Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Resumo

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Resumo

Ilhotas pancreáticas são essenciais tanto para o transplante clínico quanto para estudos pré-clínicos voltados para entender os mecanismos e a progressão do diabetes. No entanto, o progresso nesses campos é frequentemente limitado pela disponibilidade de ilhotas de alta qualidade, já que estratégias terapêuticas emergentes exigem preparações maiores, limpas e padronizadas. Este artigo apresenta um protocolo padronizado de alta produtividade para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de ratos Lewis. O método combina perfusão intradutal do pâncreas com uma mistura enzimática definida, digestão conjunta de múltiplos pâncreas e separação baseada em densidade para maximizar o rendimento, minimizando a fragmentação e eliminando a necessidade de seleção manual rotineira. O rendimento das ilhotas é quantificado usando duas abordagens complementares: um método tradicional de contagem baseado em alíquotas, comumente usado em ambientes clínicos, e um método semi-automatizado baseado em imagem de preparação completa. Em um isolamento representativo de 12 pâncreas, a contagem manual resultou em aproximadamente 3.300 ilhotas equivalentes (IEQ) e 2.700 ilhéus absolutos por pâncreas (~39.600 IEQ totais), com uma distribuição de tamanho de 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) e 6% (>250 μm). Em comparação, a análise automatizada de preparação completa relatou 16.350 IEQ totais (1.362 IEQ/pâncreas), destacando a variabilidade inerente na quantificação baseada em alíquotas. As preparações apresentaram pureza de 98% por coloração com ditilona, e a viabilidade das ilhotas foi mantida em 98% in vitro nos dias 3 e 7 após o isolamento. A avaliação funcional por secreção de insulina estimulada estática pela glicose demonstrou um aumento de 10 vezes na liberação de insulina após uma estimulação de 1 hora com 16,7 mM de glicose. No geral, este protocolo oferece uma abordagem reprodutível e eficiente para gerar preparações de ilhéus de alta pureza e funcionalmente intactas, que podem ser usadas imediatamente sem limpeza adicional. Ilhéus mantêm uma função robusta em cultura por até sete dias, permitindo flexibilidade para ensaios in vitro em grande escala, bem como para estudos de transplante in vivo .

Introdução

O transplante de ilhotas pancreáticas representa uma estratégia viável para restaurar a produção endógena de insulina em indivíduos com diabetes tipo 1 (T1D⁾¹. Além do diabetes tipo 1, a biologia das ilhotas é cada vez mais relevante para o diabetes tipo 2 (DT2), uma condição caracterizada por disfunção e perda progressiva de células β, bem como para pacientes submetidos a pancreatectomia parcial ou total por pancreatite crônica, tumores pancreáticos ou lesão traumática. Nesses contextos, o acesso a ilhotas de alta qualidade é essencial para avançar terapias celulares, modelar a falha β-celular, estudar interações imunes a ilhotas e ilhotas estromais e desenvolver abordagens regenerativas^{emergentes 2}. Consequentemente, procedimentos robustos e reprodutíveis de isolamento de ilhotas são críticos para apoiar tanto a pesquisa mecanicista quanto o desenvolvimento translacional em uma ampla gama de distúrbios endócrinos pancreáticos.

Embora as ilhotas constituam menos de 2% da massa pancreática, elas exercem um papel desproporcionalmente significativo na homeostase da glicose. Sua vulnerabilidade intrínseca à hipóxia, superdigestão enzimática, estresse oxidativo e cisalhamento mecânico os torna particularmente sensíveis a lesões relacionadas ao^{isolamento 3,4,5}. Mesmo desvios sutis na temperatura, oxigenação ou manuseio dos tecidos podem prejudicar o acoplamento estímulo-secreção β-célula ou desencadear apoptose, devido a defesas antioxidantes limitadas e alta demanda^{metabólica 6,7}. Como resultado, a maioria dos protocolos convencionais enfatiza o uso rápido a jusante, tipicamente dentro de 24-48 horas após a colheita, tanto em ambientes clínicos quanto experimentais 8,9,10,11,12. Embora esse arcabouço de "uso imediato" minimize a deterioração, ele restringe a flexibilidade experimental, dificulta estudos longitudinais e complica os esforços para acumular um número suficiente de ilhotas para grandes ensaios in vitro ou experimentos de transplante in vivo.

Entre os modelos de roedores, os ratos Lewis são amplamente utilizados para pesquisas com ilhotas devido ao seu histórico genético endogámico, perfil imunológico estável e características fisiológicas^{reprodutíveis 14}. Diferenças dependentes da tensão no rendimento, resposta e resiliência das ilhotas são bem documentadas. De Groot et al. demonstraram que ilhéus de rato Lewis apresentam secreção superior de insulina estimulada pela glicose em comparação com outras cepas, ressaltando sua adequação para estudos funcionais, metabólicos e de^{transplante 15}. Trabalhos adicionais confirmaram sua confiabilidade para pesquisas imunológicas e de alo-/^{xenotransplante} 14,15,16. No entanto, em laboratórios, a variabilidade no rendimento, pureza e função das ilhotas permanece uma barreira significativa. Grande parte dessa variabilidade surge de inconsistências na mistura enzimática, técnicas de perfusão intradutal, manuseamento do pâncreas, tempo de digestão e estratégia^{de purificação 17}.

Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos um protocolo reproduzível passo a passo para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de ratos Lewis. Esse fluxo de trabalho é otimizado para maximizar o rendimento, minimizar a fragmentação e preservar a viabilidade funcional. Importante, estabelece parâmetros claros, incluindo equivalentes em ilhotas (IEQ), viabilidade ao longo do tempo, pureza e secreção de insulina estimulada pela glicose, que permitem aos pesquisadores distinguir de forma confiável isolamentos bem-sucedidos de subótimos 18,19,20. Ao melhorar tanto o rendimento quanto a longevidade, o protocolo aumenta a flexibilidade experimental e pode reduzir o número de animais doadores necessários, apoiando um desenho experimental mais ético e escalável.

Diferente de muitas abordagens tradicionais, o método atual demonstra que ilhotas de rato Lewis podem ser mantidas em cultivo por até 7 dias com viabilidade e função preservadas, ampliando sua utilidade para estudos in vitro prolongados. O protocolo incorpora ainda uma estratégia simplificada de processamento agrupado, capaz de lidar com até 30 pâncreas em um único lote, permitindo uma digestão uniforme e reduzindo a variabilidade entre amostras. Com a pureza endócrina atingindo 98%, o procedimento elimina a necessidade de seleção manual intensiva e reduz as oportunidades de contaminação microbiana. Comparado com métodos de digestão em etapa única ou em massa, que frequentemente produzem preparações impuras ou mecanicamente^{comprometidas 13}, esse fluxo de trabalho de alta produtividade gera de forma confiável um grande número de ilhéus limpos e de qualidade de transplante, adequados para ensaios in vitro , perfilamento metabólico e estudos de transplante in vivo .

