Artigo de método

Protocolo para Dissociação de Célula Única, Sequenciamento de RNA e Isolamento de Células Mioepiteliais e Fibroblastos das Glândulas Lagrimais e Salivares Envelhecidas

DOI:

10.3791/70441

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24 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método otimizado para dissociar glândulas lacrimais de camundongos envelhecidos para obter células individuais viáveis para sequenciamento de RNA unicelular. Digestão enzimática sequencial e manuseio suave preservam a integridade celular, resultando em suspensões de alta qualidade adequadas para isolamento específico por tipo celular e análise transcriptômica de alterações associadas ao envelhecimento nas populações de glândulas lacrimais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O envelhecimento da glândula lacrimal (LG) está associado à redução da secreção lacrimal e inflamação crônica, contribuindo para a doença do olho seco. Alterações relacionadas à idade da LG incluem infiltração de células imunológicas, danos celulares, acúmulo de lipídios em células acinares, deposição de matriz extracelular e dilatação ductal. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) oferece uma abordagem poderosa para a heterogeneidade celular do perfil e alterações transcricionais durante o envelhecimento; no entanto, gerar suspensões viáveis de célula única a partir de tecido LG envelhecido é tecnicamente desafiador devido ao aumento da fibrose, fragilidade celular e acúmulo de lipídios. Este estudo apresenta um protocolo otimizado e reprodutível para a dissociação eficiente de LGs de camundongos envelhecidos e o isolamento de múltiplos tipos celulares, adequado para análise posterior de scRNA-seq. Importante destacar que este protocolo também é aplicável a glândulas lacrimais jovens, conjuntivas e outros tecidos exocrinos. O fluxo de trabalho emprega uma estratégia de dissociação enzimática passo a passo usando Colanase IV, Dispase II e DNase I para a digestão inicial do tecido, seguida por Accutase para dissociar os aglomerados celulares restantes e um tratamento final com DNase I para obter uma suspensão unicelular limpa. Para minimizar o dano celular, todo o material plástico é pré-revestido com PBS contendo albumina sérica bovina, e o processamento do tecido é realizado sob condições controladas de temperatura e agitação. A lise dos glóbulos vermelhos e a filtração sequencial através de vários peneiros aumentam ainda mais a pureza celular. O isolamento específico por tipo celular é alcançado usando linhas de camundongos repórteres combinadas com separação celular ativada por fluorescência (FACS). Usando camundongosActa2 GFP e PdgfraEGFP, isolamos com sucesso células mioepiteliais e fibroblastos, respectivamente, após imunocoloração com um anticorpo EpCAM. O FACS permitiu a separação da população mioepitelial EpCAM⁺/αSMA⁺, enquanto células de EGFP⁺ de camundongos PdgfraEGFPrepresentavam a população de fibroblastos. Esse protocolo proporciona suspensões unicelulares viáveis e de alta qualidade de LGs envelhecidos e pode ser facilmente adaptado a outros tecidos fibróticos ou exócrinos envelhecidos, que exigem dissociação suave e isolamento celular direcionado.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A glândula lacrimal (LG) é uma glândula tubuloacinar exocrina responsável por secretar a camada aquosa do filme lacrimal. Ao longo da vida, a superfície corneal e a LG são expostas a infecções bacterianas e virais, que podem levar à perturbação sistêmica das células epiteliais, indução de respostas inflamatórias crônicas, infiltração de células imunes na LG e falta de regeneração. O envelhecimento é acompanhado por um aumento da incidência de doenças inflamatóriascrônicas 1. Entre elas, a doença do olho seco (DED) é uma das dez causas mais comuns de deficiência visual no mundo e é um dos principais fatores para a diminuição da independência, mobilidade e funcionamento diário na populaçãoidosa 2. Uma das principais causas da DED é a disfunção LG3.

Com o avanço da idade, o LG de camundongos e humanos sofre alterações estruturais e funcionais pronunciadas, incluindo atrofia das células acinares, dilatação ductal, infiltração de células imunes, fibrose e deposiçãolipídica 4,5,6,7. Essas alterações degenerativas também são acompanhadas por inflamação crônica do LG e fibrosetecidual 3,5,8,9. Apesar da clara associação entre envelhecimento e patologia do LG, os mecanismos moleculares e celulares que impulsionam essas mudanças continuam pouco compreendidos.

O sequenciamento de RNA unicelular permite um perfil abrangente das populações celulares e suas mudanças transcricionais duranteo envelhecimento de 10 anos. Essa abordagem permite a identificação imparcial de tipos e estados celulares distintos dentro da glândula lacrimal, revelando como o envelhecimento altera perfis de expressão gênica, infiltração de células imunes e interações epitelial-mesenquimal.

