Comparação dos resultados da análise de ADN espermático utilizando diferentes estratégias de segmentação em citometria de fluxo

Summary

A porta poligonal (PGG) e a porta em forma de cruz (CFG) são métodos de citometria de fluxo para detectar a integridade do DNA dos espermatozoides. A PGG mede o índice de fragmentação do DNA (DFI) e o índice de coloração de DNA alto (HDS). A CFG relata DFI grave, DFI leve e DFI geral. Este estudo visa comparar os resultados e as correlações entre eles.

Abstract

A integridade do DNA espermático é um fator-chave para garantir uma fertilização bem-sucedida, o desenvolvimento do embrião e a gravidez em andamento. A avaliação da estrutura do cromatina espermática (SCSA) usando citometria de fluxo após desnaturação do DNA e coloração com laranja de acridina é considerada o método padrão ouro para avaliar o DNA espermático. Duas estratégias de gateamento para avaliação da fração de fragmentação do DNA espermático (DFI) baseada em citometria de fluxo foram relatadas na literatura: gateamento poligonal (PGG) e gateamento cruciforme (CFG). O objetivo do presente estudo foi comparar as relações dos resultados dos ensaios entre PGG e CFG, e analisar suas correlações com parâmetros da análise básica do sêmen. Os dados obtidos independentemente pelos dois métodos foram comparados usando análise estatística, incluindo gráficos de Bland-Altman e análise de regressão. Um total de 121 pacientes masculinos ambulatoriais submetidos à avaliação da fertilidade no centro reprodutivo do nosso hospital foram selecionados por meio de um método de amostragem completamente aleatória. O DFI espermático e indicadores relacionados foram detectados por citometria de fluxo usando PGG e CFG, respectivamente. Os resultados demonstraram que os valores de DFI obtidos pelos dois métodos mostraram boa concordância. Os coeficientes de correlação entre DFIp do método PGG e DFIm, DFIs e DFIc do método CFG foram 0,6497, 0,9404 e 0,9667, respectivamente (Todos p < 0,01). Índice de coloração de DNA alto (HDS) mostrou uma ligeira correlação negativa com DFIs (r  = -0,3042, p < 0,05). A porcentagem de espermatozoides progressivamente móveis foi negativamente correlacionada com DFIp, DFIs e DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivamente, todos p < 0,05). Nenhuma correlação significativa foi observada entre HDS e volume do sêmen, concentração espermática, contagem total de espermatozoides ou PR (%). Esses achados indicam que DFIs estão mais intimamente associados à fertilidade masculina, sugerindo que o método CFG, que fornece esse parâmetro, pode ser mais adequado para avaliação clínica de danos ao DNA espermático.

Introduction

A integridade do DNA dos espermatozoides refere-se à integridade e estabilidade funcional da estrutura molecular do DNA no núcleo do espermatozoide. Especificamente, é caracterizada pela conformação normal da cromatina, sequências de bases intactas sem quebras ou danos oxidativos e a capacidade de transmitir com precisão informações genéticas para a prole. Durante a espermatogênese, quando o estresse oxidativo aumenta¹, a remodelação da cromatina é anormal² ou o espermatozoide é afetado por toxinas ambientais³, a integridade do DNA dos espermatozoides será danificada, resultando em incompatibilidade de bases, perda, modificação, adição de DNA e reticulação, quebras de fita simples e dupla, etc. Além disso, o DNA dos espermatozoides danificados pode prejudicar a fertilidade masculina e afetar adversamente os resultados da gravidez na tecnologia de reprodução assistida (ART)⁴, além de aumentar o risco de perda recorrente da gravidez⁵. Em 2021, a Associação Europeia de Urologia (EAU) recomendou a inclusão do teste DFI no sistema de avaliação da fertilidade masculina⁶.