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Houston Methodist (IACUC, protocolo #IS00007362) e conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Lei de Bem-Estar Animal.
NOTA: Os materiais e instrumentos usados ao longo do protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

1. Preparação antes do dia da colheita e isolamento

1. Prepare as seguintes soluções sob condições assépticas dentro de um armário de biossegurança (veja a Tabela 1) e armazene todas as soluções a 4 °C até o uso.
   Solução de enxágue de penicilina-estreptomicina (Pen-Streptocópico).
   Mídia de lavagem.
   Amortecendo o amortecedor.
   Mídia da cultura das ilhotas.
   Buffer de Krebs.
2. Esterilize ferramentas e equipamentos via autoclav.
   1. Kit cirúrgico de colheita de pâncreas do autoclave: cortinas cirúrgicas, gaze, pinças de tecido de dente de rato, pinças planas, pinças finas e curvas, uma tesoura de pele, tesouras micro-dissecantes, dois pequenos hemostáticos e um hemostato curvo.
      NOTA: Autoclave dois pâncreas coletando pacotes cirúrgicos caso haja dois operadores cirúrgicos.
   2. Kit cirúrgico de limpeza de pâncreas em autoclave: pinças finas e curvas e tesouras microdissecadoras.
   3. Autoclave uma folha de alumínio de 30 cm x 30 cm.
   4. Autoclave 1-6 béqueres de 600 mL e 1 L, de acordo com o número de pâncreas a serem processados (ver Tabela 2).
   5. Autoclave um crivo de 500 μm.
   6. Autoclave de duas agulhas espinhales de 14 G, caso uma obstrua com tecido pancreático não digerido.
   7. Autoclave de um tubo de seringa para cada seringa de 50 mL necessária (veja a Tabela 3).
3. Prepare o banho-maria para a digestão.
   1. Encha o banho-maria equipado com um agitador orbital com água ultrapura autoclavada até que ele esteja a 3/4 de polegada acima do nível da plataforma.
   2. Adicione 3 mL de solução antimicrobiana e mantenha a tampa fechada para minimizar a contaminação.

2. Preparativos no dia da colheita e isolamento

1. Prepare seringas gradientes.
   1. Remover soluções de gradiente de ilhéus 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ e 1,069 g/cm³ preparadas e usadas nas próximas etapas e "Purificação de Ilhéus" passo 5.2, do armazenamento a 4 °C, e permitir que se equilibrem à temperatura ambiente (cerca de 1 h).
      NOTA: O volume de gradiente necessário variará conforme o número de pâncreas a serem processados; consulte a Tabela 3 para garantir volumes descongelados adequados de gradientes selecionados.
   2. Pré-carregue e rotule as seringas de 50 mL com gradientes de 1,096 g/cm³ e 1,069 g/cm³.
      1. Misture vigorosamente as soluções de gradiente de densidade de 1,069 e 1,096 g/cm³.
      2. Carregue os volumes apropriados, conforme a Tabela 3, em seringas de 50 mL equipadas com tubos cirúrgicos e uma agulha de 16 G.
      3. Após o recheio, tape as agulhas para manter a esterilidade e deixe as seringas de lado para uso subsequente na etapa 5.5 da "Purificação de Ilhéus".
   3. Mantenha um gradiente de 1,108 g/^{cm 3} em temperatura ambiente até uso posterior.
2. Prepare uma solução enzimática de meios de dissociação (WDM) de trabalho, coloque em seringas para perfusão e béqueres autoclavados.
   1. Trabalhe em condições estéreis em um armário de biossegurança e mantenha todas as soluções no gelo.
   2. Descongelar alíquotas de colagênase, termolisina e DNase I no gelo.
   3. Dilua reagentes enzimáticos em um béquer estéril de 1 L usando WDM para alcançar as seguintes concentrações finais: colagênase 0,15 mg/mL, termolisina 5 μg/mL e DNase I 0,1 mg/mL (Tabela 2).
   4. Misture o WDM suavemente usando um movimento giratório 10 vezes. Não misture com uma pipeta; Preserve a atividade enzimática girando suavemente.
   5. Um a um, coloque 10 mL da solução enzimática WDM em cada seringa de 10 mL usando uma agulha de 16 g para preenchimento rápido, depois substitua por uma agulha de 25 G x 1/2" com tampa para perfusão posterior do pâncreas.
   6. Enrole seringas carregadas com papel alumínio autoclavado e coloque no gelo até o uso.
   7. Distribua o excesso de WDM igualmente em béqueres estéreis de 600 mL para armazenar o pâncreas colhido, conforme a Tabela 2. Cubra cada béquer com papel alumínio estéril e mantenha-o no gelo (Tabela 2).
3. Prepare o espaço de trabalho de cultura celular.
   1. Ligue o agitador orbital do banho-maria, ajustado para 130 rpm e 37 °C. Deixe assim durante a colheita do pâncreas.
   2. Coloque os seguintes itens sob luz UV no armário de biossegurança por 1 hora para esterilização adicional.
      Peneira estéril de 500 μm.
      Béquer estéril de 1 L.
      Bomba de seringa.
   3. Certifique-se de que a incubadora de cultura celular esteja ajustada para 25 °C 5% CO_2.
   4. Ajuste a centrífuga para 4 °C, com aceleração e desaceleração em 9.
4. Reúna materiais para colheita e siga para a sala cirúrgica.
   1. Limpador de pâncreas designado:
      1. Reúna um balde grande de gelo para guardar a quantidade necessária de béqueres de WDM de 600 mL e a solução de enxágue para pâncreas (veja Tabela 1 e Tabela 2).
      2. Reúna 1 placa de Petri estéril para cada 6 pâncreas a serem processadas.
      3. Junte 1 tesoura microdissecadora estéreis e 2 pinças pequenas e curvas delicadas.
   2. Colhedor de pâncreas designado:
      1. Reúna um kit cirúrgico estéril de colheita.
      2. Junte luvas cirúrgicas estéreis.
      3. Junte uma bandeja de gelo com seringas WDM de 10 mL pré-carregadas, seladas em papel alumínio autoclavado.
5. Na sala cirúrgica, prepare a estação de colheita do pâncreas.
   1. Ligue o esterilizador de contas de vidro para esterilizar as ferramentas cirúrgicas, submergindo-as por 1 minuto no esterilizador entre cada animal. Os instrumentos podem ser resfriados rapidamente por imersão em PBS 1x estéril.
   2. Coloque uma absorvente sob o campo de visão do microscópio para detectar qualquer sangue ou solução enzimática WDM vazada.
   3. Ajuste o microscópio para uma ampliação total de 6,3x entre as lentes ocular e objetiva.
   4. Abra a bolsa cirúrgica e vista luvas cirúrgicas estéreis usando técnica asséptica.
   5. Prossiga com a colheita cirúrgica.
6. Na sala cirúrgica, prepare a estação de limpeza do pâncreas.
   1. Despeje solução suficiente de Pen-Strep para preencher metade de uma placa de Petri de 100 mm (cerca de 6 mL) para submergir o pâncreas isolado e colocar sobre gelo.
   2. Abra a bolsa cirúrgica e vista luvas cirúrgicas estéreis usando técnica asséptica.
7. Na sala cirúrgica, prepare a câmara de eutanásia.
   1. Coloque as bandejas de reservatório em uma gaiola para ratos vazia, limpa e re-selável.
   2. Encha as bandejas até a metade com isoflurano.
   3. Coloque a bandeja perfurada sobre os reservatórios para evitar derramamentos enquanto os ratos forem colocados dentro.
   4. Sele o topo da câmara com a tampa da gaiola.
8. Prossiga para a colheita do pâncreas.