Atualmente, diversos métodos de dissociação tecidular estão disponíveis, incluindo métodos mecânicos de dissociação11 e protocolos envolvendo digestão enzimática quente a 37 °C com enzimas como Colaganose, Dispase ouTripsina 12. Diversas estratégias de dissociação foram descritas para uma ampla variedade de tecidos, incluindo fígado, pulmão, rim, coração e múltiplos tipostumorais 13,14,15. No entanto, preparar suspensões viáveis de célula única a partir de tecido envelhecido das glândulas lacrimais permanece tecnicamente desafiador devido ao aumento da fibrose e fragilidade celular. Além disso, como já relatamos anteriormente, a recuperação de células acinares frágeis pode ser desafiadora, pois mudanças associadas à dissociação na permeabilidade da membrana podem aumentar a liberação de RNA ambiente dessas grandes células secretoras, contribuindo para o sinal de fundo em conjuntos de dados unicelularesposteriores 16. Embora vários estudos tenham relatado atlas scRNA-seq de glândulas lacrimais envelhecidas, a qualidade desses conjuntos de dados tem sido limitada por métodos de dissociação subótimos, resultando em menor rendimento de células epiteliais do que de populações estromalas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado e otimizado para a dissociação eficiente de LG de camundongos envelhecidos e o isolamento de populações celulares distintas para análises posteriores de scRNA-seq e RNA-seq em massa (Figura 1). Essa abordagem fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à disfunção das glândulas lacrimais relacionadas à idade.

O protocolo permite a geração de suspensões unicelulares viáveis e de alta qualidade a partir de glândulas lacrimais envelhecidas, fornecendo uma base confiável para análises transcriptômicas abrangentes. Ele permite a identificação detalhada e caracterização molecular de diversas populações celulares, incluindo células mioepiteliais, fibroblastos e outros tipos celulares epiteliais e estromais que passam por alterações relacionadas à idade. O fluxo de trabalho otimizado preserva a integridade celular e minimiza artefatos transcricionais induzidos pelo estresse, garantindo representação precisa dos estados celulares in vivo. Além disso, a metodologia é amplamente aplicável e pode ser adaptada a outras glândulas exocrinas ou tecidos fibróticos, onde a dissociação suave do tecido e o isolamento preciso de populações celulares distintas são críticas para estudos posteriores de células únicas.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC) do Scripps Research Institute (protocolo nº 08-0123; aprovado em 29 de agosto de 2023). O cuidado animal no The Scripps Research Institute é credenciado pela Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, International (AAALAC). Os camundongos foram mantidos sob um ciclo padrão de 12 h de luz/12 h de escuridão, com alimento e água fornecidos ad libitum. As linhas transgênicas de camundongos Pdgfra EGFP e Acta2 GFP foram usadas para experimentos. As informações detalhadas sobre linhagens de camundongos estão fornecidas na seção "Tabela de materiais".

1. Considerações gerais

  1. Siga as Precauções Universais17 do NIH ao manusear materiais bio-perigosos e tecidos animais. Realize todo o trabalho com animais de acordo com os protocolos aprovados da IACUC e os Níveis Designados de Biossegurança Animal.
  2. Siga as práticas padrão de segurança laboratoriais evitando pipetear pela boca, minimizando o uso de objetos cortantes, utilizando um armário de segurança biológica para procedimentos geradores de aerossols, usando EPI adequado, descartando objetos cortantes em recipientes resistentes a perfurações e rotulando e descontaminando corretamente todos os resíduos bio-perigosos antes do descarte.
  3. Descontamine rotineiramente superfícies de trabalho e equipamentos usando desinfetantes apropriados (por exemplo, 10% de água sanitária).
  4. Realize todas as etapas da centrifugação a 4 °C em uma centrífuga refrigerada pré-resfriada para preservar a viabilidade da célula e minimizar o estresse induzido pela temperatura.
  5. Otimize as configurações do citômetro de fluxo e do classificador celular para a configuração específica do instrumento e ajuste os parâmetros para cada conjugado anticorpo-fluoróforo usando amostras de controle apropriadas. Use o mesmo citômetro e instrumento de triagem, com configurações fixas e otimizadas, ao longo de uma série experimental para minimizar a variabilidade.
  6. Prepare as soluções selecionadas com até um dia de antecedência e armazene adequadamente até o uso. Prepare todas as soluções em condições estéreis em um armário de biossegurança.
  7. Mantenha as soluções contendo Ca2+/Mg 2+ separadas dos tampões contendo EDTA para evitar quelação durante as etapas enzimáticas. Todos os reagentes necessários para esse procedimento estão apresentados na Tabela de Materiais.

2. Louça plástica

  1. Em condições estéreis, faça panelas, tubos e seringas com 1x PBS + 1% de BSA por 1 hora em temperatura ambiente (RT). Aspire e mantenha tudo estéril até o uso.
  2. Pontas de pipeta pré-revestimento. Aspire e dispense 1x PBS + 1% de BSA três vezes com cada ponta para revestir a superfície interna. Coloque as pontas revestidas de volta na caixa da ponta estéril e deixe-as secar durante a noite em uma incubadora estéril. Use essas pontas pré-revestidas no dia seguinte durante o procedimento de isolamento celular.

