Desenho experimental e preparação de enredos
O experimento foi realizado em julho e início de agosto de 2023 e 2024. Normalmente, a temporada de cultivo da soja em Ohio ocorre aproximadamente de abril a novembro. Os locais utilizados durante a temporada de crescimento de 2023 estavam localizados no Condado de Clinton (39.488, -83.769) e no Condado de Union (40.296, -83.283), Ohio. Os locais utilizados durante a temporada de cultivo de 2024 estavam localizados no Condado de Clinton (39.489, -83.762), Condado de Preble (39.893, -84.611) e Condado de Licking (39.948, -82.501), Ohio.
O experimento utilizou um design randomizado de blocos completos para controlar os efeitos espaciais dentro do campo de soja. Dentro de cada bloco, 5 parcelas foram designadas para um tratamento específico. Os tratamentos incluíram dois estágios de crescimento (R3 e R5) e dois horários de aplicação (meio da manhã e meio-dia), além de um controle não tratado. Isso resultou nas seguintes 4 aplicações de pesticidas em parcelas dentro de cada bloco: R3 no meio da manhã, R3 no meio do dia, R5 no meio da manhã, R5 no meio-dia. As inscrições durante o meio da manhã ou meio-dia ocorreram dentro de uma janela de ~2 horas, com aplicações no meio da manhã aproximadamente centradas em torno das 10:00 da manhã e nas aplicações do meio-dia aproximadamente em torno das 12:30. Além dos 5 lotes de tratamento em cada bloco, 3 foram designados como sobressalentes que poderiam ser transferidos para os lotes de tratamento em caso de estabelecimento ou crescimento ruim da soja. Os estágios das plantas de soja foram determinados com a ajuda de guias de estafeta, como o publicado pela Extensão39 da Universidade de Minnesota.
Blocos de parcelas de soja foram espaçados cerca de 1,016 m (40 pol) para permitir que os pesquisadores caminhassem facilmente entre eles. As parcelas de soja tinham 1,9 m por 8,5 m (0,0016 ha; 6,25 pés por 28 pés), e a variedade de soja usada para todos os locais era a Pioneer P35T155E (Corteva, Indianápolis, IN). 6 fileiras foram plantadas em cada parcela e espaçadas 38 cm (15 pol) entre si. Foi utilizada uma taxa de semeadura de 370.658 sementes por ha (150.000 sementes por acre). As abelhas envolvidas no experimento eram todas de populações locais. Nenhuma abelha suplementar foi adicionada por pesquisadores. Os autores não tinham conhecimento nem de apiários estacionários nem migratórios próximos aos locais experimentais. Todos os materiais usados para o experimento estão listados na Tabela de Materiais.
Preparação de pesticidas
Os pesticidas utilizados foram o fungicida Fitness (ingrediente ativo de propiconazol de 41,8%) e o inseticida Fastac EC (ingrediente ativo alfa-cipermetrina de 10,9%). As taxas de aplicação do pesticida foram de 6 fl oz/ac (438,47 mL/ha) para o fungicida SBI e 3,8 fl oz/ac (277,70 mL/ha) para o inseticida piretroide. Para preparar os pesticidas para aplicação, 9,375 mL de fungicida SBI e 5,937 mL de inseticida piretroide foram misturados com água para obter um volume final de 3 L como mistura do tanque. Luvas resistentes a produtos químicos eram usadas durante a preparação da mistura. A concentração final de fungicida SBI no aquário foi de 3,125 mL por L. A concentração final de inseticida piretroide no aquário foi de 1,979 mL por L.
Aplicação de pesticidas
Essa mistura foi aplicada em parcelas individuais de soja dentro de cada bloco usando um pulverizador portátil personalizado para mochila. A mistura de pesticidas foi aplicada no topo da copa da soja, a uma velocidade de ~5 km por hora. Após iniciar o processo de aplicação do pesticida para um determinado tratamento, levava ~10 minutos para que todos os lotes recebessem a aplicação. Para cada tanque de 3 L, uma área de ~0,027 ha pode ser coberta com a mistura de pesticidas. O volume de pulverização consumido por hectare é de aproximadamente 113 L. Isso significa que ~0,18 L da mistura do tanque foi aplicada por parcela. Para evitar a deriva do pesticida para outras parcelas causada pelo vento, as aplicações foram evitadas em dias de vento. Equipamento completo de proteção individual (camisa de manga longa e calça comprida, luvas resistentes a produtos químicos, sapatos e meias, e óculos de proteção) foi usado durante a aplicação do pesticida. Se houvesse excesso de mistura de pesticidas após a conclusão da aplicação do pesticida, ela era descartada conforme recomendações da agência estadual de controle ambiental.
Configuração/uso do gravador
A configuração geral e o uso dos gravadores de áudio são semelhantes a um protocolo descrito por outrosautores 40. Gravadores de áudio portáteis (Sony ICD-PX370) eram fixados a estacas plásticas de cerca elétrica com fita de encaixe, e espuma de célula aberta era colocada sobre o microfone como para-brisa. Uma capa de chuva impressa em formato de cone e 3D foi fixada na estaca ~3 cm acima do gravador para protegê-la do clima.
Gravadores de áudio eram então colocados no centro de cada parcela ~24 horas antes da primeira aplicação de pesticida e deixados funcionando por pelo menos 24 horas após cada aplicação. Doze gravadores foram implantados para cada dia de aplicação, quatro para cada grupo de horário do dia (meio da manhã, meio-dia, controle) tanto em R3 quanto em R5.