3. Colheita de pâncreas

1. Coloque os ratos um de cada vez na câmara de eutanásia sobre a bandeja para uma overdose rápida de isoflurano.
   NOTA: O tempo de eutanásia necessário para o rato varia, especialmente à medida que o isoflurano evapora.
2. Confirme a ausência de pulso e respiração de cada rato.
3. Confirme a eutanásia com um método secundário que não perturbe a cavidade abdominal (por exemplo, punção cardíaca).
   NOTA: Outros métodos primários de eutanásia são aceitáveis; No entanto, a sobredose de isoflurano é preferida, pois a eutanásia rápida minimiza a hipóxia das ilhotas de ilóus.
4. Borrife o pelo abdominal de cada rato com 70% de etanol para enrolar e evitar pelos soltos no campo cirúrgico.
5. Coloque o rato eutanasiado em deitado sob o microscópio com a cabeça distal ao operador. Certifique-se de que a cavidade abdominal superior esteja sob o campo de visão do microscópio.

Figura 1: Exposição cirúrgica e perfusão intraductal do pâncreas do rato. Ilustração das etapas principais na exposição e perfusão do pâncreas através do Esfíncter de Oddi. (A) Eutanasiei rato Lewis com a cavidade abdominal aberta. (Aa) Colocação de pinça do ducto biliar comum e da veia hepática. (B) Vista ampliada do duodeno mostrando hemostatos marcando a região do Esfíncter de Oddi. (Bb) Agulha de perfusão posicionada dentro do ducto pancreático principal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Colhe o pâncreas (papel do colhedor de pâncreas):
   1. Faça uma incisão em "V", usando tesouras de pele, começando pela sínfise púbica em direção a cada caixa torácica lateral para acessar a cavidade abdominal (veja a Figura 1A).
   2. Retraa o intestino delgado e grosso para o lado esquerdo do animal usando pinças planas para limpar o "espaço de trabalho" da cavidade abdominal.
   3. Desdobre o duodeno usando a pinça plana e os hemostáticos curvos. Certifique-se de que o ducto biliar comum e a veia porta hepática estejam no campo de visão do microscópio.
   4. Retrair a cefala hepática e clampear o ducto biliar comum e a veia hepática usando os hemostatos curvos. Clampe 1-2 mm do fígado (veja a Figura 1Aa).
      NOTA: Os passos 3.6.1-3.6.4 e 3.6.8 podem ser feitos por meio de visualização direta. Use o microscópio para todas as outras etapas para garantir a manipulação delicada dos tecidos.
   5. Sob a visão do microscópio, usando a pinça plana e os hemostatos planos, mobilize suavemente o conteúdo do duodeno para eliminar o esfíncter de Oddi.
      NOTA: Certifique-se de que o conteúdo do duodeno seja deslocado do local pretendido de inserção da agulha.
   6. Isole a região ao redor do esfíncter de Oddi prendendo suavemente o duodeno com os hemostatos planos, aproximadamente 5 mm de cada lado do esfíncter. Garantir compressão mínima para preservar a integridade do tecido (veja a Figura 1B).
   7. Usando uma seringa estéril de WDM, insira a agulha cuidadosamente pela parede duodenal, passe pelo esfíncter de Oddi e avance para o ducto pancreático principal para perfusão (veja a Figura 1Bb).
      1. Assim que a agulha passa pelo esfíncter de Oddi, mantendo pressão constante, perfunde 7-10 mL de WDM no pâncreas a uma taxa de cerca de 500 μL/s até que o pâncreas esteja totalmente distendido.
         NOTA: Certifique-se de que o bisel esteja levantado e a agulha paralela ao ducto pancreático para minimizar o trauma. Comece a injetar imediatamente após a inserção. Isso ajudará a dilatar o esfíncter e o ducto, facilitando o avanço da agulha. O pâncreas é considerado totalmente distendido quando a cauda do pâncreas, localizada próxima ao baço, fica visivelmente perfusa.
   8. Excise o pâncreas dissecando-o suavemente das estruturas ao redor na seguinte ordem: baço, estômago, intestino grosso, duodeno e mesenterio.
      NOTA: Use dissecação contundente para minimizar danos tecidos. Proceda sequencialmente para manter a orientação anatômica e reduzir a tensão nas conexões vasculares e ductais.
      1. Remova ambos os hemostatos planos do duodeno.
      2. Use a pinça plana para prender o ligamento esplenopancreático (que conecta o pâncreas ao baço) e aplique tração suave.
      3. Usando a pinça fina e curva de dissecação, mobilize cuidadosamente e separe o pâncreas das fixações esplênicas adjacentes.
      4. Desprenda o pâncreas do estômago levantando o tecido pancreático com pinças finas e curvas e aplicando uma contratração suave com pinças planas.
      5. Depois, usando a pinça plana, aplique tração firme para avasculhar o intestino grosso do pâncreas.
      6. Levante o intestino delgado usando a pinça plana e dissece o mesentério do pâncreas usando a pinça fina e curva.
      7. Levante suavemente o pâncreas perfundido com a pinça plana e use a tesoura fina de dissecação para cortar quaisquer fixações restantes no tecido conjuntivo.
   9. Transfira imediatamente o pâncreas excisado para uma placa de Petri contendo solução de enxágue gelada e prossiga imediatamente para colher o próximo pâncreas, enquanto o limpador começa a limpar o pâncreas.
7. Limpe o pâncreas (função de limpador de pâncreas):

Figura 2: Limpeza do pâncreas de rato perfundido. Visualização sequencial do pâncreas antes e depois da remoção de tecido não essencial. (A) Pâncreas perfundido imediatamente após a dissecação, com tecido adiposo adjacente, linfonodos e estruturas conjuntivas visíveis. (B) Pâncreas perfundido com principais marcos anatômicos rotulados. (C) Pâncreas limpo após a remoção do excesso de tecido, mostrando a aparência final antes da digestão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Use as pinças finas curvas e as tesouras finas de dissecação para cortar cuidadosamente linfonodos, tecido adiposo, mesenterio e grandes vasos vasculares do pâncreas perfuso, se presentes (ver Figura 2).
2. Transfira o pâncreas limpo para um béquer estéril de 600 mL contendo 25 mL de WDM frio. Cubra o béquer com papel alumínio estéril para manter a limpeza entre a transferência do espaço cirúrgico para o espaço de cultivo celular.
   1. Substitua a solução de enxágue na placa de Petri a cada 6 pâncreas para evitar contaminação.
   2. Registre o momento em que o primeiro pâncreas é colocado no gelo. Isso será usado para documentar o tempo da isquemia fria.

8. Depois que todos os pâncreas forem extraídos e limpos, prossiga rapidamente para a fase de digestão no espaço de trabalho de cultura celular.

