Artigo de investigação
A porta poligonal (PGG) e a porta cruciforme (CFG) são métodos de citometria de fluxo para detectar a integridade do DNA do espermatozoide. O PGG mede o índice de fragmentação do DNA (DFI) e o alto índice de coloração do DNA (HDS). O CFG relata DFI severo, DFI leve e DFI geral. Este estudo tem como objetivo comparar os resultados e as correlações entre eles.
A integridade do DNA do esperma é um fator chave para garantir o sucesso da fertilização, desenvolvimento embrionário e gravidez contínua. A avaliação da estrutura da cromatina espermática (SCSA), utilizando citometria de fluxo após desnaturação do DNA e coloração de laranja acridina é considerada o método padrão ouro para avaliar o DNA do espermatozoide. Duas estratégias de gate para avaliação baseada em citometria de fluxo do índice de fragmentação do DNA do esperma (DFI) foram relatadas na literatura: gating poligonal (PGG) e gating cruciforme (CFG). O objetivo do presente estudo foi comparar as relações dos resultados do ensaio entre PGG e CFG, e analisar suas correlações com parâmetros da análise básica de sêmen. Os dados obtidos independentemente pelos dois métodos foram comparados por análise estatística, incluindo gráficos de Bland-Altman e análise de regressão. Um total de 121 pacientes ambulatoriais masculinos submetidos à avaliação de fertilidade no centro reprodutivo do nosso hospital foram selecionados por meio de um método de amostragem completamente aleatória. A DFI do esperma e indicadores relacionados foram detectados por citometria de fluxo usando PGG e CFG, respectivamente. Os resultados demonstraram que os valores de DFI obtidos dos dois métodos mostraram boa concordância. Os coeficientes de correlação entre DFIp do método PGG e DFIm, DFIs e DFIc do método CFG foram 0,6497, 0,9404 e 0,9667, respectivamente (todos p < 0,01). O alto índice de coloração de DNA (HDS) mostrou uma leve correlação negativa com DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). A porcentagem de espermatozoides progressivamente móveis foi negativamente correlacionada com DFIp, DFIs e DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivamente, todos p < 0,05). Não foi observada correlação significativa entre HDS e volume de sêmen, concentração de espermatozoides, contagem total de espermatozoides ou PR (%). Esses achados indicam que os DFIs estão mais intimamente associados à fertilidade masculina, sugerindo que o método CFG, que fornece esse parâmetro, pode ser mais adequado para avaliação clínica de danos ao DNA do esperma.
Integridade do DNA do esperma refere-se à integridade e estabilidade funcional da estrutura molecular do DNA no núcleo do espermatozoide. Especificamente, é caracterizado por conformação normal da cromatina, sequências de bases intactas sem quebra ou dano oxidativo, e capacidade de transmitir informações genéticas com precisão para a prole. Durante a espermatogênese, quando o estresse oxidativo aumenta1, a remodelação da cromatina éanormal 2, ou o espermatozoide é afetado por toxinasambientais 3, a integridade do DNA do esperma será danificada, resultando em descompasso de bases, perda, modificação, adição e reticulação de DNA, quebras de fita simples e dupla, etc. Além disso, DNA do esperma danificado pode prejudicar a fertilidade masculina e afetar negativamente os resultados da gravidez na tecnologia de reprodução assistida (ART)4, além de aumentar o risco de perda gestacionalrecorrente 5. Em 2021, a Associação Europeia de Urologia (EAU) recomendou a inclusão do teste DFI no sistema de avaliação de fertilidademasculina 6.
Atualmente, a integridade do DNA do esperma é avaliada principalmente pela detecção do índice de fragmentação do DNA do esperma (DFI). O ensaio de estrutura da cromatina espermática (SCSA) por citometria de fluxo é o principal método para avaliar oDFI 7. Dois métodos de filtração por citometria de fluxo para detecção de DFI em espermatozoides foram relatados na literatura. Um deles é o método de gate poligonal (PGG), que pode reportar simultaneamente dois indicadores-chave, como DFI espermática e HDS8. PGG é uma abordagem clássica SCSA caracterizada por um coeficiente de variação de detecção menor e uma repetibilidadesuperior 9. No entanto, não consegue distinguir a gravidade do dano ao DNA. Outro tipo é o método de portamento cruciforme (CFG), que pode relatar marcadores de dano severos ao DNA de esperma (DFIs), marcador de dano leve ao DNA de esperma (DFIm) e o DFI total do método de portamento cruciforme (DFIc). DFIc é igual à soma dos DFIs e DFIm. Comparado às tecnologias atuais para avaliação da integridade do DNA do espermatozoide, o método CFG pode refletir a gravidade do dano ao DNA doesperma 10.
Para determinar qual método é mais adequado para avaliar a qualidade dos espermatozoides, este estudo utilizou tanto o método PGG quanto o método CFG para medir DFI e parâmetros relacionados em espermatozoides. A correlação entre os resultados desses dois métodos e os parâmetros convencionais de análise de sêmen foi comparada. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a analisar a correlação dos resultados de detecção entre as duas metodologias, PGG e CFG.
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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Afiliado Huai'an First People's Hospital da Universidade Médica de Nanjing (Número de aprovação: KY-2024-181-01). Foi obtido consentimento informado dos pacientes cujas amostras foram usadas neste estudo. Diagrama esquemático geral do fluxo de trabalho apresentado na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados estão descritos na Tabela de Materiais.