Atualmente, a integridade do DNA dos espermatozoides é avaliada principalmente detectando o índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides (DFI). O ensaio de estrutura da cromatina dos espermatozoides (SCSA) por citometria de fluxo é o método primário para avaliar o DFI⁷. Dois métodos de citometria de fluxo para detecção do DFI dos espermatozoides foram relatados na literatura. Um é o método de gate poligonal (PGG), que pode relatar simultaneamente dois indicadores-chave, como DFI dos espermatozoides e HDS⁸. O PGG é uma abordagem clássica do SCSA caracterizada por um menor coeficiente de variação de detecção e superior repetibilidade⁹. No entanto, não pode distinguir a gravidade do dano ao DNA. Outro tipo é o método de gate em forma de cruz (CFG), que pode relatar o marcador de dano grave do DNA dos espermatozoides (DFIs), o marcador de dano leve do DNA dos espermatozoides (DFIm) e o DFI total do método de gate em forma de cruz (DFIc). DFIc é igual à soma de DFIs e DFIm. Comparado com as tecnologias atuais para avaliação da integridade do DNA dos espermatozoides, o método CFG pode refletir a gravidade do dano ao DNA dos espermatozoides¹⁰.

Para determinar qual método é mais adequado para avaliar a qualidade dos espermatozoides, este estudo empregou tanto o método PGG quanto o método CFG para medir o DFI e parâmetros relacionados nos espermatozoides. A correlação entre os resultados desses dois métodos e os parâmetros convencionais de análise do sêmen foi comparada. Pelo que sabemos, este é o primeiro estudo a analisar a correlação dos resultados de detecção entre as duas metodologias, PGG e CFG.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Popular Primeiro Afiliado de Huai'an da Universidade Médica de Nanjing (Número de aprovação: KY-2024-181-01). O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras foram utilizadas neste estudo. Diagrama esquemático geral do fluxo de trabalho apresentado na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados estão descritos na Tabela de Materiais.

Configurações do CFG para o citômetro de fluxo
Após o tratamento com ácido, a cromatina nuclear dos espermatozoides com DNA danificado mostra DNA de fita simples, enquanto a cromatina nuclear dos espermatozoides com DNA intacto mantém sua estrutura de fita dupla intacta. O corante fluorescente acridina laranja (AO) se liga ao DNA de fita simples e emite fluorescência vermelha quando excitado por um laser de 488 nm. Quando ligado ao DNA de fita dupla, emite fluorescência verde quando excitado por um laser de 488 nm. Com base no número de sinais fluorescentes vermelhos e verdes capturados pelo citômetro de fluxo, a razão da fluorescência vermelha para o total de fluorescência vermelha e verde é calculada, o que representa o DFI dos espermatozoides.

As configurações do CFG foram implementadas de acordo com a visão geral fornecida por Yang et al.¹⁰. O citômetro de fluxo deve ser configurado usando a menor fluorescência verde e a maior fluorescência vermelha medida em espermatozoides normais corados com AO como referências de limite (Figura 2). A seguir está uma lista das características celulares de cada quadrante no CFG:
O quadrante Q1 é indicativo de espermatozoides normais. Observou-se que o DNA dos espermatozoides estava intacto e a quantidade de ligação do AO era mínima, resultando em fluorescência verde.
Espermatozoides no quadrante Q2 têm DNA parcialmente fragmentado e aparecem laranja sob microscopia de fluorescência. Esse DNA pode ser reparável, esses espermatozoides são classificados como tendo fragmentação de DNA leve (DFIm)¹⁰.
O quadrante Q3 é definido como a fluorescência não específica que passou por subtração.
Espermatozoides no quadrante Q4 têm DNA fragmentado e aparecem vermelhos sob microscopia de fluorescência, indicando fragmentação de DNA grave (DFIs).

Propôs-se que os espermatozoides nos quadrantes Q2 e Q4 contenham DNA fragmentado, e sua soma é definida como DFIc.

Configurações do PGG para o citômetro de fluxo
O portão poligonal para análise citometria de fluxo foi estabelecido seguindo o método descrito por Evenson et al.⁸. Como mostrado na Figura 3, as características celulares associadas a cada portão são as seguintes:
P3 é indicativo da porcentagem de células com DNA desnaturado.
P4 representa espermatozoides com alta coloração de DNA (HDS). Este grupo de espermatozoides não possui a troca normal de histona por protamina.
As populações celulares predominantes localizadas fora dos portões P3 e P4 consistem em espermatozoides normais, exibindo fluorescência vermelha reduzida e emitindo predominantemente fluorescência verde.