4. Digestão do pâncreas

1. Pause as rotações do shaker orbital e prenda o(s) béquer(es) coberto(s), contendo pâncreas, nos suportes designados do banho-maria.
2. Rapidamente, reinicie o agitador orbital ajustado a 130 rpm e inicie um temporizador de 10 minutos para o tempo de digestão (veja a Figura 3A).
   NOTA: Registre este ponto como o fim do período da isquemia fria. Registre cada colheita de ilhotas com seu tempo total correspondente de isquemia fria em um registro laboratorial.
3. No minuto 5, gire manualmente o béquer no sentido horário e depois no sentido anti-horário para ajudar na dissociação dos tecidos.
4. No marco de 8 minutos, retire a solução de têmpera do armazenamento a frio e transfira-a para o armário de biossegurança para uso imediato posterior ( veja a Tabela 1).
5. Na marca de 10 minutos, transfira rapidamente e submerga béqueres no gelo para desacelerar a atividade enzimática ( veja a Figura 3B).
   NOTA: A partir deste ponto, manuseie todos os tecidos, células e soluções sobre gelo para preservá-los até o passo 4.20, utilizando gradientes de densidade à temperatura ambiente.
6. Transfira a parte externa do béquer e a bandeja para um armário de biossegurança.
7. Adicione o tampão de tampão de têmpera em proporção 1:1 com a solução no béquer para interromper a digestão (aproximadamente 75-100 mL por béquer).
8. Aspire e expelle a suspensão de tecido de forma suave e repetida usando uma seringa de 50 mL equipada com uma agulha espinhal de 14 g para dissociar grandes fragmentos de tecido (ver Figura 3C).
9. Transfira a suspensão para tubos cônicos de 200 mL.
10. Enxágue o béquer com 5 mL de substrato de lavagem e faça um decante para o tubo cônico de 200 mL contendo a digestão da ilhéu para coletar o restante da digerência.
11. A centrífuga digere a 200 × g por 5 minutos a 4 °C. Certifique-se de usar adaptadores e almofadas adequadas para garrafas de centrífuga para segurança.
12. Decante cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet em 100 mL de substrato de lavagem usando a mesma agulha espinhal de 14 g de antes.
13. Filtre a suspensão por meio de uma peneira estéril de 500 μm colocada sobre um béquer estéril de 600 mL para remover qualquer tecido grande e não digerido.
    NOTA: Se a perfusão e a limpeza do pâncreas forem realizadas de forma ideal, o tecido adiposo mínimo e nenhum pâncreas não perfundido permanecerão sobre a peneira.
14. Enxágue a peneira com 10 mL de meio de lavagem para recuperar o tecido preso.
15. Transfira o filtrado para novos tubos cônicos de 200 mL.
16. Centrifuge a 200 × g por 5 minutos a 4 °C.
17. Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de lavagem de 100 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
    NOTA: Garanta perda mínima de células ao pré-umedecer as pontas da pipeta com um tampão contendo FBS antes da exposição aos ilhéus.
18. Centrifuge a 600 × g por 5 minutos a 4 °C.
19. Aspire cuidadosamente o sobrenadante para obter um pellet seco.
20. Ajuste a temperatura da centrífuga para 22 °C em preparação para a separação do gradiente.
    NOTA: Isso pode ser acelerado operando a centrífuga a 2000 x g por 15 minutos a 22 °C, sem amostras.

5. Purificação de ilhotas

1. Consulte a Tabela 3 para determinar o número de tubos cônicos de 50 mL necessários.
   NOTA: Consulte a Tabela 3 para distribuir o volume total do pellet de forma uniforme, garantindo que aproximadamente 2-3 mL de digestão do pellet sejam divididos em cada tubo gradiente. Se uma separação fraca das bandas dos ilhotas for observada posteriormente, utilize tubos de gradiente adicionais para melhorar a resolução da separação.
2. Pré-umede uma ponta de pipeta sorológica de 10 mL com a solução de gradiente de densidade de 1,108 g/cm³ para evitar que ilhéus aderam à superfície interna da ponta.
3. Resuspenda cada pellet de tecido em 15 mL de solução gradiente de 1,108 g/cm³ por 2 mL de volume de pellet usando a pipeta sorológica pré-umedecida de 10 mL. Apesar do volume total ultrapassar 10 mL, a largura menor da pipeta facilita uma mistura mais controlada e uma dissociação eficiente do pellet. Misture suavemente até ficar uniforme.
4. Dispense cuidadosamente 15 mL da suspensão da célula no fundo de cada tubo cônico de 50 mL, evitando contato com as paredes do tubo para garantir níveis de gradiente limpos.
5. Usando as seringas de gradiente pré-carregadas, sobreponha sequencialmente 10 mL de gradiente de 1,096 g/cm³, seguido por 10 mL de gradiente de 1,069 g/cm³.
6. Dispense cada gradiente a uma taxa de 5 mL/min usando uma bomba de seringa, posicionando a ponta da agulha de 16 G contra a parede interna do tubo para evitar a mistura de gradiente.
7. Centrifuge os tubos a 700 × g por 15 minutos a 22 °C, com a aceleração da centrífuga ajustada para 3 e a desaceleração para 0 para evitar a mistura de gradiente.
   NOTA: Dado o tempo de desaceleração estendido, todo o ciclo de centrifugação leva aproximadamente 45 minutos. Monitore o tempo de perto, pois as ilhotas devem ser coletadas rapidamente para evitar mistura de gradientes e possíveis danos celulares. Se necessário, prepare tubo(s) contrapeso(s) pelo peso, não por volume, para levar em conta as diferenças de densidade. Após remover os tubos, reajuste a centrífuga para 4 °C, e acelere e desacelere para 9 para os passos seguintes.
8. Após a centrifugação, identifique a camada de ilhéus localizada nas interfaces entre as camadas gradiente de 1,069-1,096 g/cm³ e 1,096-1,108 g/cm³ (ver Figura 3D).
9. Aspire e descarte cuidadosamente qualquer tecido coletado na camada superior usando uma pipeta Pasteur pré-umedecida com substrato de lavagem.
10. Molhar outra pipeta Pasteur, recolher a camada de ilhéu e transferi-la para um tubo cônico pré-resfriado de 200 mL contendo 5 mL de meio de lavagem.
11. Aumente o volume do tubo cônico pré-resfriado de 200 mL para 200 mL com meio de lavagem.
12. Centrifuge a 600 × g por 5 minutos e decante o sobrenadante.
13. Ressuspenda o pellet em 30 mL de meio de lavagem usando uma ponta sorológica pré-umedecida de 10 mL.
14. Transfira a ressuspensão para um novo tubo cônico de 50 mL usando uma ponta sorológica pré-umecida de 10 mL para melhor pelletagem de ilhas.
15. Enxágue o mesmo tubo cônico de 200 mL com 20 mL de meio de lavagem e transfira para o tubo cônico de 50 mL contendo os ilhotes restantes.
16. Centrifuge a ilha cônica de 50 mL com ilhotas e meio de lavagem a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
17. Decante o sobrenadante e resuspenda o pellet de ilhotas em 50 mL de meio de cultivo de ilhotas (ver Tabela 1).
    NOTA: Remova as alíquotas de 100 μL durante esta etapa ao contar ilhotas com o método manual de quantificação.
18. Placar uniformemente ilhéus em placas de Petri de 100 mm sem cultivo de tecidos, usando uma placa para cada cinco pâncreas de rato Lewis processadas.
    1. Calcule o volume total de meios de ilhéu necessário usando a fórmula (número de pâncreas ÷ 5 × 10 mL).
    2. Resuspenda o pellet do ilhéu na metade do volume calculado do meio e depois distribua a suspensão uniformemente pelo número determinado de placas.
    3. Enxágue o tubo cônico de 50 mL contendo ilhéus residuais com a metade restante do meio calculado e pipete essa lavagem sobre as mesmas placas para atingir um volume final de 10 mL por prato (veja a Figura 3E).
19. Incube durante a noite a 25 °C em 5% de CO₂. Adicione 3 mL de substrato de cultura de ilhotas a cada 24 horas ao lado de cada placa de Petri e depois gire suavemente para repor o substrato.
20. Prossiga para a contagem de ilhotas (passo 6).

