Medindo a Instalação de Saída e a Conformidade Ocular In Ex Vivo Olhos de Camundongos Usando um Sistema de Bomba de Seringa

Resumo

A integração de abordagens analíticas de métodos estabelecidos de perfusão controlada por pressão otimizou um sistema simples e de baixo custo com bomba de seringa para avaliar a instalação de saída e a compliance ocular em olhos de camundongo.

Resumo

Manter a pressão intraocular (PIO) em um nível adequado e estável é essencial para a saúde ocular. As propriedades biomecânicas da malha trabecular (TM), do canal de Schlemm (SC) e de toda a concha corneoscleral desempenham um papel crucial na homeostase da PIO. A instalação de saída (C) é um parâmetro chave para avaliar a eficácia da TM e da SC na drenagem do humor aquoso, enquanto a compliance ocular (φ) reflete a elasticidade da concha corneoscleral e o fluxo transitório através da TM e SC. Anteriormente, um sistema simples e econômico de bomba de seringa foi desenvolvido para avaliar o C. No entanto, o uso de regressão linear simples para análise de dados in vivo apresenta limitações na caracterização da função MT e SC. Neste estudo, o sistema de bomba de seringa foi otimizado aplicando abordagens analíticas desenvolvidas para sistemas de perfusão ocular controlados por pressão estabelecidos. Os valores medidos de C e φ em olhos ex vivo foram comparados com valores do sistema de perfusão previamente publicados e foram consistentes com esses intervalos relatados. Em resumo, esse sistema simples e de baixo custo com bomba de seringa facilita a avaliação das propriedades biomecânicas da MT e da SC.

Introdução

Manter um nível adequado e estável de pressão intraocular (PIO) é essencial para a saúde ocular¹. A elevação sustentada da PIO é o principal fator de risco para^{glaucoma 2,3}. Flutuações de longo prazo da PIO ao longo de meses ou anos também contribuem para a perda de visão ^4,5. Estudos recentes identificaram outra forma de flutuação da PIO, flutuações transitórias causadas pelas atividades diárias, que também podem acelerar a progressão do^{glaucoma 6,7}. Por exemplo, um homem de 46 anos com histórico de 20 anos de esfregar as pálpebras e um homem de 52 anos que esfregava os olhos por 10 anos apresentaram danos acelerados no disco^{óptico 8,9}. Esses achados destacam a importância de respostas oportunas e adequadas às mudanças na PIO para minimizar o risco de perda visual.

A PIO é regulada pelo equilíbrio entre a produção de humor aquoso (AH) e sua^{drenagem 10}. A AH sai do olho principalmente pelas vias convencional e^{uveoscleral 11}. Tanto nos olhos normais quanto nos glaucomatos, a via convencional composta pela malha trabecular (TM) e pelo canal de Schlemm (SC) é a principal fonte de resistência à saída que influencia a homeostase da^PIO 12,13,14. Portanto, as propriedades biomecânicas da TM e da SC são essenciais para que o olho se adapte às mudanças na IOP 15,16,17.

Avanços tecnológicos recentes facilitaram uma avaliação mais precisa da saída de AH. Abordagens invasivas, como perfusão baseada em gravidade e o sistema de bomba de seringa, foram desenvolvidas para calcular a instalação de saída (C), que indica como a TM e a SC regulam a saída em regime^{estacionário} 18,19,20,21,22,23,24. Métodos não invasivos, como tonografia²⁵ e fluorofotometria²⁶, têm sido usados clinicamente para determinar C em pacientes com glaucoma. No entanto, a maioria das abordagens não consegue avaliar especificamente a função da MT e da SC. Por exemplo, no sistema de bomba de seringa, dados de vazão e pressão em regime estacionário são ajustados usando regressão linear simples, e a inclinação é interpretada como um C dependente da pressão. No entanto, esse C calculado em camundongos vivos não pode refletir com precisão a capacidade de saída de AH pela via convencional porque é afetado pela secreção de AH, fluxo uveoscleral e pressão venosa episcleral, conforme descrito pela equação de Goldmann.

Para abordar essa limitação, Millar et al. calcularam a entrada de AH, a saída convencional e a saída uveoscleral no mesmo olho do camundongo por meio de múltiplas medições de fluxo constante baseadas na suposição de ausência de entrada de AH, ausência de pressão venosa episcleral e inalterada de saída uveoscleral após^{a eutanásia 22}. Em 2016, Sherwood et al. relataram que a saída uveoscleral é 0 em olhos ex vivo a 0 mmHg, e então abordaram a mesma questão ao introduzir um modelo de lei de potência usando iPerfusão (um sistema de perfusão controlado por pressão, doravante chamado de sistema de perfusão)²⁷. Os avanços metodológicos esclareceram os papéis distintos da MT e da SC, ampliando a compreensão de suas funções fisiológicas na manutenção do fluxo estacionário de AH.

