Artigo de método

Dissecação do cérebro e do intestino em populações de peixes de superfície e peixes das cavernas de Astyanax mexicanus

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DOI:

10.3791/70412

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24 de fevereiro de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar e extrair componentes inteiros do cérebro e do intestino de morfostipos adaptados à superfície e a cavernas de Astyanax mexicanus. Esse protocolo pode ser adaptado para uso em aplicações posteriores, incluindo transcriptômica, metabolômica e análise da microbiota intestinal.

Resumo

Os peixes teleósteos são usados para responder a uma ampla gama de questões de pesquisa, que vão desde o desenvolvimento até genética e neurociência, e mais recentemente, para entender as complexidades do eixo intestino-cérebro e, em um contexto mais amplo, do eixo intestino-cérebro-fígado. O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, tem sido cada vez mais utilizado em estruturas comparativas e evolutivas de desenvolvimento devido à disponibilidade de morfótipos morfologicamente e fisiologicamente distintos, incluindo peixes de superfície que vivem em rios e peixes das cavernas cegos adaptados a cavernas. A adaptação a habitats de cavernas está associada a mudanças em traços morfológicos, comportamentais e diversidade da microbiota intestinal que também são encontradas em condições laboratoriais. Isso abriu a possibilidade de fazer perguntas sobre as interações entre o microbioma, atividade metabólica, adaptação neural e saídas comportamentais complexas. Essas interações agora podem ser abordadas por meio de estudos de mapeamento cerebral completo com cérebros limpos e sequenciamento da microbiota intestinal para detectar diversidade bacteriana associada a fenótipos adaptados à superfície e a cavernas. No entanto, a maioria desses estudos se beneficiaria de órgãos e tecidos inteiros intactos, cuidadosamente dissecados e preservados, o que permite o pós-processamento em aplicações posteriores. Esse protocolo descreve um método passo a passo para a dissecção do cérebro e intestino, onde todo o cérebro e órgãos abdominais são removidos e isolados para morfostipos tanto de peixes de superfície quanto de peixes das cavernas.

Introdução

Modelos animais, incluindo peixes vertebrados, são ferramentas essenciais para modelar fenômenos biológicos e patologias complexas em sistemas relativamente mais simples e acessíveis. Por exemplo, o peixe-zebra, Danio rerio, é um dos modelos de peixes teleósteos mais amplamente utilizados, com uma infinidade de métodos aplicados para estudar seu desenvolvimento, genética, fisiologia e comportamento, com impacto significativo nas ciências biomédicas eneurocomportamentais 1,2,3,4,5,6,7,8 . Uma grande vantagem de usar peixe-zebra atualmente é a disponibilidade de vários métodos para estudar histologia e patologia de órgãos e tecidos em linhas mutantes com perda de função, para os quais existem protocolos de dissecação passoa passo 3,9,10.

No entanto, vários outros modelos de peixes teleósteos têm surgido nas últimas décadas, adequados para levantar outros tipos de questões, incluindo aqueles nos campos da biologiaevolutiva 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, mecanismos biológicos subjacentes ao envelhecimento 2,22, toxicologia23,24 e outros25,26. Um exemplo disso é o caso do tetra mexicano, Astyanax mexicanus, um peixe teleósteo originário do nordeste do México, com populações ancestrais de peixes da superfície que vivem em rios e mais de 30 populações de peixes-cavernas cegos que vivem em cavernas (Figura 1)12.

Os peixes-caverna adotaram um conjunto de características morfológicas, incluindo perda ocular12,27, perda depigmentação 28, expansão dos sistemassensoriais 17,29,30 e aumento do armazenamentode gordura 12,31, que lhes permitiram sobreviver em habitats hostis de cavernas. Esses peixes também adotaram um conjunto de traços comportamentais, incluindo redução no sono19,20,ansiedade 32, cardume33 eagressividade 13,18,19,20,29,34,35,36,37, em comparação com seus peixes ancestrais da superfície. A adaptação da maioria dessas características provavelmente resultou de uma combinação de variação genética e pressõesambientais 35,36,28, que incluem diferenças de habitat entre os rios e as cavernas. Um modelo cada vez mais útil para fazer perguntas sobre o impacto da variação genética na adaptação morfológica e comportamentalde traços 16,18,19,20,35,38,39 e, mais recentemente, na diversidade da microbiota intestinal 14,15, questões que podem exigir a coleta de órgãos como cérebro, intestinos, fígado e outros, há necessidade de um protocolo padronizado de dissecação de anatomia macroscópica que possa ser usado pela comunidade em geral. Embora dissecações do cérebro inteiro e de órgãos em A. mexicanus já tenham sido feitas antes, falta um método completo e abrangente que permita entender como realizar esses tipos de dissecações de forma eficiente em tempo, o que é fundamental para muitos tipos de projetos, incluindo aqueles que exigem coleta de amostras para metabolômica40, metagenômica41, ou imagem de órgãointeiro 16,38. Nosso objetivo é remover a barreira de solução de problemas para acessar órgãos neste modelo para pós-processamento, permitindo que os usuários da comunidade se concentrem de forma fluida em suas pesquisas.

