Artigo de método

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/70434

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15 de maio de 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Resumo

Os discos imaginais de Drosophila têm sido estudados há muito tempo como modelos de desenvolvimento, padronização e regeneração epitelial. A marcação e a imagem de discos imaginários dissecados são importantes para visualizar padrões de expressão proteica como marcadores de processos de desenvolvimento e fisiológicos. Esse método de dissecação e marcação imaginária de discos foi originalmente desenvolvido para microscopia de elétrons imunes de discos imaginais olho-antena por Tomlinson e Ready. Utilizando placas de 60 micropoços, e transferindo tecidos entre soluções em vez de transferindo soluções, é possível a atenção individualizada às amostras de tecido com muito pouco desperdício. Até mesmo discos imaginais únicos podem ser processados. O método requer apenas pequenos volumes de anticorpos e outros reagentes. Como exemplo da aplicação do método a outros tecidos pequenos, o artigo também demonstra como discos imaginais de asas podem ser dissecados e rotulados pelo mesmo método. Uma abordagem semelhante pode ser aplicada a qualquer pequeno tecido de dimensões semelhantes, bem como a outros procedimentos histoquímicos e de marcação além da coloração por anticorpos.

Introdução

Os discos imaginários de Drosophila são tecidos progenitores que são separados durante a embriogênese e crescem dentro da larva sem se diferenciar, contribuindo para as estruturas epidérmicas adultas durante o estágiopupal 1. O estudo deles forneceu muitos insights sobre mecanismos de padronização do desenvolvimento, sendo que os discos imaginários do olho e das asas foram particularmente bemestudados 2,3,4,5,6. A imunohistoquímica é particularmente útil para investigar padrões espaciais e temporais de expressão gênica em discos imaginários, bem como para caracterizar comportamentos celulares, incluindo divisão e morte celular.

Para facilitar as demandas adicionais da análise microscópica eletrônica de discos imaginários oculares marcados por anticorpos, Tomlinson e Ready desenvolveram um protocolo em pequena escala que é particularmente econômico com reagentes e oferece um grau muito alto de confiabilidade epersonalização 7. O método deles é descrito em formato impresso, mas nenhum vídeo está disponível 3,8,9. O método é facilmente modificado para a rotulagem de outros discos imaginais (ou outros tecidos) e pode ser aplicado a discos imaginais de asas, além dos discos imaginais olho-antenais.

A marcação de anticorpos dos discos imaginários de Drosophila segue o contorno geral aplicável a qualquer tecido10 (Figura 1). O tecido deve ser dissecado e fixado antes da incubação com anticorpos específicos para proteínas de interesse. Após a lavagem do anticorpo não ligado, um anticorpo secundário marcado (frequentemente fluorescente) é adicionado, que se liga ao anticorpo primário, que por sua vez está ligado à proteína de interesse no tecido fixo. Após a lavagem para remover o anticorpo secundário não ligado, o tecido pode ser montado para exame microscópico, e as proteínas de interesse podem ser visualizadas. Muitas descrições gerais desse processo estão disponíveis e podem ser aplicadas a discos imaginários e outros tecidos de Drosophila 11. Aqui, é fornecido um protocolo para o método Tomlinson & Ready, no qual amostras de tecido são transferidas individualmente entre pequenos poços de incubação em uma placa de micropoço e observadas por um microscópio estereoscópico a cada etapa (Figura 2). Essa abordagem funciona melhor para corar um número menor de tecidos de uma vez (dezenas de amostras) e não é ideal para lotes grandes (ou seja, centenas). Essa abordagem requer apenas pequenos volumes de solução de 13 μL em cada poço e, portanto, pode ser realizada com muito pouco anticorpo. Como há perda mínima de tecido, não há tamanho mínimo da amostra, e até mesmo discos imaginários únicos podem ser processados de forma confiável.