Coleta e análise da amostra de sêmen
Todas as 121 amostras de sêmen foram de homens que visitaram o Centro de Reprodução do Hospital Primeiro de Huai'an Afiliado à Universidade Médica de Nanjing. As amostras de sêmen foram coletadas por masturbação após um período de abstinência de 2-7 dias. A análise de sêmen de rotina foi realizada estritamente de acordo com os requisitos do Manual Laboratorial da OMS para o Exame e Processamento do Sêmen Humano^11,12. As análises de concentração e motilidade de espermatozoides foram realizadas usando um sistema de análise de espermatozoides assistido por computador (CASA). Cada amostra foi analisada duas vezes. Os resultados foram relatados como média apenas quando a diferença entre os dois resultados estava dentro do intervalo de confiança de 95%; caso contrário, foi realizada reamostragem e análise.

Análise de DFI
Calcule o volume de amostra necessário para a amostra de sêmen, de modo que a concentração final de espermatozoides no reagente A do kit de citometria de fluxo seja de 2–3 x 10⁶/mL. Método de cálculo: Supondo que a concentração de espermatozoides na amostra de sêmen original seja M x 10⁶/mL, então o volume de sêmen necessário (µL) = 150/M. Adicione o volume calculado de sêmen a um tubo de citômetro de fluxo, em seguida, adicione 50 µL do reagente A e misture suavemente. Adicione 100 µL do reagente B, misture suavemente e incube por 30 s à temperatura ambiente. Imediatamente adicione 300 µL do reagente C e misture suavemente. Detecte a amostra usando CFG e PGG no citômetro de fluxo e analise pelo menos 5000 espermatozoides.

Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística usando GraphPad Prism 6.0. Gráficos de Bland-Altman foram construídos para avaliar o nível de concordância entre PGG e CFG, calculando a média e as diferenças. As diferenças entre os dois métodos foram plotadas em relação aos seus valores médios. Além disso, o método de Pearson foi utilizado para analisar a correlação entre PGG e CFG. Foi determinado que um valor p inferior a 0,05 era estatisticamente significativo.

Results

Entre os 121 participantes do estudo (idade média: 32,5 ± 4,9 anos; faixa etária: 26–44 anos), 28 foram diagnosticados com asthenozoospermia e 4 com oligozoospermia. As características demográficas de base e os parâmetros da análise de sêmen são resumidos em Tabela 1.

Como demonstrado em Figura 4, o gráfico de Bland-Altman revelou que os resultados do DFI dos espermatozoides obtidos pelos métodos PGG e CFG exibiram excelente consistência (r = 0,9667, p = 0,0000). Apenas duas amostras apresentaram discrepâncias maiores que +10% e três amostras apresentaram discrepâncias menores que -10%, com as proporções sendo de 1,7% e 2,5%, respectivamente.

Tabela 2 mostra uma forte correlação positiva entre DFIp de PGG e cada um dos três parâmetros derivados de CFG: DFIm, DFIs e DFIc. Os coeficientes de correlação foram 0,6497, 0,9404 e 0,9667, respectivamente, e os valores p foram todos menores que 0,05. Os resultados HDS detectados pelo método PGG exibiram uma correlação negativa significativa com os DFIs e DFIc detectados pelo método CFG. Os coeficientes de correlação foram -0,3042 e -0,2120, respectivamente, e os valores p foram todos menores que 0,05. A investigação não revelou correlação entre HDS e DFIm (o valor p foi maior que 0,05).

Como mostrado em Tabela 3, a porcentagem de espermatozoides progressivamente móveis foi significativamente negativamente correlacionada com DFIp, DFIm, DFIs e DFIc (todos os valores p foram menores que 0,05), mas não correlacionada com HDS (o valor p foi maior que 0,05). O volume de sêmen exibiu uma correlação positiva significativa com DFIp, DFIs e DFIc (todos os valores p foram menores que 0,05), mas não com HDS (o valor p foi maior que 0,05). A concentração de espermatozoides e o número total de espermatozoides não foram encontrados correlacionados com os resultados da análise de PGG e CFG (o valor p foi maior que 0,05).