Neste protocolo, delineamos um método passo a passo para dissecação cerebral e gastrointestinal em peixes adultos de superfície e peixes-cavernas Pachón da espécie Astyanax mexicanus. Essa metodologia pode ser adaptada a uma variedade de protocolos posteriores, incluindo aqueles associados ao microbioma intestinal, metabolômica tecidal e limpeza cerebral para imagem cerebral inteira em um microscópio de folha de luz. Essa técnica também é adaptável para aplicação simultânea ao mesmo esmécime.

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Protocolo

Este protocolo é conduzido de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC 2024-0004 e A790125 no Centro de Ciências Moleculares e no Campus de Ciências Médicas da Universidade de Porto Rico.

1. Montagem pré-dissecação

  1. Se usar uma placa de Petri Sylgard (SP) para dissecação, certifique-se de que estejam preparadas antes do procedimento, levando em conta que pode levar alguns dias para fixar.
  2. Para preparar um prato SP, use Sylgard 184 e Elastomer 184 em uma proporção de 10:1. Misture 200 g de base Sylgard 184 com 20 g de elastômero em um copo descartável. Despeje em placas de Petri até cerca de um terço a metade da profundidade. Bata na panela para remover as bolhas e tampa. Certifique-se de que os pratos estejam cheios e deixados em uma superfície nivelada. Deixe curar por pelo menos 1 semanae 42.
    NOTA: Se coletar amostras para sequenciamento de rRNA 16s ou metagenômica, evite usar pratos SP. Em vez disso, utilize placas de Petri esterilizadas e de uso único e siga a técnica asséptica sob um exaustor de fluxo laminar. Se seguir a técnica asséptica, recomenda-se limpar a capela de fluxo laminar com etanol 70%, um detergente germicida e, idealmente, expor a capuz a uma lâmpada C ultravioleta germicida por 15 minutos. Isso deve ser feito antes de colocar materiais/ferramentas desinfetados e autoclavados dentro da capela de fluxo laminar.
  3. Monte um microscópio de dissecação com papel toalha dos dois lados. Designe um lado para armazenamento de resíduos (por exemplo, excesso de tecido de órgãos) e o outro lado para a colocação de ferramentas de dissecação esterilizadas. Corte pequenos pedaços de papel toalha para limpar as ferramentas entre as dissecações.
  4. Prepare 1 PBS e mantenha-o em uma pasta de gelo fria e à mão caso seja necessário limpar áreas ou amostras para melhor visibilidade. Dependendo do protocolo, escolha não usar o 1PBS.
    NOTA: Não é recomendado, por exemplo, ao coletar amostras para sequenciamento metagenômico43. Se for usado 1 PBS nesse tipo de abordagem, recomenda-se coletar uma amostra de 1PBS para sequenciamento para rastrear possíveis contaminações.
  5. Coloque a SP (ou uma placa de Petri esterilizada de uso único) sob o microscópio e certifique-se de ter todas as ferramentas à mão (kit de dissecação, tubos de microcentrífuga para coleta de tecido em gelo, etc.).
  6. Coloque 1 PBS e tubos de microcentrífuga rotulados em um balde de gelo próximo. Tenha um conta-gotas plástico na mão para 1 PBS.
  7. Montem uma estação de eutanásia para peixes perto daqui. Prepare um banho de gelo colocando uma polpa de gelo em um aquário com uma grade plástica dentro, depois encha com água do sistema de peixes (do sistema ou aquário doméstico).
    NOTA: O MS-222 também pode ser usado, dependendo dos protocolos posteriores (precisas de pós-processamento de exemplo).