Processamento de dados de áudio
Todas as gravações de áudio foram processadas pela ferramenta de aprendizado de máquina "buzzdetect"41 , que pode ser encontrada em: https://github.com/OSU-Bee-Lab/buzzdetect. Essa ferramenta foi treinada para distinguir ruídos de zumbido de insetos de outros sons que ocorrem frequentemente em ambientes experimentais, como carros, colheitadeiras ou aviões. O programa não é capaz de distinguir o zumbido de Apis mellifera de outras espécies de abelhas. No entanto, o buzzDetect é capaz de distinguir ruídos de zumbido de alguns outros sons de insetos que não são zumbidos, embora ruídos específicos (como chamados de grilos, principalmente durante a noite) ainda sejam difíceis de distinguir. Instruções mais específicas sobre como rodar o buzzDetect podem ser encontradas em: https://buzzdetect.readthedocs.io/en/latest/gui/. Após análise de áudio, R42 foi usado para calcular a taxa de detecção em intervalos de 1 hora e 8 horas.
Dados de desfolhação
Avaliações de desfolhação foram realizadas avaliando visualmente as folhas da copa superior da soja em 10 plantas de cada parcela envolvida no experimento, incluindo todos os tratamentos e parcelas controle não tratadas, conforme recomendado pela Extensão43 da Universidade de Nebraska. Essas avaliações foram realizadas 24 horas após a aplicação do pesticida durante a fase de crescimento R5.
Dados de rendimento
A soja era colhida e o rendimento era medido em bushels por acre usando uma colheitadeira de parcelas e um sistema de pesagem de grãos. As medições de rendimento foram ajustadas para 13% de umidade. Os plots tinham 6 fileiras cada; apenas as 4 fileiras centrais foram colhidas para medições de produtividade.
Análise estatística
Todas as estatísticas foram realizadas em R42. Os dados foram analisados com modelos lineares de efeitos mistos via o pacotelme4 44 ou regressão beta via o pacoteglmmTMB 45. Os dados brutos do BuzzDetect estão disponíveis nos materiais suplementares. Três tipos principais de dados foram analisados para este estudo. Dados médios de atividade das abelhas ao longo de 1 e 8 horas após a aplicação de pesticida, o rendimento de cada parcela de soja e a desfolhação observada no estágio de crescimento R5.
A atividade média das abelhas foi obtida calculando a proporção de tempo positivo para o zumbido das abelhas em uma janela de 8 ou 1 hora. A janela de 1 hora tem como objetivo estimar os efeitos agudos da aplicação de pesticidas na atividade das abelhas, enquanto a janela de 8 horas visa estimar os efeitos agudos e residuais. Dados de toxicidade residual não estão disponíveis para alfa-cipermetrina, mas a toxicidade residual para outros piretroides foi relatada como ~8 h após a aplicaçãoinicial 46. Como o cálculo da atividade das abelhas é uma proporção, as diferenças de atividade foram analisadas usando regressão beta realizada com o pacote R "glmmTMB". Os modelos examinaram as taxas médias de detecção para 1 ou 8 horas após a aplicação do pesticida e como variaram ao comparar parcelas tratadas com as de controle (a condição "pulverizada"), estágio de crescimento da soja, horário do dia em que o pesticida foi aplicado ou um estágio de crescimento e um período de interação do dia. A comparação entre os gráficos tratados e de controle é referenciada pela variável "pulverizada" tanto nas fórmulas do modelo de 1 hora quanto nas de 8 horas.
No modelo de janela de 1 hora, os efeitos fixos foram a condição de "pulverização", estágio de crescimento, horário do dia e um estágio de crescimento e um termo de interação no horário do dia. O modelo teve tanto um ano quanto um ano por local termos de interação ajustados como efeitos aleatórios. A fórmula completa do modelo era:
(1)
A taxa variável de detecção reflete a média de detecções de abelhas observadas em relação à janela total de observação — neste caso, 1 hora. A variável pulverizada corresponde a se um lote recebeu aplicação de pesticida ou se era um grupo controle não tratado. A variável time_of_day corresponde ao fato de as detecções terem sido capturadas após a aplicação de pesticidas no meio da manhã ou no meio do dia pelo período desejado. O estágio variável corresponde ao estágio de crescimento em que as detecções foram capturadas.
No modelo janela de 8 horas, os efeitos fixos eram o estágio de crescimento e a condição "pulverizada". O modelo de 8 horas inclui horários noturnos para o horário de pulverização do meio-dia, o que resulta em uma comparação injusta entre os horários de pulverização do meio da manhã e do meio-dia. Isso ocorre porque os horários de aplicação ao meio-dia não testam as 8 horas completas de toxicidade residual devido à inatividade das abelhas durante a noite, uma grande parte dessas janelas de 8 horas. Portanto, as aplicações do meio-dia foram excluídas do modelo, assim como os termos "hora do dia" e "hora do dia:estágio". A fórmula completa para esse modelo era:
(2)
As variáveis taxa de detecção, pulverização e estágio têm os mesmos significados nessa fórmula que na fórmula usada para as janelas de 1 hora. A única diferença é que a taxa variável de detecção é calculada para uma janela de 8 horas. Os dados de rendimento foram analisados com um modelo linear de efeitos mistos. O modelo analisou os bushels por acre de cada parcela e como o rendimento variava conforme o tratamento. O efeito fixo no modelo era o tratamento, e o local e o ano foram ajustados como efeitos aleatórios. A fórmula completa do modelo é escrita como:
(3)
A desfolhação das folhas da soja foi medida como a porcentagem média de área superficial ausente por parcela. Um modelo linear de efeitos mistos foi usado para comparar o efeito do horário do dia da aplicação do pesticida na porcentagem de desfolhação. O efeito fixo no modelo era o horário do dia em que os plots eram pulverizados. O local e o ano foram ajustados como efeitos aleatórios. A fórmula completa do modelo é:
(4)
Todos os protocolos utilizados neste estudo estão compilados no Arquivo Suplementar 1.