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricando a ferramenta de transferência

  1. Use um alicate para cortar ~2,5cm de fio de tungstênio de 0,005" de diâmetro. Use pinças para formar uma das extremidades do fio em um gancho ou laço (Figura 3). Insira a outra extremidade em um suporte para agulhas. Isso será usado para transferir os discos com pouca ou nenhuma transferência de líquido. O loop pode ser o mais fácil dos dois de usar, mas o gancho transfere menos líquido entre as soluções.

2. Dissecação e fixação de discos imaginais olho-antenas

  1. Enxágue as larvas com ~7,5 mL de 0,1 M fosfato de fosfato de sódio (pH7,2) em uma placa de Petri (60 mm de diâmetro) para remover qualquer meio de mosca ou outros detritos. Veja o passo 6 para a dissecação de discos imaginais das asas em vez dos discos antenais do olho. Ambos esses discos imaginários estão localizados na porção anterior do corpo (Figura 4).
    NOTA: O PBS também pode ser usado no lugar do tampão fosfato nos passos 2.1–2.3.
  2. Transfira as larvas para uma placa de Petri contendo tampão fresco.
    NOTA: Alguns trabalhadores preferem dissecar larvas individuais em gotas tampão simples em uma placa de Petri de 60 mm; Outros usam slides de poço para depressão.
  3. Enquanto observa sob um microscópio dissecante, segure as larvas ~50% do corpo usando pinças. Use um segundo par de pinças finas para segurar os ganchos da boca e puxar. Os discos antenais oculares saem presos às partes da boca. O cérebro também pode permanecer ligado aos discos oculares.
  4. Use a ferramenta de arame para transferir o tecido dissecado para uma pequena placa de Petri (35 mm de diâmetro) contendo ~3 mL de fixador, por exemplo, 3,7% de formaldeído em um tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH7,2), feito diluindo solução de estoque de formaldeído a 37% em tampão.
    NOTA: Siga os procedimentos de segurança aprovados localmente para o manuseio de formol. O formaldeído a 3,7% é um fixador simples que será satisfatório em muitos casos, mas outros fixadores podem ser ótimos para certos antígenos. PBS ou PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mMMgSO 4, 1 mM EGTA) podem ser usados como tampão fixador no lugar de 0,1 M fosfato de sódio, ou uma solução de formaldeído pode ser obtida dissolvendo paraformaldeído sólido, em vez de uma solução concentrada de stock. O fixador paraformaldeído-lisina-periodato (PLP) combina uma fixação proteica mais suave com reticulação de carboidratos e preserva melhor as estruturasmembranares 12. A glicoproteína de Drosophila Scabrous, por exemplo, permanecerá antigênica após a fixação do PLP, mas não após a fixação com formaldeído. Prepare o PLP fresco da seguinte forma: (1) Adicione 2 g de pó de paraformaldeído a 25 mL de água desionizada em um frasco cônico em uma exaustão e mexa em fogo baixo; (2) Mergulhe uma pipeta em uma solução de caldo de hidróxido de sódio a 50% e transfira um traço do líquido (muito menos que uma gota) para a mistura. O paraformaldeído deve se dissolver em poucos minutos sem que a solução fique em fervura. Durante o resfriamento da solução de formaldeído a 8%, dissolva 0,36 g de lisina em 10 mL de água deionizada, 7,5 mL, 0,1 M fosfato de sódio pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO 4 e mantenha-se no gelo. Misture 15 mL dessa solução de lisina tamponada a frio com 5 mL do formol fresco 8% e 50 mg de periodato de sódio em um tubo de 50 mL com tampa roscada, misture por vortexing e use quando estiver fresco.
  5. Após 15–20 minutos em temperatura ambiente, transfira o tecido dissecado para outra placa de Petri contendo 0,1 M de fosfato de sódio tampão (pH 7,2).
    NOTA: PBS também pode ser usado no lugar do tampão fosfato. A fixação no gelo pode ser preferível para alguns antígenos, ou quando se deseja obter imagens da fluorescência endógena de GFP ou RFP expressa no tecido. A fixação do PLP é sempre por 45 minutos no gelo.

