Efeito Regulatório da Moxibusção na Polarização e Migração de Macrófagos em Ratos Model de AR e o Papel do TIM-3

Resumo

Este estudo examina os efeitos regulatórios da moxibustão na polarização e migração dos macrófagos em modelos de ratos de artrite reumatoide, com foco no papel da imunoglobulina das células T e da proteína contendo o domínio mucina 3 (TIM-3), para elucidar os mecanismos terapêuticos da moxibussão nessa doença.

Resumo

Este estudo teve como objetivo examinar os efeitos regulatórios da moxibustão na polarização e migração de macrófagos em um modelo de ratos com artrite reumatoide, bem como o papel da imunoglobulina das células T e da proteína contendo o domínio mucina 3 (TIM-3) nesse processo. No dia 0 do experimento, ratos Sprague–Dawley (SD) foram divididos em cinco grupos. O adjuvante de Freund completo (CFA) foi injetado nas almofadas traseiras para estabelecer o modelo da artrite reumatoide. Além disso, interferência de RNA Havcr2 mediada por lentivírus (LV-Havcr2-RNAi) foi injetada nas almofadas traseiras para inibir a expressão do TIM-3. A partir do sétimo dia, os ratos passaram por tratamento com moxibustão em ciclos de seis dias de tratamento e um dia de descanso, totalizando três ciclos completos. Após a conclusão da terapia com moxibustão, o estado inflamatório foi avaliado por meio de análise histológica e medição da espessura das patas. Marcadores fenotípicos dos macrófagos M1 e M2 foram avaliados por ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e imunofluorescência. A expressão do TIM-3 foi detectada por meio de reação em cadeia quantitativa em tempo real da polimerase (qRT-PCR) e Western blot. Além disso, macrófagos exsudados peritoneais (PEMs) foram isolados de ratos SD adicionais, e a migração de macrófagos foi examinada usando um ensaio Transwell. O estudo constatou que, após a injeção de CFA, ratos apresentaram vermelhidão e inchaço significativos nas patas, além de um desequilíbrio na expressão do fenótipo dos macrófagos. Além disso, os ensaios de migração Transwell revelaram que ratos-modelo induzidos por CFA apresentaram aumento na migração de macrófagos em relação aos espécimes controle. No entanto, o tratamento com moxibustão atenuou essas mudanças. Os resultados também demonstraram que a moxibusção aumentou a expressão do TIM-3 e, após intervenção lentiviral, os níveis de TIM-3 foram significativamente reduzidos, levando ao agravamento das manifestações inflamatórias e desequilíbrio dos macrófagos. Esses resultados indicam que o TIM-3 atua como um mediador-chave na regulação da polarização e migração dos macrófagos por moxibustion.

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é um distúrbio autoimune sistêmico prevalente que se apresenta clinicamente com artrite inflamatória simétrica. A inflamação tem como alvo principal a membrana sinovial, cartilagem e osso, resultando em destruição de tecidos e culminando em deformidade irreversível da^{articulação 1}. O manejo farmacológico atual da AR depende principalmente de medicamentos antirreumáticos modificadores da doença (^DMARDs)2, que frequentemente exigem administração vitalícia. No entanto, esses agentes terapêuticos estão associados a vários efeitos adversos. Consequentemente, um número significativo de pacientes busca terapias complementares seguras e eficazes para aliviar os sintomas clínicos e, potencialmente, reduzir sua dependência dos regimes medicamentosos convencionais. Como componente chave da medicina tradicional chinesa, a moxibustão pode servir como uma terapia complementar promissora para a AR. Exerce seus efeitos terapêuticos por meio de mecanismos sistêmicos anti-inflamatórios e^{imunomoduladores 3}. Evidências indicam que a moxibustão pode aliviar sintomas e proteger as estruturas^{articulares 4}. Além disso, em comparação com a potencial toxicidade heparrenal, riscos de infecção e altos custos associados aos DMARDs, a moxibustão oferece segurança superior e menor custo. No entanto, a moxibustão não é uma panaceia e não pode substituir totalmente os DMARDs para o gerenciamento da AR. A moxibustão normalmente requer sessões repetidas e de tratamento de longo prazo para alcançar seus efeitos. Durante exacerbações agudas da AR, pode não proporcionar controle rápido dos sintomas. Além disso, o resultado terapêutico da moxibusção depende fortemente da habilidade e experiência do praticante, introduzindo variabilidade. Consequentemente, a integração da moxibussão com DMARDs deve ser considerada para alcançar um efeito sinérgico de "eficácia aumentada com toxicidade reduzida", tornando-se uma estratégia viável para o manejo a longo prazo da^{AR 5}.