O método CFG demonstra excelente consistência com PGG para avaliação do DFI. CFG permite a discriminação do grau de dano ao DNA, e seus parâmetros de DFI estão significativamente correlacionados com a motilidade dos espermatozoides. Os indicadores de dano grave ao DNA dos espermatozoides, conhecidos como DFIs, são mais adequados para uso generalizado na prática clínica de rotina.

Disponibilidade de dados:
Os conjuntos de dados produzidos e/ou analisados ao longo do curso desta pesquisa incorporam dados clínicos ao nível do paciente e não são divulgados ao público devido a considerações institucionais de privacidade e ética. Ao submeter um pedido razoável e obter aprovação do Comitê de Ética do Hospital Popular Afiliado Huai'an No. 1 da Universidade Médica de Nanjing, o autor correspondente está autorizado a fornecer dados desidentificados e resultados analíticos. Este estudo não envolveu o desenvolvimento de nenhum código personalizado.

Figura 1: Diagrama esquemático geral do fluxo de trabalho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Porta cruciforme (CFG) da citometria de fluxo para detectar DFI. Q1 – Espermatozoides normais. Q2 – Fragmentação de DNA leve (DFIm). Q3 – fluorescência não específica que foi subtraída. Q4 – Fragmentação grave do DNA (DFIs). Espermatozoides com danos no DNA caem tanto em Q2 quanto em Q4. Sua soma representa a população total de espermatozoides com DNA fragmentado (DFIc). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Porta poligonal (PGG) da citometria de fluxo para detectar DFI. P3: espermatozoides com DNA desnaturado. P4: alta tingibilidade do DNA (HDS) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Gráficos de Bland-Altman dos resultados dos ensaios PGG e CFG para DFI. Eixo X: Média dos resultados de medição obtidos pelo método PGG e pelo método CFG. Eixo Y: Diferença nos resultados de medição entre o método PGG e o método CFG Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Item	Média±SD	Faixa
Idade(anos)	32,5±4,9	26-44
Dias de abstinência(Dia)	4,1±1,3	3-7
Volume do sêmen(mL)	3,8±1,6	0,5-6,8
Concentração de espermatozoides(×106/mL)	52,0±35,5	10,3-185,1
Motilidade progressiva(%)

Discussion

A 6ª edição do Manual de Laboratório da OMS para o Exame e Processamento do Sêmen Humano¹² recomenda quatro métodos para avaliar a integridade do DNA espermático: marcação de extremidade de nick por terminal desoxirribonucleotidil transferase (dUTP) (TUNEL), ensaios de eletroforese em gel de célula única (Comet), SCSA e teste de dispersão de cromatina espermática (SCD). Entre esses, o SCSA tem sido amplamente adotado em laboratórios de andrologia devido ao uso de citometria de fluxo para análise, que oferece alta capacidade, eficiência e objetividade, bem como a capacidade de relatar simultaneamente parâmetros como DFI e HDS⁷. De acordo com uma pesquisa global⁷, quase um quarto (24,1%) dos clínicos reprodutivos em todo o mundo selecionou o SCSA como o método para avaliar a integridade do DNA espermático.

A etapa mais crítica no procedimento SCSA é estabelecer o gate citométrico de fluxo apropriado. O método PGG tradicional pode detectar fragmentos quebrados (DFI) de fitas de DNA e espermatozoides com coloração anormalmente alta de DNA (HDS), caracterizados pela falta de troca normal de histona e protamina¹³. No entanto, não pode distinguir entre quebras de fita simples e dupla no DNA espermático. Nos últimos anos, Yang et al.¹⁰ estabeleceram um método CFG para analisar o DFI do esperma usando citometria de fluxo, que pode distinguir a gravidade do dano ao DNA espermático. A etapa-chave deste método é configurar um gate cruciforme para o citômetro de fluxo. O método CFG exibe excelente repetibilidade (coeficiente de variação era inferior a 5%) e uma faixa linear para detecção de DFI de 8,93% a 53,90%. Este método relata três indicadores—DFIm, DFIs e DFIc—mas não fornece resultados de HDS¹⁰.