Além disso, a resposta transitória da TM e da SC às flutuações da PIO é essencial para manter a homeostase da PIO. Para acompanhar esse movimento, Xin et al. desenvolveram a tomografia de coerência óptica sensível à fase (OCT), que permite observação em uma escala de segundos^{de 28} segundos. A microscopia eletrônica tridimensional de varredura em bloco em bloco pode examinar esse movimento em um nível^{ultraestrutural 29}. No entanto, métodos baseados em imagem apenas estimam as propriedades biomecânicas da TM e da SC e não fornecem valores reais de drenagem transitória do AH. Em 2019, após o desenvolvimento da iPerfusão, Sherwood et al. calcularam a adesão ocular (φ) como um indicador-chave tanto da elasticidade corneoscleral quanto da resposta transitória da TM e da SC³⁰. Esse avanço fornece um parâmetro quantitativo para avaliar os comportamentos transitórios da MT e da SC em resposta às flutuações da PIO.

Com base nesses avanços na avaliação da função da TM e da SC, este estudo aprimorou o sistema de bomba de seringa ao incorporar o modelo de lei de potência para cálculo de C e integrar novas metodologias para calcular φ. Essas medições foram comparadas com dados publicados obtidos usando o sistema de perfusão para avaliar se o sistema otimizado de bomba de seringa é adequado para avaliar a instalação de saída e a compliance ocular em olhos de camundongos ex vivo .

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual e as diretrizes de cuidado e uso de animais de laboratório do Centro Médico da Universidade de Qingdao (QDU-AEC-2022069).

1. Seleção e manuseio de animais

1. Use camundongos de 5 meses com 50% de C57BL/6 e 50% de BALB/c genéticamente. Não considere o sexo no desenho experimental.
2. Mantenha os camundongos abaixo de um ciclo claro e escuro de 12 h/12 h, com 23 ± 2 °C e umidade de 50 ± 5%.

2. Medição de PIO

1. Anestesie camundongos usando 2,5% de isoflurano com 80% (vol/vol) oxigênio em uma câmara selada por 3,5 minutos.
   ATENÇÃO: O isoflurano é um anestésico volátil. Realize anestesia em uma área bem ventilada ou em um sistema de contenção apropriado.
2. Transfira os ratos para uma plataforma operacional. Mantenha a anestesia usando máscara por mais 30 segundos.
3. Realize todas as medições entre 9:00 e 12:00. Registre três medições por olho. Calcule o valor médio para cada ponto de dados.

3. Configuração do sistema (Figura 1)

1. Conecte uma seringa de 100 μL a uma bomba de seringa.
2. Conecte a seringa a um sensor de pressão de fluxo.
3. Conecte o sensor a um sistema de aquisição de dados.
   NOTA: Certifique-se de que o sensor de pressão e o suporte do olho estejam alinhados à mesma altura para evitar artefatos de pressão.
4. Encha o sistema com 1× soro tampão fosfatado (PBS). Remova todas as bolhas de ar.
5. Coloque o olho em um suporte com reentrância circular (4–6 mm de diâmetro). Certifique-se de que o olho esteja estável durante a canulação. Posicione o sensor de pressão e o suporte do olho na mesma altura.
   NOTA: O desalinhamento pode introduzir erros na medição de pressão. O arquivo de design STL para o suporte de olho personalizado é fornecido como Arquivo Suplementar 1.

4. Operação por software

1. Calibração do sensor de pressão
   1. Abra o software de aquisição de dados. Carregue o arquivo de configuração de calibração. Selecione a função de calibração .
   2. Conecte o sistema a um reservatório de água em duas alturas definidas.
   3. Pressões medidas e reais de entrada usando a conversão:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Configuração da bomba
   1. Abra as configurações do módulo. Carregue o arquivo de configuração do regulador.
   2. Selecione o dispositivo da bomba. Insira a vazão máxima e o diâmetro da seringa.
3. Registro de dados
   1. Comece a gravar.
   2. Pare de gravar após cada passo de pressão.
   3. Insira o próximo valor de pressão.
   4. Reinicie a gravação.

5. Preparação da agulha

1. Puxe uma micropipeta de vidro de acordo com um protocolo^{estabelecido 8}.
2. Moa a ponta até um diâmetro interno de 80–100 μm. Polir a ponta da agulha.
   ATENÇÃO: Manuseie agulhas de vidro com cuidado para evitar lesões.
3. Monte a agulha em um micromanipulador. Conecte a agulha ao transdutor de pressão.
4. Encha a agulha com PBS.
5. Posicione a ponta da agulha na mesma altura do sensor de pressão.
6. Medição de resistência
   1. Aplique uma pressão de 1 mmHg. Registre a vazão.
   2. Calcule a resistência da agulha:
      
   3. Use agulhas com resistência entre 0,01 e 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Facilidade de sistema e conformidade