Figura 3: Digestão e purificação do pâncreas de ilhotas isoladas. Imagens representativas dos passos sequenciais desde a digestão do pâncreas em pool até a purificação das ilhéus. (A) Pâncreas perfundidas agrupadas antes da digestão enzimática. (B) Pâncreas fragmentadas após digestão enzimática. (C) Suspensão uniforme de tecido, pós-mecânica. (D) Tubos com gradiente de densidade antes da centrifugação (esquerda) e após centrifugação (direita), com a faixa visível da ilhéu na interface do gradiente circulada. (E) Imagem do campo claro dos ilhotas do Dia 0 imediatamente após a coleta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Contagem de ilhotas

1. Colete quantificação manual de ilhotes.
   1. Durante o passo 5.16, retire três alíquotas de 100 μL da suspensão do ilhéu usando uma pipeta de 200 μL e pontas normais de 200 μL.
      NOTA: Certifique-se de que as ilhotas estejam igualmente suspensas em meio à mistura de pipetas, quando as alíquotas forem coletadas para medição.
   2. Transfira cada aliquota para sua própria placa de Petri gradeada de 2 mm × 2 mm, contendo 1 mL de 1× PBS.
   3. Conte ilhéus sob um microscópio invertido, catalogando-os pelo diâmetro com um inserto de lente de retículo ocular.
      NOTA: Nem todos os ilhéus serão circulares; Siga as medições horizontais ou verticais durante a contagem.
   4. Calcule o número total de equivalentes a ilhotas de 150 μm usando a tabela de conversão padronizada (veja a Tabela 4).
      NOTA: Compare o IEQ de cada amostra. Se o IEQ das alíquotas variar em mais de 30%, prossiga com a média das aliquotas mais semelhantes.

7. Precauções de segurança

1. Realize todos os procedimentos cirúrgicos e de manuseio de tecidos sob condições assépticas dentro de um armário de biossegurança, quando apropriado. Use equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo óculos de proteção, jalecos, luvas e máscaras cirúrgicas, durante o manuseio de reagentes e tecidos.
2. Realize a colheita do pâncreas em condições estéreis, com ferramentas cirúrgicas e EPI adequados. Manuseie isoflurano e outros anestésicos de acordo com as orientações da instituição para evitar exposição por inalação.
3. Descarte tecidos animais, objetos cortantes e resíduos de risco biológico em conformidade com os protocolos institucionais de biossegurança. Mantenha reagentes enzimáticos e materiais biológicos no gelo, salvo especificação em contrário, para preservar a atividade e a viabilidade.

Resultados

Os resultados a seguir representam um isolamento típico de ilhotas realizado usando o método descrito, com doze pâncreas de rato Lewis processados em paralelo.

Distribuição de rendimento e tamanho

Contagem manual de alíquotas e conversão IEQ

Duas alíquotas independentes de 100 μL foram obtidas da suspensão mista de ilhéus, conforme descrito na seção "Contagem de Ilhéus", Passo 6.1, e contadas por compartimentos de diâmetro (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). As contagens foram convertidas para equivalentes em ilhotas (IEQ; referência de 150 μm) usando tabelas de equivalência padrão e extrapoladas para o volume total de suspensão (ver Figura 4A). Em todo o isolamento de teste (n = 12), o rendimento foi de 3330 IEQ/pâncreas com diâmetro mediano da ilhéu no compartimento de 50-100 μm. Replicar alíquotas concordadas em 18,8% por bin (coeficiente de variação), indicando variação moderada, mas esperada com o uso de métodos manuais de contagem. Nos 14 isolamentos anteriores de ilhéus, esse método produziu uma média de 1353 (SD 607) IEQ/pâncreas.

Quantificação automatizada de placas inteiras

Para comparar IEQ manual, imagens em campo claro foram adquiridas em D1 usando um microscópio e costuradas para gerar compósitos de prato inteiro (4× objetiva; 1/100 de s). O dimensionamento automatizado e a quantificação de objetos foram realizados usando Fiji e codificação com um limiar de tamanho pré-definido de 50-600 μm. As imagens foram primeiro pré-processadas para reduzir a variação do fundo e melhorar a uniformidade do contraste. Estruturas de ilhotas foram identificadas com base nas diferenças de intensidade em relação ao tecido ao redor, gerando máscaras binárias de objetos. Ilhotas adjacentes ou parcialmente tocadas foram separadas para evitar subestimação do número de objetos. Objetos fora da faixa de tamanho especificada foram excluídos para remover detritos e tecido não ilhéu. Para cada objeto retido, parâmetros morfométricos incluindo área e diâmetros dos eixos x e y foram extraídos. As ilhotas eram então agrupadas por diâmetro, e o IEQ era calculado multiplicando o número de ilhotas em cada compartimento de tamanho pelo fator de conversão correspondente. O dimensionamento automatizado resultou em 98.832 objetos totais, com diâmetros médios nos eixos x e y de 117 μm e 116 μm, respectivamente, e um total estimado de 16.350 IEQ, o que se correlacionou fortemente com IEQ manual medido em D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; veja a Figura 4A-C).

Perda de células de ilhotas

Imagens da placa inteira foram obtidas 2 horas após a purificação e novamente no Dia 1 (D1), usando a mesma metodologia em "Quantificação automatizada da placa inteira" para avaliar a estabilização precoce da ilha ("shedding"). A contagem de objetos mudou 0,9% e o IEQ em -6,11% de 2 h para D1 (veja a Figura 4D). A comparação pareada dos diâmetros das ilhotas entre D0 e D1 mostrou uma diminuição mediana estatisticamente significativa de 2 μm (teste de Wilcoxon signed-rank, p = 0,0136, n = 2820). No entanto, a pequena magnitude dessa mudança provavelmente não será biologicamente ou clinicamente significativa.

Figura 4: Avaliação quantitativa da distribuição do tamanho das ilhagas, correlação e queda precoce de ilhéus. Resumo gráfico das medições de ilhotas obtidas por meio de análises manuais e automatizadas. (A) Distribuição do tamanho dos ilhotes no dia 0 (D0) baseada em quantificação manual entre caixas de tamanho IEQ equivalentes a ilhotas padronizadas. (B) Dia 1 (D1) distribuição do tamanho das ilhotas determinada por medições automatizadas baseadas em imagens nos mesmos compartimentos padronizados de tamanho IEQ. (C) Correlação das contagens entre a quantificação manual de D0 e a quantificação automática de D1 entre os bins de tamanho IEQ. (D) Gráfico de caixa da distribuição dos diâmetros das ilhotas entre D0 e D1 para medições automatizadas da mesma placa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Pureza (conteúdo endócrino vs. exócrino)

Coloração por ditizona (DTZ)

Em D1, uma alíquota de ilhéus (n = 451) foi tingida com DTZ por 30 s à temperatura ambiente e imediatamente fotografada usando microscopia de campo claro (objetivo 4×; exposição de 1/20 s). Em Fiji, os pixels de fundo foram removidos de modo que a área restante do pixel correspondesse à área total do ilhéu. Regiões de tecido exocrino DTZ-negativo, identificadas por contraste de cor mais escuro, foram selecionadas manualmente usando uma ferramenta laço, e a área de cada região de interesse foi automaticamente registrada em pixels. A pureza endócrina foi calculada como a porcentagem de pixels DTZ positivos em relação ao total de pixels das ilhetas, resultando em uma pureza de 98,56 ± 0,38% (Figura 5A).