3. Bloqueio e incubação com anticorpos primários

  1. Transfira tecido para uma placa de Petri de 35 mm contendo ~3 mL de sabonete anticorporal NSG para bloqueio. Incube a placa de Petri no gelo por pelo menos 15 minutos. O NSG contém 0,1 M de fosfato de sódio tampão (pH 7,2), 0,1% de saponina, 5% de Soro normal de cabra. Os estoques de lavagem são armazenados esterilizados com filtro a 4 °C.
    NOTA: Diferentes buffers de lavagem podem ser ideais para anticorpos específicos. Por exemplo, enquanto a saponina é um detergente suave, não iônico, que solubiliza particularmente a membrana plasmática, outros detergentes podem ser preferíveis para detectar antígenos dentro do núcleo. Como outro exemplo, o anticorpo desenvolvido contra a proteína nuclear Atonal, por Jarman et al.13 , é o mais imunorreativo em tampões contendo NP40 como detergente. Veja a Tabela de Materiais para receitas dos buffers alternativos de lavagem: PDT, PBT ou NSG. Ao usar soro normal como proteína bloqueadora, idealmente, ele deve ser da espécie na qual o anticorpo secundário é produzido, por exemplo, soro normal de cabra se anticorpos secundários de cabra forem usados, ou soro de burro normal se anticorpos secundários de burro forem usados. Na prática, isso faz pouca diferença.
  2. Limpe quaisquer tecidos indesejados dos discos imaginais olho-antenas durante o bloqueio usando pinças finas, exceto os ganchos bucais. Deixe as peças bucais presas por enquanto para facilitar as transferências.
    NOTA: Tecido externo, por exemplo, cérebro, também pode ser deixado até a montagem da lâmina (passo 5.4), desde que não interfira na mancha ou na visibilidade.
  3. Durante o bloqueio, prepare uma diluição 1:100 da solução de anticorpos mAb40-1a em NSG, por exemplo, 1 μL de anticorpo em 100 μL de NSG. Misture pipetando, não por vortex.
    NOTA: mAb40-1a é um anticorpo monoclonal criado contra beta-galactosidase. A diluição e o buffer de lavagem de anticorpos ótimos variam dependendo dos anticorpos específicos.
  4. Adicione soluções de anticorpos de 13 μL em cada um de até seis poços na primeira coluna de uma minibandeja de micropoços de 60 poços. Micropoços cônicos de lados retos são importantes para clareza óptica. Se forem necessários mais de seis poços, comece uma segunda minibandeja.
  5. Transfira discos imaginários olho-antenais, preferencialmente ainda presos às peças bucais, para a solução primária de anticorpos um de cada vez, usando o laço de arame ou gancho.
    NOTA: O número de discos imaginários que podem ser adicionados a cada poço depende do anticorpo. Tecido em excesso pode esgotar alguns anticorpos a ponto de a marcação diminuir. 5 pares por poço geralmente são satisfatórios. Assim, ~60 discos podem ser facilmente marcados usando as 6 fileiras de placas microtituladas de 60 poços. Diferentes anticorpos podem ser usados para cada uma das linhas. Se soluções de anticorpos podem ser reutilizadas exige testes empíricos para cada caso; Não é rotina em nosso laboratório.
  6. Feche a placa com a tampa e fele com parafilm para limitar a evaporação. Incube no gelo ou a 4 °C por 4 horas até a noite. Não é necessário balançar.
    NOTA: O tempo e a temperatura ótimos de incubação dos anticorpos dependem do anticorpo. Em muitos casos, 1–2 horas em temperatura ambiente serão suficientes, mas alguns anticorpos proporcionarão melhores resultados após a incubação a 4 °C, e muitas vezes pode ser conveniente incubar a 4 °C durante a noite. Em poucos casos, incubações primárias de anticorpos de 2–3 dias podem ser ideais. Selar a tampa do micropoço só é necessário para incubações com mais de ~4 horas.