1. Medição de instalações
   1. Perfunda o sistema com PBS. Sele o sistema usando uma válvula de três vias.
   2. Aplique passos de pressão de 6, 8, 10, 12, 14 e 16 mmHg.
   3. Registre P e Q por 10 minutos em cada etapa. Calcule valores médios dos últimos 5 minutos.
   4. Realize regressão linear. Interprete a inclinação como uma instalação do sistema.
2. Validação
   1. Repita as medições 3 vezes.
   2. Confirme que a facilidade do sistema está abaixo de 0,2 nL/min/mmHg.
3. Medição de conformidade
   1. Introduza um tubo de silicone de 35 cm no sistema.
   2. Meça a conformidade com e sem tubos de Teflon.
   3. Calcule a variação de volume usando um método de volume^{discreto 14}.
   4. Determine a conformidade do sistema como 4 nL/mmHg.
4. Verificação de sensibilidade
   1. Confirme que a conformidade detectável do sistema é maior que 9,9 nL/mmHg.

7. Enucleação

1. Eutanasie camundongos usando_CO2 a uma vazão de 0,7 L/min por 3 minutos.
   ATENÇÃO: A eutanásia do CO₂ deve seguir as diretrizes institucionais para garantir resultados humanos.
2. Dissecar músculos extraoculares e nervos ópticos usando instrumentos estéreis. Enuclee os globos oculares.
3. Imediatamente coloque um olho no suporte a 35,5 °C.
4. Armazene o olho contralateral a 4 °C.
5. Meça ambos os olhos usando o mesmo sistema.

8. Canulação

1. Inserção por agulha
   1. Insira a agulha pela córnea central em um ângulo de 45°.
   2. Avance a agulha até uma profundidade de 0,3–0,5 mm na câmara anterior.
2. Validação
   1. Estabilize o sistema. Confirme a flutuação de pressão ≤ 0,4 mmHg nos últimos 5 minutos.

9. C_Ocular

1. Estabilize o olho a 8 mmHg por 30 minutos.
2. Aplique passos de pressão de 6, 8, 10, 12, 14 e 16 mmHg.
3. Aplique um passo final a 8 mmHg.
4. Coleta de dados
   1. Ajuste a vazão máxima para 4 μL/min.
   2. Registre P e Q por 10 minutos em cada etapa.
5. Análise
   1. Plote as curvas P–T e Q–T. Calcule valores médios dos últimos 5 minutos.
   2. Dados de ajuste ao modelo²⁷ da lei de potência:
      
6. Defina C_r (após subtrair a instalação do sistema) como instalação de saída ocular.
7. Defina P_r = 8 mmHg.
8. Defina β como o coeficiente não linear.

10. Ocular Φ_r

1. Analise as curvas P–T e Q–T durante os incrementos de pressão. Identifique o aumento do fluxo até Q_máximo e a desaceleração subsequente.
2. Calcule a variação de volume entre t_p e t_max usando o método de volume^{discreto 30}.
3. Ajuste dos dados para a equação modificada de Friedenwald³⁰:
   
4. Defina P_r = 13 mmHg. Defina Φ_r (após subtrair a conformidade do sistema) como conformidade ocular Φ_r, _olho e γ como parâmetro de material.

Resultados

O desempenho do sistema otimizado de bomba de seringa foi avaliado comparando C e φ em camundongos de 5 meses com valores previamente publicados de estudos de perfusão ocular controlada por pressão. A normalidade dos conjuntos de dados na Figura 2F foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk, e comparações estatísticas foram realizadas usando um teste t de Student pareado de duas caudas.

Como mostrado na Figur...

Discussão

Este estudo apresenta um sistema otimizado de seringa-bomba para estimar a facilidade de saída e a adesão ocular nos olhos de camundongo, produzindo valores consistentes com os relatados usando sistemas de perfusão ocular controlados por pressão. A abordagem atual melhora a precisão das medições baseadas em seringa, mantendo um sistema experimental simples e acessível. Essa combinação de refinamento metodológico e acessibilidade pode facilitar uma adoção mais ampla em laboratórios onde s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	1× PBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isoflurano	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., China	R640
Material	100 & mu; Seringa de Alta Precisão L	Hamilton	1710
Vidro Borosilicato	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Seringa estéril descartável	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, China	10 ml
Sensor de pressão	IcuMedical	PX26-015G
Tubo de silicone	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China & nbsp;	N/A
Tubo transparente de PTFE	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China & nbsp;	N/A
Equipamento	Puxador de pipeta flamejante/marrom	Sutter, Novato, CA	P-97
Micromanipulador manual	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	M3301
Banho metálico	Biologia do Castor, Suzhou, China	2016C
MicroForge	Laboratório de Instrumentos Científicos Narishige, Tóquio, Japão	MF830
Moedor de micropipeta	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, China	KDG-02
Microscópio Binocular Zoom Estereoscópico PZMIII	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	PZMIII
Bomba de Seringa	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	AL-1000