Viabilidade e desempenho funcional

Secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS)

Em cada ponto temporal (D1, D3, D7), 15 ilhéus de tamanho parecido foram escolhidos à mão e colocados em poços individuais de uma placa de 24 poços, preparados em quadruplicado. As ilhotas foram incubadas a 37 °C 5% CO₂ no tampão de Krebs sob protocolo de estimulação de glicose baixa-alta-baixa: primeiro em glicose baixa (2,8 mM, 60 min), seguida por glicose alta (16,7 mM, 60 min, ver Tabela 1). Frações de efluente foram coletadas ao final de cada período de incubação, e as concentrações de insulina foram quantificadas usando um ensaio ELISA de insulina em rato. Os índices de estimulação foram calculados como a razão de secreção de insulina durante condições de glicose alta e baixa. Os índices de estimulação foram 9,37, 8,34 e 6,7, nos dias 1, 3 e 7, respectivamente, sem diferenças significativas (Figura 5B).

Mancha viva/morta

Em D1, D3 e D7, 15 ilhotas foram escolhidas a dedo e tingidas com o kit de viabilidade Viva/Morto conforme as instruções do fabricante. Brevemente, ilhotas foram incubadas na solução de coloração Live/Dead por 30 minutos a 25 °C, depois selecionadas sob configurações consistentes de microscópio para garantir comparabilidade entre pontos de tempo (objetivo 4X; exposição de 1/30 s, filtros Texas Red e GFP). A viabilidade foi quantificada usando um script Python que empregava scikit-image para segmentação de ilhotas e medição de fluorescência. Ilhotas foram identificadas combinando os canais de fluorescência verde e vermelho, aplicando o método de limiar de Li para gerar uma máscara binária e usando segmentação de bacia hidrográfica para separar ilhotas que se tocam. Os objetos foram filtrados por área para excluir detritos e artefatos. Para cada ilhéu, a viabilidade foi calculada como a porcentagem da densidade integrada viva (pixels verdes) em relação à densidade integrada total (pixels verdes mais vermelhos). Os resultados mostraram viabilidade de 68 ± 9% no D1, 98,2 ± 0,6% no D3 e 100% no D7. Uma amostra controle positiva tratada com etanol a 70% por 10 minutos apresentou viabilidade de 2,7 ± 7,2% (ver Figura 5C-F).

Figura 5: Avaliação da pureza, viabilidade e resposta funcional das ilhéutas. Imagens representativas e resumos quantitativos das características das ilhotas isoladas ao longo do tempo. (A) Imagem representativa de campo claro 10× ilhéus tingidos com dithiza (DTZ), mostrando ilhéus endócrinos tingidos de vermelho e tecido exocrino não corado. (B) Valores de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) do índice de estimulação de glicose alta/baixa glicose (HG/LG) para os dias 1, 3 e 7. (C-E) Imagens de fluorescência viva/morta de ilhotas no Dia 1 (C), Dia 3 (D) e Dia 7 (E). (F) Imagem de fluorescência viva/morta de ilhéus de controle positivo tratados com etanol. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

(A) Mídia de Lavagem
Componente	Concentração final	Valor (mL)
RPMI 1640	-	500 mL
Soro Fetal Bovino	10%	50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	25 mM	12,5 mL de estoque de 1M
L-glutamina	2 mM	5 mL de estoque de 200 mM
(B) Mídia da Cultura de Ilhotas
Componente	Concentração final	Quantidade (mL ou g)
RPMI 1640, Sem glicose	-	500 mL
Soro Fetal Bovino	10%	50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	20 mM	11 mL a partir de estoque de 1M
Piruvato de Sódio	1 mM	5,5 mL a partir de estoque de 100 mM
Glicose	5,5 mM	2,75 mL a partir de estoque de 200 g/L
(C) Solução de Enxágue de Penicilina e Estreptomicina
Componente	Concentração final	Quantidade (mL ou g)
Solução salina, 0,9%	-	500 mL
Estreptomicina penicilinosa (10.000 U/mL)	2%	10 mL
(D) Amortecedora de extinção
Componente	Concentração final	Quantidade (mL ou g)
HBSS	-	500 mL
Soro Fetal Bovino	20%	100 mL
HEPES (1 M)	2.50%	2,5 mL
(E) Buffer de Krebs
Componente	Concentração final	Quantidade (mL ou g)
dH2O	-	975 mL
NaCl	115 mM	6,72 g
NaHCO3	24 mM	2,02 g
KCl	5 mM	0,3728 g
HEPES (1 M)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0,0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2,5 mM	0,2775 g

Tabela 1: Lista de soluções. Detalhes de composição e preparação para todas as soluções utilizadas ao longo do protocolo de isolamento e purificação de ilhéus. Cada subseção lista componentes, concentrações finais, volumes de preparação e números de catálogo. (A) Mídia de lavagem, usada para enxáguar e lavar tecido durante a digestão e purificação. (B) Mídia de Cultura de Ilhotes, usada para manutenção e viabilidade pós-isolamento. (C)Solução de enxágue de penicilina e estreptomicina, usada para esterilizar e enxaguar pâncreas colhidos. (D) Tampão de Extinção, usado para interromper a digestão enzimática e preservar a viabilidade celular. (E) Tampão de Krebs, usado durante ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS).

Número de pâncreas	Colagenase (15,38 mg/mL)	Termolisina (1 mg/mL)	DNAse (100 mg/mL)	Buffer de funcionamento	600 mL de béqueres para uso	Volume/Béquer
30	4,5 mL	2,25 mL	450 μL	450 mL	5	25 mL
24	3,6 mL	1,8 mL	360 μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1,5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2,4 mL	1,2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1,8 mL	0,9 mL	180 μL	180 mL	2	25 mL
10	1,5 mL	0,75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
Concentração final.	0,15 mg/mL	5 mg/mL	0,1 mg/mL

Tabela 2: Solução enzimática digestiva por quantidade de pâncreas. Volumes de colagênase, termolisina e DNase foram necessários para preparar o Meio de Dissociação de Trabalho (WDM) para diferentes números de pâncreas de rato. As concentrações finais de cada enzima estão listadas na parte inferior da tabela.

Número de pâncreas	Tubos número 50 mL	Volume/ seringa	Número de 1,096 seringas	Número de 1,068 seringas
30	10 tubos	50 mL	2	2
24	8 tubos	40 mL	2	2
20	6 tubos	30 mL	2	2
16	4 válvulas	40 mL	1	1
12	4 válvulas	40 mL	1	1
10	2 tubos	20 mL	1	1

Tabela 3: Carga em gradiente por quantidade do pâncreas. Número de tubos cônicos de 50 mL e volumes de gradiente correspondentes necessários para a purificação das ilhotas com base no número de pâncreas processados.