2. Dissecação cerebral em peixes adultos de superfície e peixes das cavernas

  1. Eutanasie peixes em uma mistura de gelo. Certifique-se de que não haja movimento, e o peixe afunda no fundo, sem movimento opercular. O tempo depende do tamanho. Peixes maiores demoram mais para parar o movimento opercular.
    NOTA: Peixes juvenis levam aproximadamente 2-5 minutos para cessar o movimento opercular (eutanásia), enquanto peixes adultos e grandes podem levar cerca de 10-15 minutos. Existem diferenças baseadas em morfótipos. Algumas populações de peixes das cavernas podem demorar mais do que peixes de superfície para anestesia/eutanásia. Os protocolos de manejo e experimentais recomendam validação de procedimentos de anestesia e eutanásia entre populações, pois as respostas podem variar entre morfos epopulações 11.
  2. Transfira peixes para uma placa de Petri esterilizada e de uso único dentro da capuz) e, com um conta-contas, banhe com PBS 1x gelada (Figura 1).
  3. Destaca-se a cabeça do corpo cortando com um bisturi cerca de 2 mm atrás das brânquias (Figura 2). Isso protege parte do mesencéfalo e permite a manipulação do cérebro após a dissecação, sem causar danos. Remova o corpo em direção à área de resíduos usando uma toalha de papel e depois coloque-o em um saco de risco biológico dentro do recipiente de resíduos para descarte.
  4. Com pinças finas ou hemostato, segure bem a parte posterior da cabeça do peixe. Com uma microtesoura, corte as bordas da boca em direção à parte de trás da cabeça e das guelras (Figura 3).
  5. Repita do outro lado. Remova a mandíbula e depois limpe bem a parte inferior com um segundo par de pinças finas ou ultrafinas.
    NOTA: Siga o contorno interno das guelras.
  6. Nesse ponto, mantenha-se firme na cabeça do peixe com um hemostado ou prenda-o com um pino em T no SP (se estiver usando), cuidadosamente pela ponta da boca.
  7. Descolhe ambos os olhos usando pinças ou tesouras ultrafinas. Insira a ponta na borda do olho e então puxe ou corte suavemente o olho (Figura 4).
    NOTA: Não aplicável a peixes das cavernas (raspam a pele da área dos olhos).
  8. Raspe uma linha sagital no topo da cabeça que passa entre os olhos da frente para trás e divide a cabeça em esquerda e direita. Depois, use a micro tesoura para cortar a linha de forma superficial (Figura 5).
  9. Com pinças finas, comece cuidadosamente a puxar os dois lados da cabeça, tomando cuidado extra para não quebrar o cérebro embutido sob o tecido conjuntivo. Uma vez que o cérebro está visível, com a ponta de uma pinça superfina, separe o cérebro do crânio (Figura 6).
    1. Evite esmagar o cérebro puxando com pinça. Em vez disso, segure-a pelo cérebro posterior ou pela medula espinhal se ainda houver algum resquício dela para preservar a integridade.
    2. Se o cérebro ainda estiver de um lado da cabeça, use a pinça ultrafina para separá-lo cuidadosamente do crânio da cama, inserindo delicadamente as pontas atrás do cérebro e levantando delicadamente. Evite puxar o tempo todo, pois isso pode quebrá-lo.
  10. Depois de extraído o cérebro, limpe delicadamente com pinças ultrafinas, eliminando qualquer gordura ou tecidos ao redor. Coloque em um tubo de microcentrífuga ou armazenamento apropriado para o protocolo a jusante. Neste ponto, preservar todo o cérebro ou coletar sub-regiões do cérebro (por exemplo, telencefalo, tectum óptico, bulbos olfativos) (Figura 7).
  11. Isolamento de telencéfalo: Para extrair o telencéfalo, belisque a base entre o telencéfalo e o tectum óptico com uma pinça ultrafina e separe o telencéfalo do restante do cérebro. Transfira para o tubo de armazenamento apropriado.
  12. Se for usado para metagenômica, colete amostras rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. Faça isso mergulhando o tubo da microcentrífuga em nitrogênio líquido por 5 s.

