Artigo de investigação

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares enriquecidas com exossomos de células mamíferas infectadas pelo Vírus da Dengue tipo 2

DOI:

10.3791/70437

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27 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos o isolamento de vesículas extracelulares enriquecidas com exossomos a partir de supernadante de cultura celular infectado pelo vírus da Dengue tipo 2, seguido pela caracterização da integridade e distribuição do tamanho das vesículas, e avaliação da ausência de vírus infeccioso detectável por ensaio de placas sob condições experimentais definidas.

Resumo

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Os EVs enriquecidos com exossomos são vesículas liberadas de vários tipos celulares em fluidos extracelulares como plasma, urina, saliva, meio de cultura celular e outros fluidos corporais. Seus diâmetros variam de 30 nm a 150 nm. Eles foram implicados em diferentes processos celulares, incluindo comunicações celulares e modulação imune durante a infecção. Com base nesses efeitos, eles têm sido usados para estudar a patogênese de vários vírus. É desafiador isolar VEs enriquecidos com exossomos de supernadantes celulares infectados por vírus usando técnicas atuais de purificação. Isso se deve em grande parte à sobreposição de tamanho entre certos vírus e veículos elétricos enriquecidos com exossomos. Aqui, nosso objetivo é purificar EVs enriquecidos com exossomos a partir de supernadante de culturas celulares infectadas por Dengue tipo 2. Veículos elétricos enriquecidos com exossomos foram isolados usando um kit comercial de isolamento de exossomos. Para os EVs isolados enriquecidos com exossomos neste protocolo, nenhum vírus infeccioso foi detectado por ensaio de placas nas condições testadas. Os EVs purificados enriquecidos com exossomos foram caracterizados usando western blotting para tetraspaninas, análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão para confirmação de tamanho. Demonstramos que nossos EVs enriquecidos com exossomos estão intactos e dentro da faixa normal de diâmetro dos exossomos de 30-150 nm. No geral, nosso protocolo oferece um método barato para purificar EVs enriquecidos com exossomos a partir de supernadante de cultura celular infectado por vírus, que pode ser usado em ensaios funcionais posteriores.

Introdução

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EVs enriquecidos com exossomos são vesículas de tamanho nanométrico liberadas por cada célula do corpo. São subtipos de vesículas extracelulares (EVs) de origem endocítica. Veículos elétricos enriquecidos com exossomos foram descobertos pela primeira vez em meios de cultura dereticulócitos 1. Nas últimas décadas, os EVs enriquecidos com exossomos foram purificados de vários fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite materno, fluidos seminais e líquidos amnióticos 2,3,4,5. Eles têm diâmetro que varia de 30 nm a 150nm 6. Sua liberação no compartimento extracelular ocorre por meio da fusão de corpos multivesiculares (MVBs) com a membrana plasmática celular. No contexto de infecções e resposta imune, EVs enriquecidos com exossomos são conhecidos por provocar uma resposta específica em células de mamíferos. Tais respostas incluem a liberação de citocinas ou alterações na suscetibilidade àinfecção 7,8,9.

O conteúdo dos EVs enriquecidos com exossomos é influenciado por vários fatores, sendo o mais importante o tipo e estado da célula que osproduz 10,11. Além disso, seu conteúdo também determina os efeitos que elas têm sobre células receptoras ingênuas. Atualmente, vários métodos são usados para isolar veículos elétricos enriquecidos em exossomos a partir de fluidos biológicos. Métodos comuns incluem ultracentrifugação diferencial, precipitação, captura de imunoafinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, isolamento baseado em magnetismo e isolamento baseado em microfluídicos.

A ultracentrifugação diferencial é considerada uma das técnicas mais utilizadas 12,13,14. O método de purificação por ultracentrífuga é caro e requer grande proficiência técnica. Esse método também resulta em uma perda significativa de EVs devido a múltiplas etapas de ultracentrifugação. Por fim, os EVs enriquecidos com exossomos resultantes não estão livres de partículas virais ativas devido às suas propriedades fenotípicas semelhantes. Isso tornou desafiadora a purificação de EVs enriquecidos com exossomos a partir de supernadantes celulares infectados por vírus. Portanto, é importante desenvolver um protocolo otimizado para reduzir efetivamente os níveis do vírus da dengue (DENV) a níveis indetectáveis na solução EV enriquecida com exossômicos, pois os vírus compartilham tamanhos e densidades semelhantes aos exossomos15,16.

Comparado a outras técnicas comumente usadas, esse protocolo oferece várias vantagens, incluindo redução do tempo de purificação, dependência de equipamentos laboratoriais baratos e amplamente acessíveis, e a capacidade de isolar EVs enriquecidos com exossomos sem contaminação viral viva detectável. Além disso, embora métodos como centrifugação por gradiente de densidade e isolamento à base magnética possam oferecer vantagens, incluindo aumento do rendimento e maior pureza, essas abordagens exigem uma etapa inicial de ultracentrifugação. O objetivo deste artigo é apresentar um método para isolar EVs enriquecidos com exossomos de supernadantes infectados sem vírus infeccioso detectável por ensaio de placas sob as condições testadas.

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Protocolo

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1. Preparação de mídias livres de exossomos

  1. Conecte um filtro de 0,1 μm à base do receptor dentro do gabinete de biossegurança Classe II (BSC).
  2. Despeje assépticamente o soro fetal bovino (FBS) inativado por calor sobre o filtro e conecte-o à bomba de vácuo dentro do BSC.
  3. Repita o passo 1.2 com o flowthrough mais duas vezes.
  4. Prepare um meio completo para conter 10% da FBS tripla filtrada, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina.
    NOTA: O método de filtração tripla é usado para evitar a necessidade de instrumentos como uma ultracentrífuga.