4. Lavagem e incubação com anticorpos secundários

  1. Adicione 13 μL de tampão NSG às próximas três colunas de poços após cada poço de anticorpos, pois as amostras serão lavadas três vezes. Transfira as amostras para lavar por 5 minutos em cada poço sucessivamente.
  2. Durante a lavagem, prepare uma diluição 1:200–400 de anticorpos secundários conjugados fluorescente em um tampão NSG, por exemplo, 0,5 μL de anticorpo em 100 μL de NSG. Misture pipetando, não por vortex. Centrifuge a solução secundária de anticorpos por 60 s (na velocidade máxima) antes da diluição, pois agregados de anticorpos podem se ligar de forma não específica à superfície do tecido.
    NOTA: A diluição secundária ideal de anticorpos pode variar de acordo com o fabricante. Anticorpos conjugados com Alexa ou cianana estão disponíveis subtraídos para outras espécies para facilitar a marcação múltipla.
  3. Adicione 13 μL da solução secundária de anticorpos à próxima (5ª) coluna de poços.
  4. Transfira as amostras para o anticorpo secundário usando o laço ou um gancho.
  5. Feche a placa com a tampa e fele com parafilm para limitar a evaporação. Incube no gelo por 4 horas durante a noite.
    NOTA: O tempo e a temperatura ótimos de incubação dos anticorpos dependem do anticorpo. Em muitos casos, 1–2 horas em temperatura ambiente serão suficientes, mas alguns anticorpos proporcionarão melhores resultados após a incubação a 4 °C, e muitas vezes pode ser conveniente incubar a 4 °C durante a noite. Selar a tampa do micropoço só é necessário para incubações com mais de ~4 horas.

5. Lavagem e montagem de tecido para microscopia

  1. Prepare as próximas três colunas de poços após o poço secundário de anticorpos com 13 μL de NSG. Transfira as amostras por cada poço por 5 minutos.
  2. Transfira as amostras para uma lavagem final no9º poço usando 13 μL de tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,2). Essa lavagem de tampão é necessária quando os tampões de lavagem contêm componentes que precipitam no meio de montagem.
  3. . Adicione 13 μL de meio de montagem à coluna final (10) dos poços. O meio de montagem é produzido dissolvendo 2% de n-propila galato em 75% glicerol e 25% de 0,1 M fosfato de sódio tampon, pH 7,2. Prepare um novo meio de montagem toda semana misturando os componentes em uma plataforma giratória. Deixe as bolhas de ar desaparecerem antes de usar.
    NOTA: Mídias de montagem também estão disponíveis comercialmente.
  4. Pipete 20 μL de meio de montagem em uma lâmina limpa de microscópio. Transfira amostras para o meio da lâmina. Esta é uma última oportunidade para remover tecido indesejado. As peças bucais cuticulares devem ser removidas dos discos antenais dos olhos.
  5. Para organizar as amostras de modo que não se desviem quando o vidro da cobertura for sobreposto, use a ferramenta de arame para arrastar as amostras para fora da gota principal do montador. Baixe suavemente um vidro de cobertura limpo de 22 mm x 40 mm de espessura sobre o ferrolho usando uma pinça, sem introduzir bolhas de ar.
  6. Deixe os ferrolhos descansarem por 1 hora em um suporte de papelão para que o suporte de montagem assente. Evite perturbar as lâminas, pois as amostras frágeis podem ser danificadas se o vidro da cobertura se mover.
  7. Depois que o vidro da cobertura estiver assentado, fele as bordas com esmalte. Não mexa nem pressione o vidro da capa enquanto faz isso. Deixe o esmalte secar por pelo menos 1 hora antes da imagem.
    NOTA: Infelizmente, a maioria dos esmaltes cosméticos agora usa solventes que não se espalham uniformemente nas lâminas de vidro e não são úteis, então é preciso obter esmalte científico.
  8. Armazene os slides a 4 °C. As amostras normalmente podem ser visualizadas e re-visualizadas por meses.
    NOTA: Slides também podem ser armazenados a -20 °C.