Faixa de Diâmetro das Ilhotas (μm)	Número de Partículas de Ilhotas (IA)	Fator de Conversão IEQ	IEQ por faixa
50-100	a	* 0.167	a * 0,167
101-150	b	* 0.648	b * 0,648
151-200	c	* 1.685	c * 1.685
201-250	d	* 3.500	d * 3.500
251-300	e	* 6.315	e * 6.315
301-350	f	* 10.352	f * 10.352
> 350	g	* 15.833	g * 15.833

Tabela 4: Conversão de equivalência de ilhéus. A conversão de diâmetros de ilhotas varia para equivalentes padronizados de ilhotas (IEQ). A tabela lista os compartimentos de diâmetro de ilhotas observados, o número de partículas de ilhotas por intervalo, o fator de conversão IEQ correspondente para cada faixa de tamanho e a contribuição resultante de IEQ por intervalo.

Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem de alta capacidade para isolar e purificar ilhéus pancreáticos de ratos Lewis. O sucesso do método depende de várias etapas críticas que, coletivamente, preservam a integridade e a função das ilhotes. Entre eles estão a perfusão intraductal precisa e completa do pâncreas, a limpeza cuidadosa do pâncreas perfundido e o tempo exato de digestão enzimática. A perfusão consistente de órgãos inteiros é crucial para alcançar uma distensão uniforme do pâncreas e garantir uma distribuição uniforme da mistura de colagênase-termolisina-DNase, que atua respectivamente para digerir a matriz extracelular, melhorar a penetração enzimática e reduzir a viscosidade mediada pelo^{DNA 21,22.} A sub-perfusão pode resultar em digestão incompleta do tecido e perda de uma parte significativa dos ilhéus, pois o tecido subdigerido é filtrado pelo peneirado. Da mesma forma, a remoção inadequada do tecido adiposo ou vascular antes da digestão pode introduzir impurezas não endócrinas que reduzem a pureza. Por fim, a digestão prolongada resulta na dessegregação das ilhotas devido à quebra excessiva da matriz extracelular, enquanto uma digestão subótima gera tecido não digerido resistente à digestão mecânica via agulha espinhal. Essas etapas representam as armadilhas técnicas mais frequentes e devem ser cuidadosamente monitoradas durante o treinamento e otimização.

Embora esse método tenha sido desenvolvido especificamente para ratos Lewis, provavelmente pode ser adaptado a outras cepas ou espécies por meio de uma reotimização menor do tempo de digestão e da razão^enzimática 23,24,25,26. Alguns laboratórios podem optar por ajustar a proporção de colagênase, termolisina e DNase I no Meio de Dissociação de Trabalho (WDM) para otimizar o rendimento para suas características específicas de lote enzimático ou tecido. Para isso, os laboratórios podem seguir cuidadosamente o guia passo a passo do fabricante para otimização enzimática e tecidular e, em todos os casos, evitar adicionar componentes como 0,1 M EDTA, cisteína, mercaptoetanol, inibidores de protease, soro ou albumina, pois estes podem inibir a colagênase, termolisina e a atividade enzimática^{DNase 1 27}. Embora não tenha sido publicado um tempo de trabalho definitivo para a mistura enzimática antes da dissociação, dados anteriores mostram que a preservação prolongada a frio do pâncreas afeta negativamente o rendimento e a função das^{ilhotas 28}. Empiricamente, descobrimos que, em nosso protocolo, isolamentos bem-sucedidos foram consistentemente alcançados quando o tempo total de isquemia fria, definido como o intervalo entre colocar o primeiro pâncreas no gelo para limpeza e transferi-lo para o banho-maria de 37 °C, foi mantido abaixo de 1,5 h. Uma otimização adicional desse parâmetro pode ser necessária dependendo da aplicação do usuário final.

Apesar de sua robustez, esse protocolo apresenta várias limitações práticas e técnicas. Primeiro, a mistura enzimática (colagênase, termolisina e DNase I) e os gradientes de densidade são essenciais para a dissociação eficiente dos tecidos e o isolamento das ilhotas de ilhas, mas impõem custos significativos. Nossa seleção da combinação enzimática foi informada pelas características estruturais da matriz extracelular pancreática e pela necessidade de equilibrar a dissociação eficaz dos tecidos com a preservação da integridade das ilhéutas. Cada componente enzimático facilita um papel distinto: a colanase direciona os colágenos fibrilares e da membrana basal para liberar ilhéus; a termolisina, uma protease neutra, cliva proteínas da matriz não colágenosa e moléculas de adesão célula-célula, reduzindo a exposição necessária à colanase; e a DNase I minimiza a viscosidade causada pelo DNA liberado de células^lisadas 29,30,31. Embora formulações de enzimas digestivas de menor custo estejam disponíveis comercialmente, sua pureza é variável e pode comprometer o desempenho^{enzimático 13,23}. Como a colagenase é isolada de culturas bacterianas, etapas adicionais de purificação reduzem a contaminação por endotoxinas, mas aumentam substancialmente o custo^13,23.

Para colagenase, recomendamos preparações com atividade de aproximadamente 2.000 a 4.000 unidades de Wünsch por frasco, que apoiam a dissociação eficiente em dosagem moderada, evitando a digestão prolongada. Notavelmente, a mistura deve incluir uma proporção equilibrada de colanase classe I para classe II, correspondendo a uma fração de colagênase II/colagenase total de aproximadamente 0,3-0,5. Essa proporção proporciona forte atividade colagenolítica enquanto limita a degradação excessiva da matriz extracelular não colágenosa. Além disso, a mistura de colagênase deve ser complementada por um nível moderado de atividade proteasa neutra (aproximadamente 150.000-250.000 unidades) e DNase, pelos motivos já comentados.

Do ponto de vista do controle de qualidade, cada lote deve incluir documentação de baixa carga de endotoxinas (≤50 EU/mg de proteína), alta pureza enzimática (≥85% por HPLC) e atividade verificada de lote a lote, já que a pureza e a composição da enzima podem variar consideravelmente de acordo com o fabricante. Por fim, variações na composição dos lotes podem afetar a consistência da digestão e o rendimento das ilhéus, exigindo a realização de validação interna específica para cada lote. Essa validação pode ser alcançada seguindo as condições de digestão padronizadas descritas neste protocolo e, posteriormente, avaliando a eficiência digestiva e a morfologia das ilhotas de ilhéus. Indicadores de desempenho subótimo da enzima incluem dissociação incompleta do tecido, ilhéus com bordas irregulares ou rugosas, ou a necessidade de cisalhamento mecânico excessivo para alcançar a separação, caso em que pode ser necessária a titulação do tempo de digestão.

Considerações semelhantes se aplicam aos gradientes de densidade. Selecionamos um gradiente à base de polisacarose, um copolímero sacarose-epiclorohidrina altamente hidrofílico e não iônico, que forma gradientes estáveis de até 1,2 g/mL e tem um longo histórico de isolamento^{de ilhotas 32,33}. O iodixanol é uma alternativa bem validada, e estudos em ilhéus humanos mostram que gradientes baseados em iodixanol podem melhorar a recuperação das ilhotas enquanto mantêm a viabilidade e a função 34,35,36,37. No entanto, os dados sobre roedores são inconclusivos, com alguns estudos relatando resultados superiores usando iodixanol e outros demonstrando melhor viabilidade e função com gradientes baseados em^{polissacarose 32,35}. De forma crítica, recomenda-se o uso de soluções de gradiente comercialmente fabricadas e com controle de qualidade para aumentar a reprodutibilidade em laboratórios. Gradientes à base de polissacarose estão amplamente disponíveis em densidades ótimas para isolamento de ilhéus, enquanto gradientes de iodixanol são tipicamente preparados por diluição interna, introduzindo variabilidade adicional. Uma segunda limitação é que a colheita cirúrgica exige um alto nível de proficiência técnica, especialmente para perfusão intradutal através do esfíncter de Oddi e excisão rápida do pâncreas. Mesmo pequenos atrasos ou desalinhamentos podem resultar em danos teciduais, vazamento, perfusão desigual ou isquemia quente prolongada, o que pode comprometer o rendimento e a viabilidade das ilhas. Para mitigar essa limitação, o protocolo inclui descrições procedimentais detalhadas e auxílios gráficos originais com marcos anatômicos codificados por cores para facilitar a compreensão. Novos operadores são incentivados a se familiarizar com a técnica de perfusão antes de realizar isolamentos completos, e a prática em carcaças é recomendada antes de tentar colheitas vivas.