Embora numerosos estudos tenham confirmado a eficácia terapêutica da moxibusção na^{AR 6,7,8}, seus mecanismos precisos de ação permanecem incertos. Este estudo investiga os efeitos da moxibusção na polarização e migração de macrófagos na AR, utilizando a imunoglobulina das células T e a proteína 3 contendo domínio mucina (TIM-3) como ponto de entrada mecanicista. Essa abordagem foi projetada para elucidar uma via imunomoduladora potencial pela qual a moxibusção exerce seus efeitos antiartríticos.

Como células imunes fundamentais, os macrófagos desempenham um papel central na patogênese e progressão da^{AR 9,10}. Com o início da inflamação, os macrófagos residentes nos tecidos liberam uma variedade de citocinas e quimiocinas. Essas moléculas sinalizadoras atuam sobre as células endoteliais vasculares, promovendo a diferenciação dos monócitos circulantes em macrófagos e seu subsequente recrutamento para tecidos^{inflamados 11,12}. Esses macrófagos infiltradores amplificam ainda mais a resposta inflamatória ao produzir mediadores adicionais, que por sua vez recrutam mais macrófagos e agravam a infiltração tecidual, estabelecendo assim um ciclo vicioso de inflamação e infiltração tecidual.

Dependendo dos estímulos ambientais, os macrófagos apresentam plasticidade significativa ao polarizar-se em fenótipos funcionais distintos, principalmente estados M1 (ativado classicamente) e M2 (ativado alternativamente^{) 13}. Sob condições fisiológicas, a polarização dos macrófagos mantém um equilíbrio dinâmico entre os fenótipos M1 e M2. No entanto, na AR, esse equilíbrio é perturbado, caracterizado por polarização aumentada do M1 com maior liberação de mediadores pró-inflamatórios, incluindo interferon (IFN)-γ e sintase induzível de óxido nítrico (iNOS), que agravam as respostas inflamatórias. Simultaneamente, a polarização do M2 é enfraquecida, acompanhada por uma redução na liberação de fatores anti-inflamatórios, incluindo interleucina (IL)-4 e CD206, prejudicando sua capacidade de inibir a ativação e proliferação das células T, agravando assim a progressão da^{doença 14}. Diversas pesquisas revelaram que modular o equilíbrio dos macrófagos M1/M2 pode mitigar a progressão da^{AR 15,16}.

TIM-3, identificado como uma glicoproteína de superfície de células T, é amplamente expresso em um espectro de células imunes, incluindo células T, macrófagos e células natural killer, onde se liga a ligantes específicos para exercer funções^{imunarregulatórias 17}. A sinalização TIM-3 exerce uma influência definitiva na expressão e polarização das citocinas inflamatórias dos macrófagos. Notavelmente, o TIM-3 é altamente expresso nos macrófagos M2, onde promove o fenótipo M2 enquanto suprime o fenótipo M1. Por outro lado, pesquisas indicam que a inibição do TIM-3 produz o efeito oposto, impulsionando a polarização M1 e atenuando a polarização M2 18,19,20. Além disso, evidências destacam o TIM-3 como um regulador chave do comportamento migratório dos^{macrófagos 21,22}. Portanto, a intervenção terapêutica voltada para o TIM-3 para controlar a polarização dos macrófagos e a dinâmica migratória mostra considerável potencial como estratégia de tratamento da AR.

Com base na justificativa mencionada, este estudo foi conduzido para contribuir para o crescente corpo de conhecimento sobre os mecanismos pelos quais a moxibustão exerce seus efeitos terapêuticos na AR.

Protocolo

Declaração Ética e Precauções de Segurança
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (2024029). Durante todos os procedimentos de injeção, incluindo a administração de CFA e lentivírus, os operadores devem usar equipamentos de proteção individual (EPI) compostos por luvas descartáveis, óculos de proteção e jalecos de laboratório. Esses procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança ou em um ambiente bem ventilado. Todos os objetos cortantes que entraram em contato com reagentes devem ser imediatamente descartados em recipientes designados para objetos cortantes. Durante todo o tratamento de moxibussão, o operador monitorou de perto a resposta do animal. O cone de moxa foi prontamente substituído para evitar danos térmicos na pele. Além disso, materiais inflamáveis devem ser mantidos longe da moxa em chamas para eliminar riscos de incêndio.