Configurações do CFG para o citômetro de fluxo
Após o tratamento ácido, a cromatina nuclear dos espermatozoides com DNA danificado apresenta DNA de fita simples, enquanto a cromatina nuclear dos espermatozoides com DNA não danificado mantém sua estrutura intacta de fita dupla. O corante fluorescente acridina laranja (AO) liga-se ao DNA de fita simples e emite fluorescência vermelha quando excitado por um laser de 488 nm. Quando ligado a DNA de fita dupla, ele emite fluorescência verde quando excitado por um laser de 488 nm. Com base no número de sinais fluorescentes vermelhos e verdes capturados pelo citômetro de fluxo, calcula-se a razão da fluorescência vermelha para o total da fluorescência vermelha e verde, que representa o DFI do espermatozoide.
As configurações do CFG foram implementadas de acordo com a visão geral fornecida por Yang et al.10. O citômetro de fluxo deve ser configurado usando a menor fluorescência verde e a maior fluorescência vermelha medida em espermatozoides normais corados por O como referências de limite (Figura 2). A seguir está uma lista das características celulares de cada quadrante do CFG:
O quadrante Q1 indica espermatozoides normais. Foi observado que o DNA do esperma estava intacto e a quantidade de ligação de AO era mínima, resultando em fluorescência verde.
Espermatozoides no quadrante Q2 possuem DNA parcialmente fragmentado e aparecem alaranjados sob microscopia de fluorescência. Esse DNA pode ser reparável, esses espermatozoides são classificados como possuindo fragmentação leve do DNA (DFIm)10.
O quadrante Q3 é definido como a fluorescência inespecífica que sofreu subtração.
Espermatozoides no quadrante Q4 possuem DNA fragmentado e aparecem vermelhos sob microscopia de fluorescência, indicando fragmentação severa do DNA (DFIs).
Propõe-se que os espermatozoides nos quadrantes Q2 e Q4 contenham DNA fragmentado, e sua soma é definida como DFIc.
Configurações do PGG para o citômetro de fluxo
A porta poligonal para análise citométrica de fluxo foi estabelecida seguindo o método descrito por Evenson et al.8. Como mostrado na Figura 3, as características celulares associadas a cada porta são as seguintes:
P3 é indicativo da porcentagem de células com DNA desnaturalizado.
P4 representa espermatozoides com alta colorabilidade de DNA (HDS). Esse grupo de espermatozoides não apresenta a troca normal entre histona e protamina.
As populações celulares predominantes localizadas fora dos portões P3 e P4 consistem em espermatozoides normais, apresentando fluorescência vermelha reduzida e emitindo predominantemente fluorescência verde.
Coleta e análise de amostras de sêmen
Todas as 121 amostras de sêmen foram dos homens que visitaram o Centro Reprodutivo do Primeiro Hospital de Huai'an, afiliado à Universidade Médica de Nanjing. Amostras de sêmen foram coletadas por masturbação após um período de 2 a 7 dias de abstinência. A análise rotineira do sêmen foi rigorosamente realizada de acordo com os requisitos do Manual de Laboratório da OMS para o Exame e Processamento do Sêmen Humano11,12. As análises de concentração e motilidade de espermatozoides foram realizadas utilizando um sistema de análise de espermatozoides assistido por computador (CASA). Cada amostra foi analisada duas vezes. Os resultados eram reportados como média apenas quando a diferença entre os dois resultados estava dentro do intervalo de confiança de 95%; caso contrário, foram realizadas reamostras e análises.
Análise do DFI
Calcule o volume de amostra necessário para a amostra de sêmen para que a concentração final de espermatozoides no reagente A do kit de citometria de fluxo seja 2–3 x 106/mL. Método de cálculo: Assumindo que a concentração de espermatozoide na amostra original de sêmen é M x 106/mL, então o volume de sêmen necessário (μL) = 150/M. Adicione o volume calculado de sêmen a um tubo de citômetro de fluxo, depois adicione 50 μL de reagente A e misture suavemente. Adicione 100 μL do reagente B, misture suavemente e incube por 30 s em temperatura ambiente. Adicione imediatamente 300 μL de reagente C e misture suavemente. Detecte a amostra usando CFG e PGG no citômetro de fluxo e analise pelo menos 5000 espermatozoides.
Análise estatística
Os dados foram submetidos a análise estatística usando o GraphPad Prism 6.0. Plots de Bland-Altman foram construídos para avaliar o nível de concordância entre PGG e CFG calculando a média e as diferenças. As diferenças entre os dois métodos foram plotadas em relação aos seus valores médios. Além disso, o método de Pearson foi utilizado para analisar a correlação entre PGG e CFG. Foi determinado que um valor-p menor que 0,05 era estatisticamente significativo.
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Entre os 121 participantes do estudo (idade média: 32,5 ± 4,9 anos; faixa de 26–44 anos), 28 foram diagnosticados com astenozoospermia e 4 com oligozoospermia. As características demográficas de base e os parâmetros da análise de sêmen são resumidos na Tabela 1.
Como demonstrado na Figura 4, o gráfico de Bland-Altman revelou que os resultados DFI de espermatozoides obtidos pelos métodos PGG e CFG apresentaram exce...
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A 6ª edição do Manual de Laboratório da OMS para o Exame e Processamento do SêmenHumano 12 recomenda quatro métodos para avaliar a integridade do DNA do espermatozoide: marcação terminal de desoxinucleotidila transferase (dUTP) por ponta de corte (TUNEL), ensaios de eletroforese em gel unicelular (Comet), SCSA e teste de dispersão da cromatina espermática (SCD). Entre eles, o SCSA foi amplamente adotado em laboratórios de andrologia devido ao uso da citometria de ...
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Os autores não têm nada a revelar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de análise de esperma assistido por computador | Beijing Suijia Software Co., Ltd | SA-II | |
| Citômetro de fluxo | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Cyto E6 | |
| Kit de citometria de fluxo | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | ||
| Câmara de contagem Makler | Sefi Medical Instruments | ||
| Kit de integridade do DNA do núcleo do esperma | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | - |
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