Terceiro, para máxima eficiência, esse protocolo exige trabalho em equipe coordenado. Durante a colheita do pâncreas e a digestão enzimática, normalmente são necessários três operadores treinados: um realizando cirurgia estéril, um limpando o pâncreas em condições estéreis e um circulando e eutanasiando animais em condições não estéreis. Após a digestão, as etapas de purificação a jusante geralmente podem ser realizadas por menos operadores uma vez que a proficiência é alcançada. Embora essa coordenação represente uma demanda logística inicial, ela permite o isolamento de muitos ilhotes de múltiplos animais em um período relativamente curto, melhorando o throughput geral em comparação com fluxos de trabalho menos coordenados. Embora esse protocolo seja tecnicamente exigente e consume muitos recursos, essas limitações são comuns a todos os métodos de isolamento de ilhéus. Ao enfatizar condições de digestão padronizadas, treinamento estruturado e execução coordenada, essa abordagem de alto rendimento pode reduzir o tempo e o trabalho por isolamento, além de gerar resultados consistentes e reproduzíveis quando realizada por uma equipe treinada.

Comparado aos protocolos convencionais de isolamento de ilhotas de roedores, esse método oferece vantagens substanciais em taxa de produção, reprodutibilidade e consistência. Digestão tradicional de órgão único depende fortemente da seleção manual e frequentemente produz pureza^{variável 13}. Em contraste, nosso protocolo utiliza digestão agrupada e purificação por gradiente de densidade, reduzindo substancialmente o tempo de preparação e a variabilidade entre amostras, mantendo alta viabilidade e resposta funcional em ilhéus. As ilhotas isoladas foram amplamente caracterizadas quanto à morfologia (coloração por ditizona), viabilidade (ensaio vivo/morto) e função (secreção de insulina estimulada por glicose), confirmando a robustez do método. Coletivamente, esse fluxo de trabalho padronizado permite a geração de preparações de ilhotas abundantes, limpas e funcionais, adequadas para aplicações posteriores, incluindo encapsulamento, transplante e modelagem microfisiológica 38,39,40. Importante destacar que ilhéus de rato Lewis isolados com essa técnica reverteram diabetes em modelos pré-clínicos, ressaltando a relevância translacional dessa abordagem reprodutível e^{escalável 41}.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
21 G x 2 pol. Agulha BD PrecisionGlide	BD	305129
500 & micro; m Estrutura de latão e tela de aço inoxidável 304, 3" de diâmetro x 1" de profundidade (peneira número 35)	McMaster-Carr	34735K525
Seringas Air-Tite Estéreis, trava Luer	Fisher Scientific	14-817-178
Biogel PI UltraTouch M	Mö Inlycke	42665
Tesoura de Bonn; Direto; Pontas Afiadas; Comprimento da lâmina de 15 mm; 3 1/2" de comprimento total	Roboz	RS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL	Fisher Scientific	NC9956482
Série Cell-IQ 5,8 pés cúbicos Incubadora de Laboratório de CO2	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
Prato de cultura Corning 100 mm Não tratado com TC	Corning	430591
Soro fetal Bovino Corning, 500 mL, Regular, Testado de Segurança pelo USDA (Inativado por Calor)	Corning	35011CV
Gradiente do Ilhéu Corning 1,069 (densidade 1,069 g/cm3)	Corning	99-815-CIS	Requer um pedido especial da empresa
Gradiente do Ilhéu Corning 1,096 (densidade 1,096 g/cm3)	Corning	99-691-CIS	Requer um pedido especial da empresa
Gradiente da Ilhota de Corning 1,108 (densidade 1,108 g/cm3)	Corning	99-692-CIS	Requer um pedido especial da empresa
Placas Terras Covidien	Fisher Scientific	22-225-102
DNase I Grau II	Roche	10104159001
Falcon  Tubos centrífugos cônicos de alta clareza de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Papel alumínio Fisherbrand, Rolo de Bitola Padrão	Fisher Scientific	01-213-100
Fisherbrand  Esponjas de gaze não tecidas	Fisher Scientific	22-028-559
Béqueres de vidro reutilizáveis Fisherbrand de Baixa Forma Resistente e Resistente	Fisher Scientific	FB101600
Mircoscópio de fluorescência   BZ-X810	Keyence	BZ-X810
Solução de glicose	Gibco	A2494001
Suporte de Microagulha Halsey	Ferramentas Científicas Finas	12500-12
HBSS, cálcio, magnésio, sem fenólico vermelho	Gibco	14025092
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Pinça Hemostática Classic Crile 5-1/2 polegada de comprimento	McKesson	1231217
Pinças Hudson (Ewald)	Roboz	RS-5238
Agulha Hipodermica Monoject de 1-1/2 polegada de comprimento 16 Gauge Parede Regular sem segurança	McKesson	43481
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030081
Liberase T-Flex, Grau de Pesquisa	Roche	5989132001
Kit de Viabilidade VIVA/MORTO/Citotoxicidade, para células de mamíferos	Invitrogen	L3224
Pacote de software MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
Bomba de Seringa Programável NE-4000 de Dois Canais	Bomba de Seringa	NE-4000-US
AGULHA, HIPO STR DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINT	McKesson	408877
Cultura Celular/Placas de Petri Nunc	Termo-Científica	174926
Microscópio Olympus CKX41 de Contraste de Fase Invertido	Olympus	CKX41-B
PBS, pH 7,4	Gibco	10010023
Penicilina' Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640	Gibco	11875093
RPMI 1640, sem glicose	Gibco	11879020
Piruvato de Sódio (100 mM)	Gibco	11360070
Piruvato de Sódio (estoque de 100 mM)	Gibco	11360070
Sorval ST 16R	Termo-Científica	75004381
Agulha de seringa 304 de aço inoxidável	Milipore Sigma	Z117013-1EA
DRAPE CIRÚRGICO, DESCARTÁVEL, 36 IN X 100 YD	Covetrus	10408
Tesoura Cirúrgica - ToughCut	Ferramentas Científicas Finas	14054-13
Pinça de curativo para polegar de 4,5" com delicados 1,3 mm de largura de ponta	Roboz	RS-8120
Tubo de centrífuga Thermo Scientific Nunc 200mL	Termo-Científica	14-962-17
Adaptadores e Almofadas para Garrafas de Centrífuga Thermo Scientific Nunc	Termo-Científica	12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Banho-Mariá Agitante	Fisher Scientific	300610298
TX-400 4 x 400 mL Rotor de balde oscilante	Termo-Científica	75003181
Tygon S-50-HL	Tygon	AAXoooo3
Kit ELISA de Insulina Ultra Sensível para Ratos	Química de Cristal	90060