% de paraformaldeído e embutidos na parafina. Seções seriadas (5 μm de espessura) foram preparadas usando um micrótomo e coradas com um kit padronizado de coloração H&E. A avaliação morfológica foi realizada usando microscopia de campo claro com ampliação de 40× a 400×, focando na integridade estrutural do tecido muscular, infiltração de células inflamatórias e remodelação da matriz.

Coloração Tricroma de Masson
De acordo com o protocolo experimental aprovado pelo comitê de ética, coletamos amostras dos animais no décimo dia de tratamento. Os tecidos musculares do rato foram fixados com 4% de paraformaldeído e parafina embutidos. Seções seriadas (5 μm de espessura) eram cortadas usando um micrótomo rotativo. Seções desparafinizadas foram tingidas com o tricromo de Masson. As seções tingidas foram fotografadas sob um microscópio de campo claro com ampliação de 100×.

Western blot
Proteínas totais foram extraídas do tecido muscular liso de rato por interrupção mecânica no tampão de lise RIPA mantido a baixa temperatura e suplementado com inibidores de protease. Os lisados foram clarificados por centrifugação a 10.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, e o sobrenadante contendo proteína foi coletado para análise. A concentração de proteína foi determinada com um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) usando albumina sérica bovina como padrão de calibração. Quantidades iguais de proteína (30 μg) foram carregadas em géis SDS–poliacrilamida de 10% ou 12% e separadas sob condições redutivas. Após a eletroforese, proteínas foram transferidas para membranas PVDF com tamanho de poros de 0,22 μm. As membranas foram incubadas em 3% de BSA por 1 hora em temperatura ambiente para bloquear sítios de ligação inespecíficos, seguidas por incubação noturna a 4 °C com anticorpos primários reconhecendo GAPDH, MYL1, TNNI2, TNNT1, TNNT3 e MYLPF. Após lavagem com TBST três vezes, anticorpos secundários marcados com HRP foram aplicados por 2 horas em temperatura ambiente. A detecção de sinais era realizada usando um substrato quimioluminescente, e as imagens eram capturadas com um sistema de imagem de luminescência. A quantificação da expressão proteica foi realizada por análise densitométrica, com o GAPDH servindo como referência interna.

PCR quantitativa em tempo real (qPCR)
As amostras de tecido foram lisadas usando um reagente de extração total de RNA, e o RNA foi isolado seguindo as instruções do fabricante fornecidas com o kit de extração de RNA. Primers específicos para genes foram projetados usando software dedicado (Tabela 1) e sua especificidade foi verificada por análise BLAST (homologia ≥18 bp, Tm = 58–62 °C). O RNA foi então transcrito reversamente usando um kit de transcrição reversa, e a expressão do gene alvo foi detectada usando um kit de detecção SYBR Green qPCR.

Análise estatística
Comparações estatísticas entre dois grupos foram realizadas usando um teste t com amostras independentes, enquanto as diferenças entre múltiplos grupos foram avaliadas usando ANOVA unidirecional seguida por análise post hoc de Bonferroni. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DS) ou média ± erro padrão da média (SEM). Um valor de p < 0,05 foi considerado indicativo de significância estatística.

Resultados

Parâmetros urodinâmicos em ratos com lesão por dilatação vaginal por balão
A função da bexiga, incluindo continência urinária e capacidade máxima da bexiga, foi avaliada antes e depois da modelagem. Análises urodinâmicas revelaram deteriorações estatisticamente significativas tanto na capacidade máxima da bexiga (MBC) quanto na pressão do ponto de fuga (LPP) após dilatação vaginal com balão (VBD) em comparação com o valor inicial (P < 0,05). O MBC diminuiu de 2,34 ± 0...

Discussão

A IUE, um distúrbio urológico comum que afeta mulheres no pós-parto, está patologicamente ligada a danos na estrutura de suporte do assoalho pélvico durante a gravidez e^{o parto 7,27,28}. Caracterizada por vazamento involuntário de urina durante atividades que aumentam a pressão intraabdominal (por exemplo, tosse, espirros ou exercícios), a IUE prejudica significativamente o bem-estar físico e psi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 & micro; Membranas m PVDF	Millipore	ISEQ00010
2 vezes; UniTaq SYBR qPCR Master Mix (ROX-)	TIANYAbiotecnologia	P1504
4% de paraformaldeído	GSbioth	GS539A
Kit de ensaio BCA	Dingguo Biotech	BCA02
Microscopia de campo claro	MSHOT	ml31
Kit de ensaio de d-lactato desidrogenase	Beyotime	P0392S
Reagente ECL Prime	Cytiva	RPN2232
Aparelho de eletroforese	WIX	miniPro4
Sistema Totalmente Automatizado de Análise de Imagens por Quimioluminescência	FUJIFILM	LAS-3000
Anticorpo GAPDH	Biociências de Afinidade	T0004
Anticorpos secundários conjugados com HRP	Biociências de Afinidade	S0001, S0002
Software ImageJ 1.54	NIH
Kit de coloração tricroma da Masson	GSbioth	GS800A
Anticorpo MYL1	Clone de Nuvem	PAB105Ra01
Anticorpo MYLPF	Biociências de Afinidade	DF9048
Nome	Empresa	Número de catálogo
PowerLab Chart v5.2.1	ADInstruments
Software Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft
PrimeScript RT Master Mix	TAKARA	RR036A
Software Proteome Discoverer 2.4	Thermo Fisher Scientific
Aparelho de filme rotativo semi-seco rápido	Bio-Rad	788BR04132
Sistema quantitativo qPCR de fluorescência em tempo real	TIANLONG	TL100
Buffer de lise RIPA	Beyotime	P0013B
Kit de extração de RNA	Aidlab	RN70
Microtomo rotativo	Leica	RM2235
Géis SDS-PAGE	Beyotime	P0052A, P0053A
H& padronizada Kit de coloração E	GSbioth	GS700A
Buffer TBST	biosharp	BL346A
Anticorpo TNNI2	Clone de Nuvem	PAD230Ra01
Anticorpo TNNT1	Clone de Nuvem	PAD231Ra01
Anticorpo TNNT3	Clone de Nuvem	PAD233Hu01
reagente de extração de RNA total	biosharp	BL258A
Sistema de testes urodinâmicos	Techman	BL-420