6. Dissecação e fixação de discos imaginais de asas

  1. Para dissecar discos imaginais das asas em vez dos discos imaginais olho-antenais, siga os passos abaixo em vez dos passos 2.3–2.5 acima.
  2. Sob um microscópio dissecante, segure as peças bucais larvais com pinças finas. Usando tesouras de microdissecação, corte as larvas ao meio de 30% a 40% do caminho a partir da anterior.
  3. Inverta a porção anterior da larva abrindo a extremidade aberta e cortada da larva usando um segundo par de pinças e empurrando a cabeça e as peças bucais, semelhante a inverter uma meia
  4. Use pinças para transferir as larvas anteriores invertidas para um fixador em uma pequena placa de Petri (35 mm de diâmetro) contendo ~2,5 mL de fixador, por exemplo, 3,7% de formaldeído em 0,1 M fosfato de sódio tampão (pH 7,2), feito diluindo solução de formaldeído a 37% em PBS.
    NOTA: Se desejado, carcaças invertidas podem ser transferidas para 400 μL de fixador em um tubo de microfuga, o que facilita a fixação em uma exaustão exaustiva. As mesmas opções fixativas disponíveis para a fixação ocular-imaginária do disco também se aplicam à fixação do disco das asas (veja a NOTA no passo 2.4). A fixação ótima e para rotular discos imaginários olho-antenas geralmente será a mesma para discos de asas.
  5. Após 15–20 minutos em temperatura ambiente, transfira o tecido dissecado para outra placa de Petri contendo 0,1 M de fosfato de sódio tampão (pH 7,2).
    NOTA: As mesmas opções de buffer de lavagem disponíveis para fixação do disco visual-olho também se aplicam à fixação do disco das asas (veja NOTA no passo 2.4). O buffer de lavagem ideal para rotular discos imaginários olho-antena geralmente será o mesmo para discos de asas.
  6. Remova os discos das asas das larvas usando pinças finas. Se ainda estiverem presentes, o disco haltere menor e o disco da perna podem ser removidos agora ou permanecer presos aos discos das asas para facilitar as transferências.
    NOTA: Os discos das asas podem não ser facilmente visíveis na carcaça até que o corpo de gordura ou outro tecido seja retirado (sempre identifique um tecido antes de removê-lo). Os discos das asas são os maiores discos imaginários e estão fixados à parede do corpo, intimamente associados à traqueia. Eles têm formato de gota, como o contorno da Américado Sul 1 (Figura 4).
  7. Continue com os passos 3–5 como acima.

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Resultados

O procedimento Tomlinson and Ready regularmente produz excelentes resultados de coloração por anticorpos. Aqui, discos imaginais triplos rotulados para olhos, antenas e asas são ilustrados. Na Figura 5A, um disco imaginário antenal ocular de terceiro ínstar foi triplo marcado para detectar o fator de transcrição Senseless (azul), o marcador progenitor neural Elav (vermelho) e a marcação anti-GFP de clones celulares que expressam RNAi para o transcrito Oc...

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Discussão

A coloração por anticorpos dos tecidos de Drosophila usando placas de poço cônico de 60 poços usando o método Tomlinson and Ready resulta em excelentes resultados e é altamente confiável, pois cada disco imaginário é acompanhado ao microscópio dissecante durante cada manipulação. O método requer apenas pequenas quantidades de reagentes de anticorpos e troca as soluções de forma mais completa a cada etapa, já que as amostras são transferidas com muito pouco líquido associado. É e...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