1. Estabelecimento do modelo de AR

Trinta ratos machos SD (peso: 200 ± 20 g), com seis semanas de idade (número da licença: SCXK 2020-030), foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 6): grupo controle, grupo modelo AR (grupo RA), grupo de tratamento AR + moxibustão (grupo Mox), grupo de interferência lentivírus RA + TIM-3 (grupo RA + TIM-3) e grupo de tratamento AR + TIM-3 interferência lentivírus + moxibustão (AR + TIM-3– + grupo Mox). Antes do experimento, os ratos eram aclimatados por sete dias em um ambiente controlado com temperatura de 22–24 °C, umidade de 20% e um ciclo natural de luz/escuro, com livre acesso a comida e água. No dia 23 do experimento, mais cinco ratos machos de três semanas foram comprados da mesma empresa. Esses ratos foram aclimatados por cinco dias sob condições idênticas de alojamento antes de serem usados para extração de PEM. Um diagrama esquemático resumindo o procedimento experimental e fotografias representativas do procedimento são mostrados na Figura 1.

No dia 0 do experimento, 0,5 mL/kg de CFA foram injetados nas almofadas das patas traseiras de todos os ratos, exceto aqueles do grupo controle, para induzir AR. O mesmo volume de soro fisiológico foi administrado no mesmo local em ratos do grupo controle. A espessura da pata foi usada como critério para avaliar o estabelecimento bem-sucedido do modelo^{RA 23}.

2. Injeção de lentivírus

Ratos dos grupos RA + TIM-3^- e RA + TIM-3^- + Mox receberam injeção de RNAi LV-Havcr2 (94435-1) nas almofadas das patas traseiras (3,5 × 10⁷ TU/mL; 10 μL por almofada) no primeiro dia do experimento. Todos os outros ratos receberam injeções idênticas de soro fisiológico normal no mesmo local^{anatômico 24}.

3. Moxibustão

No sétimo dia do experimento, ratos dos grupos Mox e RA + TIM-3^- + Mox receberam tratamento com moxibussão. Para facilitar o procedimento, os pelos em uma área de aproximadamente 1 × 1 cm ao redor dos pontos de acupuntura BL23 e ST36 foram raspados (esse procedimento também foi realizado em ratos dos grupos restantes). Durante a moxibussão, cada rato era gentilmente preso a um bloco de madeira um pouco maior que seu tamanho corporal, usando duas elásticas para expor totalmente as áreas de tratamento (ratos de outros grupos eram igualmente retidos). Posteriormente, cones de moxa em forma de grão foram aplicados em ambos os pontos de acupunctura. Para garantir consistência na estimulação térmica entre os indivíduos, cada cone de moxa (diâmetro: 2 mm; altura: 5 mm; teor de lã de moxa: 60%) foi preparado a partir de uma porção padronizada de 5 mg de lã de moxa. A cada dia, cinco cones eram aplicados nos dois pontos de acupuntura de um lado do corpo, com o tratamento alternando para o lado contralateral no dia seguinte. Esse protocolo de tratamento alternado foi mantido por três semanas, com um período de descanso de um dia a cada sete dias.

Após três ciclos de tratamento com moxibussão, os ratos foram anestesiados usando isoflurano (indução de 4%, 2% manutenção, inalação), e 5 mL de sangue arterial foram coletados da aorta abdominal. Após a centrifugação (2.000 × g, 15 min, 4 °C), o soro sobrenadante era transferido para tubos de microcentrífuga e armazenado a −20 °C. Após a coleta de sangue, os ratos foram eutanasiados por luxação cervical. As articulações do tornozelo foram cuidadosamente dissecadas e fixadas em paraformaldeído a 4%. Tecidos e baços sinoviais foram rapidamente congelados usando nitrogênio líquido e armazenados a −80 °C.

4. Medição da espessura das patas de rato

Os pontos médios das patas traseiras dos ratos eram marcados com um marcador à prova d'água para garantir uma posição consistente das medidas. A espessura da pata foi medida usando pinças vernier antes da modelagem, após a modelagem bem-sucedida e entre cada ciclo de tratamento (nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 do experimento).