Figura 1
Figura 1: Morfostipos de Astyanax mexicanus . (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Descolamento da cabeça. (A) Peixe da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Remoção da mandíbula de uma cabeça de peixe solta. (A) Peixe de superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Remoção do olho de uma cabeça de peixe solta. Em peixes de caverna, a raspagem da área pode ser realizada para afinar o tecido. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5
Figura 5: Corte sagital através da face superior da cabeça do peixe. (A) Peixe da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. Barra de escala: 5 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Separação das porções laterais da cabeça e exposição do cérebro dentro da cavidade craniana. (A) Peixe de superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. (C,D) Remoção do cérebro do lamento craniano. Barra de escala: 5 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: Anatomia regional do cérebro de A. mexicanus . (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. Barra de escala: 5 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Dissecção intestinal em peixes adultos de superfície e peixes das cavernas

  1. Siga o método para eutanásia conforme descrito acima.
  2. Seque o peixe com um lenço sem fiapos antes de colocá-lo em um SP limpo e cubra com 1 PBS gelado (ou água do sistema, dependendo da aplicação a jusante) com o conta-gotas para manter o tecido úmido.
  3. Prenda o peixe no SP (se estiver usando) com pinos em T.
    1. Se não estiver usando um SP, um hemostat para segurar fortemente para frente a partir da boca durante os cortes já é suficiente. Coloque o pino anteriormente dentro da órbita ocular (também vale para peixes das cavernas), garantindo que ele alcance a SP.
    2. Passe por trás pelo rabo até a placa. Certifique-se de que o peixe permaneça imóvel durante o procedimento.
      NOTA: Se realizar dissecação gastrointestinal no mesmo espécime que a dissecação cerebral, decapite rapidamente com um bisturi antes de iniciar a dissecação e prender o peixe à superfície da placa. Faça um corte diagonal anterior atrás do opérculo que preserve o topo da cabeça e evite o intestino. Idealmente, divida a cabeça e o corpo e faça com que dois dissecadores experientes trabalhem em cada um para maior eficiência de tempo. O alfinete anterior pode ser colocado na parte superior anterior do corpo após a decapitação, enquanto o alfinete posterior permanece no mesmo local (Figura 8).
  4. Usando microtesouras de dissecação, corte a pele e o músculo subjacente ao longo da linha média ventral, desde a nadadeira anal/ânus em direção ao opérculo (a cobertura dura sobre as brânquias) em uma linha semicircular seguindo a curva da parte inferior do peixe (Figura 9).
  5. Remova o opérculo e a nadadeira peitoral com a microtesoura e pinças finas.
    NOTA: Essa etapa ajuda a tornar a remoção da pele mais eficiente, mas pode retardar a dissecação e pode ser omitida, dependendo das necessidades.
  6. Corte a pele e o músculo subjacente acima da nadadeira anal e depois corte anteriormente em direção às brânquias, estendendo a incisão ventral conforme necessário (Figura 10). Isso, no fim das contas, cria uma janela.
  7. Abra a incisão com a ajuda de pinças finas para expor a cavidade corporal. Use as pinças finas para segurar a pele e levantá-la suavemente para remover (Figura 11).
  8. Corte tanto as fixações anteriores quanto posteriores do intestino e retire cuidadosamente todos os órgãos internos – remova o sistema gastrointestinal do corpo e coloque-o em uma área limpa da SP (ou placa de Petri esterilizada de uso único) (Figuras 12 e Figura 13).
  9. Primeiro, separe o fígado do restante dos órgãos abdominais com a pinça ultrafina. Se isolar o fígado, coloque-o em um tubo de microcentrífuga ou use um método de armazenamento apropriado de acordo com o protocolo ou necessidade a jusante. Estique-se cuidadosamente o estômago e identifique as porções do intestino médio/posterior (Figura 14).
  10. Desprenda o estômago do intestino médio/posterior do intestino.
  11. Segure as extremidades anterior e posterior do intestino médio/posterior com pinças finas e estique-as suavemente para estendê-las até o comprimento total.
  12. Recolha tecido em um tubo de microcentrífuga e armazene adequadamente.
  13. Se for usado para metagenômica, colete amostras rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. Isso é feito mergulhando o tubo da microcentrífuga em nitrogênio líquido por 5 segundos.