A NEB agradece a Andrew Tomlinson por compartilhar o método e a Lucy Firth pelos aprimoramentos. Agradecemos a Abhishek Bhattacharya por contribuir com a Figura 5A. Agradecemos a Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen e Jensen Northrup. A pesquisa no laboratório dos autores é financiada por bolsas do NIH (GM120451 e CA284362). A Figura 2 e a Figura 4 foram criadas com o Biorender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fosfato dissódicoFisher7558-79-4Na2HPO4 - fosfato de sódio dibásico anidro. Outros estados de hidratação podem ser usados, mas mudam o peso molecular
Pinça: Dumont #5 Pinça BiologieFerramentas científicas finas11252-20Estilo: #5
           Formato da Ponta: Reta
               Comprimento: 11cm
           Autoclave Safe: Sim
           Dicas: Biologia
           Dimensões da Ponta:
         0,05 x 0,02mm
           Liga / Material: Inox
FormaldeídoFisherBP531-500Grau em biologia molecular, 37% de formaldeído. 500ml
Fixador de FormaldeídoFisherBP531-5003,7% de formaldeído em 0,1M de tampão fosfato de sódio pH7,2 produzido por diluição a partir de 37% de estoque.
GlicerolBiorreagentes FisherBP229-1
GeloPreferência do Usuário
L-Lisina, 98%TermociênciaJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sAnti-beta galactosidase
Tubos microcentrífugasCiência dos EUA1615-5520Tubos de 1,5mL para armazenar amostras.
Tesouras de microdissecaçãoFerramentas Científicas Finas15003-08Borda de corte de 5mm, ponta reta, 8,5cm
Fosfato MonossódicoFisher7558-80-7NaH2PO4 - Fosfato de Sódio Monobásico Anidro. Se for usada uma forma hidratada, o peso necessário para fazer uma solução de 0,1M variaria.
Meio de MontagemSolução de glicerol a 75% em 0,1M fosfato de sódio tampão pH7,2 com 2,5% de n-propila galato. Misture por inversão para minimizar bolhas.
NSG0,1M fosfato de sódio tampão pH7,2, 0,1% saponina, 5% NGS
N-propilo galatoMP Biomédicos210274780
EsmalteTed Pella, Comprado de FisherNC0381432Para lâminas de vedação
Suporte de agulhaFisherNC0099380Para microdissecar agulhas. Aço inoxidável oco; comprimento do cabo: 4 3/4" de comprimento
Mini Trays Microwell NuncTermo Científica12565155MicroWell MiniTray para aplicações sorológicas. Contagem de poços 60
ParafilmStatLabPM996StatLab ParaFilm M Filme Flexível Auto-Selante
ParaformaldeídoPolysciences, Inc.00380-250
10x PBSPreferência do UsuárioPrepare 800 mL de água destilada em um recipiente adequado.
           Adicione 1,37M de cloreto de sódio à solução.
             Adicione 26,8 mM de cloreto de potássio à solução.
             Adicione 101mM de Dibásico de Fosfato de Sódio à solução.
         Adicione 18,0 mM de Monobásico de Fosfato de Potássio à solução.
         Ajuste a solução para o pH desejado (tipicamente pH &assínpita; 7,4).
           Adicione água destilada até o volume chegar a 1 L.
PBTPreferência do Usuário0,1M de fosfato de sódio tampão pH7,2, 0,1% de albumina sérica bovina e 0,2% Triton X-100.
PDTPreferência do Usuário0,1M de tampão fosfato de sódio (pH = 7,2), 0,3% desoxicolato e 0,3% Triton x-100
Placa de PetriFalconCorning 351007Placa de Petri; 60mm; não tratado
Placa de PetriFalconCorning 351008Placa de Petri; 35mm; não tratado
AlicatePreferência do Usuário
PLPN/A2% de paraformaldeído 1,35% de lisina em 0,05M fosfato de sódio tampão pH7,2
Anticorpos SecundáriosJackson ImmunoResearch715-545-1510,5mg Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.
Tampas de SlidesVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (CAIXA)
SlidesFisher125442Fisher Glass Slides 10bx/CS
Desoxicolato de sódioCiência Termodinâmica Fisher89904detergente desoxicolato de sódio; 5mg
Periodato de sódioSigma Aldrich71859-25GPeriodato de sódio – 25 gramas
Tamponador de fosfato de sódio0,1M do tampão NaPO4 pH 7,2. Misture 28ml de estoque fosfato monossódico anyhdrous de 0,1M (11,998g NaH2PO4 a 1L de água destilada) com 72ml de 0,1M de fosfato dissódico qualquer (14,196g Na2HPO4 a 1L de água destilada) para gerar 100ml de tampão de 0,1M NaPO4. Alternativamente, pode ser usado PBS.
Fio de tungstênioTed Pella27-11.005" Dia.
Triton x-100Ciência Termodinâmica FisherA16046AE
VórticePreferência do Usuário

Referências

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