Este estudo descobriu que o DFI total do método CFG (DFIc) estava em boa concordância com o do método PGG (DFIp). A análise de correlação revelou que os coeficientes de correlação de DFIs e DFIp eram significativamente maiores do que os de DFIm. Nem a concentração espermática nem o número total de espermatozoides correlacionavam com os resultados dos métodos CFG ou PGG. PR (%) e os quatro tipos de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) estavam todos significativamente correlacionados negativamente. PR (%) estava significativamente correlacionado negativamente com todos os quatro tipos de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp). A correlação com DFIm (r = -0,1975) era significativamente mais fraca do que a de DFIs, DFIc e DFIp (r = -0,3794, -0,3574, -0,3824, respectivamente). Esses achados são consistentes com os relatados por Yang et al.¹⁰. Além disso, DFIs e DFIc mostraram boas correlações com o volume seminal, enquanto DFIm não. Embora a utilidade clínica de um indicador que se alinha de perto com os parâmetros básicos do sêmen possa ser limitada, esse achado sugere que o índice de dano grave ao DNA espermático (DFIs) pode refletir aspectos patológicos distintos da espermatogênese. Mais importante, como mostrado em nossa análise de correlação, DFIs demonstrou uma associação significativamente mais forte com a porcentagem de espermatozoides progressivamente móveis em comparação com DFIm, apoiando ainda mais seu potencial como um indicador complementar em avaliações de fertilidade masculina além da análise convencional do sêmen.

HDS representa a proporção de espermatozoides imaturos que não apresentam troca normal de histona e protamina. O precursor da protamina 1 em espermatozoides HDS retém aminoácidos terminais que são tipicamente clivados⁸, potencialmente impedindo a condensação adequada da cromatina e resultando em aumento da coloração por laranja de acridina de dsDNA. Estudos anteriores enfatizaram a importância do HDS na descrição de defeitos de cromatina no esperma. Pesquisas de Lin et al.¹⁴ e Virro et al.¹⁵ indicam que a taxa de aborto espontâneo na fertilização in vitro (FIV) é significativamente maior em homens com HDS > 15%. No entanto, descobertas recentes sugerem que o HDS pode não indicar de forma confiável a imaturidade nuclear devido à sua fraca correlação com os resultados de coloração CMA3, AB e TB¹⁶. Assim, o HDS pode não ser adequado como indicador de fertilidade masculina¹⁷. Este estudo também não mostra correlação significativa entre HDS e parâmetros básicos do sêmen, incluindo volume seminal, concentração espermática e motilidade. Portanto, HDS não é recomendado como um marcador para integridade do DNA espermático¹⁸.

Durante o processo de detecção de DFI, podem surgir inconsistências nos limites de fluorescência. Esse fenômeno é atribuído principalmente a variações significativas na concentração e motilidade dos espermatozoides entre diferentes amostras. Para abordar essa questão, recomenda-se usar gates apropriados para excluir espermatozoides mortos, detritos e outros sinais não específicos. Essa abordagem aumenta a precisão dos dados e mitiga o problema de limites de fluorescência inconsistentes.

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a comparar os resultados de análise dos métodos PGG e CFG. Uma limitação deste estudo é seu design de pequeno tamanho da amostra de centro único, e suas conclusões requerem validação adicional por meio de estudos multicêntricos com grande amostra. As direções de pesquisa futuras incluem garantir a consistência nos resultados dos testes de DFI dos espermatozoides em diferentes citômetros de fluxo e determinar se os DFIs dos espermatozoides podem prever resultados de tecnologias de reprodução assistida.

Em conclusão, o método CFG fornece mais parâmetros para a integridade do DNA espermático. Especificamente, DFIm e DFIs refletem as proporções de espermatozoides com danos leves e graves ao DNA, respectivamente. Os resultados de DFIc e DFIp mostram boa consistência. O método CFG é adequado para aplicação clínica e promoção.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de análise de esperma assistido por computador	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Citômetro de fluxo	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Kit de citometria de fluxo	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Câmara de contagem Makler	Sefi Medical Instruments
Kit de integridade do DNA do núcleo espermático	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-