Figura 8
Figura 8: Colocação do pino para dissecação gastrointestinal. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9
Figura 9: Corte da parte inferior para pré-dissecação. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10
Figura 10: Remoção do opérculo e criação de uma janela. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 11
Figura 11: Remoção da pele lateral superficial e dos músculos. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 12
Figura 12: Órgãos in situ na cavidade corporal do peixe adulto após a remoção de músculo e pele. (A) Peixe de superfície fêmea com cavidade abdominal exposta e ovos removidos para expor órgãos. (B) Peixe macho de superfície com cavidade abdominal e órgãos expostos. (C) Fêmea de peixe-caverna Pachón com cavidade abdominal exposta e ovos removidos para expor órgãos. (D) Macho Pachón Cavefish com cavidade abdominal e órgãos. Setas pretas apontam para a região onde o feixe gastrointestinal é encontrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 13
Figura 13: Feixe gastrointestinal removido da cavidade corporal do peixe. (A) Peixe da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14
Figura 14: Órgãos gastrointestinais isolados de peixes de superfície e peixes-das-cavernas. (A) Peixes da superfície. (B) Peixe-caverna Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Seguindo esse protocolo, o conteúdo cerebral e intestinal foi extraído, e medições do comprimento do intestino completo, telencefalo e tectum óptico foram feitas e comparadas entre os morfostipos de peixes de superfície e de peixes das cavernas de Pachón (Figura 15). Utilizamos testes t de Welch com amostra independente para comparações estatísticas, com um tamanho amostral de n = 6 peixes de superfície e n = 6 peixes das cavernas de Pachón. Peixes de superfície apresentavam dimensõ...

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Discussão

A crescente relevância da A. mexicanus como modelo de pesquisa em diversos campos, que vão da evolução à neurociência biomédica e microbiologia, exige um método padronizado de dissecação e coleta de órgãos. Embora estruturas isoladas tenham sido estudadas e documentadas anteriormente, incluindo o tectum óptico16,38, o coraçãoadulto 11 eoutros 11,44

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Divulgações

Não há conflito de interesses. Todos os procedimentos seguem o protocolo aprovado pela IACUC 2024-0004.

Agradecimentos

Este trabalho é financiado pela bolsa NIH 5R16EY037336-02, bolsa RCMI U54 MD007600 e bolsa NIH 1P20GM156713-01 (COBRE Puerto Rico Center for Microbiome Sciences).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Aquário de Reprodução de Peixe-Zebra de 1,0 litroTecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankPara preparar a polpa de gelo para eutanásia. O tanque é meio cheio de gelo e então o tanque interno perfurado é colocado por cima. Depois, ele é preenchido com água até o topo.
Panela de gelo de poliuretano 4LUSA ScientificItem #2328-7242
Sacolas de Resíduos de Risco BiológicoFisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x Concentrado Líquido, Grau de Biologia Molecular, EstérilMilliporeSigma65074L
Microscópio Dissecador Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
Pinças de Tecido DissecantesFisherbrand08-953G
Pinos de dissecação, pack de 100Ferramentas de Ciências Domésticashttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
Pinça, Delicada, Pontas Extra Finas e Afiadas MOPECAB132
Pinça, tecido, ponta delicada super finaMOPECAB047
Hemostato, 12,5 cm, retoInstrumentos de precisão mundialhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
Pinças de joalheiros, Dumont nº 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-LKimberly-Clark34155
Nitrogênio líquidoFornecido pela Instituição
Tesoura Micro Noyes, 12 cmInstrumentos de precisão mundial500228
Papel toalhaFornecido pela Instituição
Placas de Petri com tampa transparente, 95 mm, 15 mm, redondasFisherbrandFB0875714G
Lâminas de Bisturi, #22, pack de 10Ferramentas de Ciências Domésticashttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
Cabo de bisturi #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
Tesoura, Dissecação de ÍrisMOPECAA146
Tesoura, Micro SuperfinoMOPECAA152
Pipetas de Transferência Descartáveis PadrãoTermo Científica13-711-9D
Microcentrífuga Eppendorf estéril 1.5 & micro; Tubos LEppendorf05-402-25
Sylgard 184Ciências da Microscopia Eletrônica24236-10
Termo-FrascoLab-Line Instruments Inc.2119
Tesoura Ultra FinaInstrumentos NEWMEDNM-DI-206023
Água adequada para eletroforese, PCRSigma-AldrichW4502-1L

Referências

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