2. Infecção pelo vírus da dengue em células de mamíferos

  1. Cultive células Vero durante a noite em um frasco de cultura T75cm 2 dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO2.
  2. No dia seguinte, verifique se a célula está entre 70% e 80% confluente e infecte as células com multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 de DENV-2 em 5 mL de meio completo e incube a 37 °C com 5% deCO-2 por 2 horas.
  3. Após 2 horas, remova o sobrenadante e lave o frasco 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
  4. Adicione 50 mL de meio completo ao frasco e incube a 37 °C com 5% de CO2 por 4 dias (pouco antes de observar os efeitos citopáticos).

3. Purificação de exossomos baseada em kit

  1. Transfira o meio de cultura celular do frasco para um tubo cônico de 50 mL e centrifuge a 200 × g por 15 minutos em temperatura ambiente.
  2. Transfira a mídia para um novo tubo cônico. Adicione 125 μL de reagente de precipitação EV, seguido por 600 μL da resina. Deixe o vórtice por 10 s e deixe descansar por 10 minutos dentro do BSC em temperatura ambiente.
  3. Faça vórtice por mais 10 s e centrifuge a aproximadamente 450 × g por 2 minutos em temperatura ambiente. Transfira para o BSC, descarte o sobrenadante e aplique 600 μL de buffer de resuspensão ao pellet.
  4. Faça vórtice por 10 s e incube em temperatura ambiente por 15 minutos.
  5. Faça vórtice por mais 10 s e centrifuge a aproximadamente 25 × g por 2 minutos em temperatura ambiente.
  6. Transfira o sobrenadante para uma coluna de spin de filtro e centrifuge a aproximadamente 4.500 × g por 1 minuto em temperatura ambiente. Colete o fluxo contendo EVs enriquecidos com exossomos intactos e armazene-o a -80 °C até que esteja pronto para uso.
  7. Confirme que o EV enriquecido com exossomos está livre de vírus vivos realizando um ensaio de placa17.
  8. Caracterize o EV enriquecido com exossomos usando microscopia eletrônica para análise de tamanho e rastreamento de nanopartículas para distribuição de tamanho econcentração 18.

4. Caracterização de EV enriquecido com exossomos por western blot

  1. Determine a concentração proteica do EV enriquecido com exossomos usando ensaios como BCA.
  2. Misture volumes iguais de solução EV enriquecida com exossomos e buffer RIPA e adicione 4x buffer de carga LDS (4:1).
  3. Separe proteínas EV enriquecidas com exossomos usando um gel Bis-Tris de 4-12%.
  4. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose.
  5. Bloqueie por 1 h usando leite desnatado 5% dissolvido em 1x tampão TBS-Tween em temperatura ambiente.
  6. Dilua os anticorpos primários usando leite seco desnatado 5% até uma diluição 1:1.1000 e sonde a membrana em busca de proteínas exossomas como CD63 e CD9 a 4 °C durante a noite.
  7. Remova o anticorpo primário e lave 5 x 5 minutos com 1x TBS-Tween buffer em um balanço.
  8. Dilua o anticorpo secundário (anti-IgG HRP de Coelho) com leite seco desnatado até uma diluição 1:5.000 e incube a membrana com essa solução por 1 hora em temperatura ambiente.
  9. Remova o anticorpo secundário e lave 5 x 5 minutos com 1x TBS-Tween buffer em um balanço.
  10. Desenvolva a membrana usando o reagente de detecção ECL e detecte sinais proteicos usando o dispositivo de imagem quimioluminescência.

5. Caracterização de EVs enriquecidos com exossomos por microscopia eletrônica de transmissão

  1. Adicione 5 μL de amostras de exossomos às 200 malhas de cobre com revestimento de formvar e carbono e deixe secar ao ar em temperatura ambiente.
  2. Tinga a grade com acetato de uranil aquoso a 1% por 60 s e seque ao ar.
  3. Capture a imagem usando o TEM a 80 kV18.

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Resultados

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Analisamos o EV isolado enriquecido com exossomos conforme descrito no protocolo, usando um ensaio de placas para determinar se poderíamos detectar partículas ativas de DENV-2 na mistura. Como mostrado na Figura 1, nenhuma placa foi detectada nas condições testadas em comparação com o controle positivo. Esses resultados indicam que o vírus infeccioso estava abaixo do limiar de detecção do ensaio de placas. O ensaio de placa f...

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Discussão

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Avanços recentes na pesquisa em doenças infecciosas mostraram que EVs enriquecidos com exossomos liberados de células ingênuas infectadas por vírus desempenham um papel fundamental na modulação da resposta imune dohospedeiro 7,8,9. Os EVs enriquecidos com exossomos podem tanto aumentar a defesa imune promovendo uma resposta antiviral adequada quanto, inversamente, facilitar a evasão imune viral ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da American Society for Clinical Laboratory Science (ASCLS) e pelo fundo do Programa de Aprimoramento em Pesquisa (REP) da Texas State University

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo Anti Rabbit ligado a IgG-HRPSinalização de Celular7074SAnticorpo secundário
CD63Sinalização de Celular52090SAnticorpo primário
CD9Sinalização de Celular13174SAnticorpo primário
Kit de purificação de exossomos em meio de cultura celularNorgen60600Kit de purificação de exossomos
Vírus da dengue 2ATCCVR-1584Vírus
DMEMFisher científica11-995-073Mídia cultural
EMEMATCC30-2003Mídia cultural
Microscópio eletrônico de transmissão FEI Talos F200XThermofisher Scientific
Ero Bovino FetalNeurômicaFBS002Suplemento de Mídia
Analisador de rastreamento de partículas nanoMetrix de partículas
Células VeroATCCCCL-81Linha celular de mamíferos

Referências

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  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

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