5. Análise histológica

Após a fixação em paraformaldeído a 4%, as articulações do tornozelo do rato foram colocadas em tubos centrífugos contendo um volume amplo de solução de descalcificação (10% ácido fórmico). Os tubos eram montados em um agitador e submetidos a uma agitação suave em temperatura ambiente por 30 horas. Durante esse período, a solução de descalcificação foi substituída em intervalos regulares, e a condição dos tecidos foi monitorada para evitar descalcificação excessiva. Posteriormente, os tecidos foram transferidos para uma solução de tiosulfato de sódio a 5% para neutralização ao longo de 6 horas, seguida por um enxágue completo de 4 horas sob água da torneira^{corrente por 25} horas. Os tecidos foram então desidratados e incorporados em blocos de parafina. As seções eram cortadas transversalmente com uma espessura de 5 μm. Após a deparafinização e hidratação, as seções eram tingidas com hematoxilina por 3 minutos, enxaguadas com água, diferenciadas brevemente (5 s), enxagueadas novamente e azuladas por 5 s, seguidas por um enxágue completo sob água da torneira corrente. Posteriormente, as seções foram desidratadas em etanol 95% por 1 minuto e contra-coloridas com eosina por 15 segundos. Por fim, as seções eram desidratadas, limpas e montadas com uma cobertura para observação sob um microscópio óptico. Com essa coloração, os núcleos apareceram azuis, enquanto citoplasma, fibras de colágeno e glóbulos vermelhos eram visualizados em vários tons de rosa; a camada queratinizada normalmente tingia um vermelho vivo.

6. ELISA

Seguindo o protocolo do fabricante, uma alíquota de 100 μL de cada amostra de soro (pré-diluída 1:2) foi adicionada aos poços designados. Poços brancos e padrão foram incluídos em paralelo. Após a vedação, a placa foi incubada a 37 °C por 90 minutos. Após uma etapa de lavagem, o anticorpo de detecção foi adicionado e incubado a 37 °C por 60 minutos. Após outra lavagem, foi adicionado estreptavidina–conjugado HRP. Após uma lavagem cuidadosa, a solução de substrato era adicionada para o desenvolvimento da cor, que era interrompida pela adição da solução de parada. A absorvância foi medida em 450 nm (OD₄₅₀). As concentrações amostrais de IL-4 e IFN-γ foram determinadas por interpolação a partir da curva padrão, e as concentrações finais foram calculadas multiplicando pelo respectivo fator de diluição.

7. qRT-PCR

O RNA total foi extraído de amostras de soro usando reagente TRIzol de acordo com um protocolo modificado. Brevemente, 100 μL de soro foram homogeneizados com 1 mL de reagente TRIzol por pipeteamento vigoroso. Posteriormente, 100 μL de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos, seguida de incubação em temperatura ambiente por 3 minutos. A amostra foi então centrifugada a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para alcançar a separação de fases. A fase aquosa superior foi cuidadosamente transferida para um novo tubo, misturada com 0,5 mL de isopropanol, e incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, o RNA total foi pelletado por centrifugação a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O pellet de RNA resultante foi lavado uma vez com 1 mL de etanol a 75% (centrifugação a 8.000 × g por 5 minutos a 4 °C) e seco ao ar antes da dissolução final. O RNA obtido passou por transcrição reversa usando um kit de síntese de cDNA. A análise de expressão gênica foi realizada por qRT-PCR usando software de sistema de PCR quantitativa em tempo real. β-actina era usada como gene de manutenção doméstica para normalização. A expressão relativa do mRNA TIM-3 foi calculada usando o método 2^−ΔΔCt . Os detalhes dos primers são adicionados na Tabela 1.

8. Western blot

O baço extraído foi lavado três vezes com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado (PBS), cortado em pequenos pedaços e lisado adicionando tampão de lise em um volume dez vezes maior que o do tecido. A homogeneização foi realizada usando um tubo homogeneizador. O homogeneado foi colocado no gelo por 30 minutos para lise, com cinco a seis rodadas de vórtice para garantir a completa ruptura do tecido. As amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado como extrato total de proteína. As concentrações de proteínas-alvo foram medidas usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA), de acordo com o protocolo do kit.

Após a separação por eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio a 10% (SDS–PAGE), as amostras de proteína extraídas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana foi bloqueada em temperatura ambiente por 1 h com solução salina Tween 20 (TBST) com Tris-buffer, suplementada com leite desnatado a 5%, seguida de incubação durante a noite a 4 °C com anticorpos primários. Após lavagem completa, a membrana foi incubada com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) a 37 °C por 2 horas. Por fim, as imagens foram capturadas usando um sistema de imagem quimioluminescência e analisadas para intensidade em escala de cinza usando software de análise ChemiScope. Detalhes dos anticorpos primários e secundários estão listados na Tabela 1.

9. Detecção de imunofluorescência

O tecido sinovial extraído foi imerso em 4% de paraformaldeído, desidratado e embutido em parafina antes de ser seccionado em fatias de 5 μm de espessura. As seções foram desenceradas sequencialmente em xileno I, xileno II e xileno III (10 min cada), seguidas por três lavagens em etanol absoluto (5 min cada) e um enxágue final com água destilada.

Após a coleta de antígenos no ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), as lâminas foram lavadas três vezes em soro salino tamponado com fosfato (PBS) (5 min cada) com agitação suave. As seções foram então bloqueadas por incubação com albumina sérica bovina (BSA) a 3% por 30 minutos em temperatura ambiente. Após o bloqueio, anticorpos primários, incluindo anti-induzível de óxido nítrico sintase (iNOS) (1:500) e anti-CD206 (1:400), foram aplicados e incubados a 4 °C por 24 horas.

Após três lavagens PBS de 5 minutos, as seções foram incubadas por 50 minutos a 37 °C no escuro com um anticorpo secundário (IgG anti-coelho conjugado com Cy3, 1:300). A coloração nuclear foi realizada lavando as lâminas três vezes com PBS (5 min por lavagem), seguida de tratamento com solução de coloração 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incubação de 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. As imagens foram examinadas sob um microscópio de fluorescência.

10. Isolamento dos PEMs

Após a eutanásia por luxação cervical, os ratos foram desinfetados com etanol a 75% por 10 minutos e transferidos para um gabinete de biossegurança estéril. A pele abdominal foi incisa com tesoura estéril, seguida por injeção intraperitoneal de 15 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) usando uma seringa. O abdômen era suavemente massageado antes que o fluido peritoneal fosse aspirado de volta para a seringa e transferido para tubos centrífugas para obter suspensões de macrófagos.

A suspensão celular foi lavada três vezes com PBS antes de ser semeada no meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco, contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). As células foram cultivadas por 24 horas em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C. As células aderentes obtidas após esse período de incubação foram identificadas como macrófagos.

11. Transwell

O ensaio de migração foi realizado usando placas de 24 poços. Após 24 horas de inanição sérica, 4 × 10⁴ macrófagos em 300 μL de DMEM suplementados com 1% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibióticos (50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina) foram adicionados à câmara superior, enquanto 700 μL de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos foram introduzidos na câmara inferior. As células foram pré-tratadas com soro de diferentes grupos de ratos por 24 horas. Posteriormente, as placas foram incubadas a 37 °C em um ambiente de 5% de CO₂ por 24 horas. Após a coloração com violeta cristalino, a câmara superior foi recolhida com cotonete para remover células não migratas. As células migratórias foram quantificadas por contagem manual em quatro campos de visão selecionados aleatoriamente sob um microscópio óptico.

12. Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas usando a versão 25.0 do SPSS. Os conjuntos de dados foram testados primeiro quanto à normalidade e homogeneidade das variâncias. Quando essas suposições paramétricas foram atendidas, comparações entre grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguidas por análise post hoc de diferença mínima significativa (LSD). Para dados que violaram essas suposições, foi aplicado o teste de Kruskal–Wallis não paramétrico, seguido pelos testes Mann–Whitney U com correção apropriada para múltiplas comparações. Todos os valores foram expressos como média ± desvio padrão, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Disponibilidade de dados
Os dados brutos gerados durante o estudo atual estão disponíveis no repositório Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197)

Patologia articular e espessura das patas em ratos após tratamento com moxibustão
Ratos injetados com CFA desenvolveram inchaço e vermelhidão evidentes nas patas. A coloração por hematoxilina e eosina demonstrou q...

Discussão

O manejo atual da AR depende predominantemente de DMARDs. No entanto, esses agentes farmacológicos costumam ser caros e estão associados a efeitos adversos não negligenciáveis, incluindo insuficiência heparrenal e infecções^graves, impondo um ônus substancial sobre indivíduos e sistemas de saúde. Em contraste, como tratamento externo, a moxibussão apresenta um perfil de segurança favorável com risco mínimo relatado de toxicidade sistêmica. Sua técnica é relativamen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Completo Freund' s Adjuvante (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881	Usado para induzir artrite reumatoide (AR) modelo em ratos
Lentivírus (RNAi TIM-3)	GenChem Biotechnology, Xangai	3,5 vezes; 107 TU/mL	Usado para silenciar a expressão do gene TIM-3
Cones de Moxa (tamanho trigo)	Fornecedor de Medicina Tradicional Chinesa	N/A	Usado para moxibusção nos pontos de acucidade BL23 e ST36