3. Soluções e buffers

  1. DNase I Estoque (5 mg/mL)
    1. Prepare 150 mM de NaCl do estoque 5M NaCl e filtre a solução com filtro estéril.
    2. Adicione 1 M CaCl₂ à solução filtrada de 150 mM de NaCl para obter uma concentração final de 5 mM de CaCl₂.
    3. Resuspenda 100 mg de DNase I em 20 ml de tampão de 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ para obter uma solução de estoque de 5 mg/mL de DNase I.
    4. Prepare alíquotas de 500 μL e armazene-as a −20 °C por até 6 meses. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento para evitar a perda da atividade enzimática.
  2. Meio digestivo
    1. No dia anterior ao experimento, prepare a mistura base do meio misturando DMEM/F12 com 0,5% de BSA e filtre-a.
    2. Adicione 1M HEPES e 1M CaCl₂ ao meio base DMEM/F12 / 0,5% BSA para obter concentrações finais de 15 mM e 3 mM, respectivamente.
    3. Adicione todas as enzimas seguintes logo antes do uso: Colagenase IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) e DNase I (20 U/mL; 0,05 mg/mL do estoque de 5 mg/mL).
  3. Meio Bloqueador 1 (BM1)
    1. Adicione 1M HEPES e 0,5M EDTA a 1x HBSS para obter concentrações finais de 15 mM e 3 mM, respectivamente.
  4. Meio Bloqueador 2 (BM2)
    1. Adicione FBS e 1M HEPES ao DMEM/F12 para obter concentrações finais de 10% e 15 mM, respectivamente.
  5. Meio para tratamento com DNase
    1. No dia anterior ao experimento, prepare o meio base misturando 1x HBSS com 0,5% de BSA e filtre-o.
    2. Adicione 1M HEPES, 1M CaCl₂ e 1M MgCl₂ ao meio base 1x HBSS / 0,5% BSA para obter concentrações finais de 10 mM, 1,5 mM e 2 mM, respectivamente.
    3. Logo antes do uso, adicione DNase I (200 U/mL; 0,5 mg/mL do estoque de 5 mg/mL) à mistura preparada.
  6. Meio Bloqueador 3 (BM3)
    1. Use o mesmo meio base filtrado 1x HBSS / 0,5% BSA e adicione 1M HEPES e 0,5M EDTA para obter concentrações finais de 10 mM e 1 mM, respectivamente.
  7. Bloqueio Médio 4 (BM4)
    1. Use o mesmo meio base filtrado 1x HBSS / 0,5% BSA e adicione 1M HEPES para obter concentrações finais de 10 mM.
  8. FACS Buffer
    1. No dia anterior ao experimento, prepare o meio base misturando 1x DPBS com 0,5% de BSA e filtre-o.
    2. Adicione 1M HEPES e 0,5M EDTA a 1x DPBS / 0,5% BSA para obter concentrações finais de 25 mM e 1 mM, respectivamente.
  9. Meio para scRNAseq (MSC)
    1. No dia anterior ao experimento, prepare o meio misturando 1x DPBS com 0,4% de BSA e filtre.

4. Colheita de tecidos e microdissecação (~ 40 - 50 min)

  1. Anestesiar o camundongo com isoflurano e eutanasiar por luxação cervical de acordo com as diretrizes institucionais da IACUC.
  2. Use pinças finas e tesouras para incisar a pele entre o olho e a orelha e retrai-a suavemente para expor a glândula lacrimal.
  3. Para isolar a glândula, levante-a levemente usando uma pinça de ponta cega e separe cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor, removendo-o suavemente em um movimento circular. Os limites da glândula lacrimal são claramente visíveis, permitindo fácil separação dos tecidos adjacentes, incluindo a glândula parótida.
  4. Transfira a glândula lacrimal (cada glândula pesando aproximadamente 10-25 mg, dependendo do peso do camundongo, sexo e idade) para uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 mL de PBS frio 1x sobre gelo. Sob um microscópio dissecante, remova a gordura restante e cuidadosamente retire a cápsula do tecido conjuntivo usando duas pinças.
  5. Confirme a marcação celular examinando um pequeno fragmento de tecido sob um microscópio de fluorescência e verificando o sinal de repórter ou fluorescente esperado antes de prosseguir para a digestão enzimática.
  6. Coloque uma placa de Petri estéril de 35 mm sobre gelo e adicione 800-1000 μL de PBS frio 1x (volume ajustado pelo tamanho da glândula) ao centro da placa. Transfira uma glândula lacrimal para o PBS 1x.
  7. Usando dois bisturis estéreis, triture a glândula em pequenos fragmentos até que ela atinja uma consistência macia e pastosa. Certifique-se de que os fragmentos de tecido permaneçam submersos em PBS durante todo o processo de trituração, mas não permita que flutuem livremente pelo recipiente.
  8. Colete fragmentos de tecido em um dos lados do recipiente, aspire PBS residual e lave os fragmentos com 1 mL de PBS fresco frio.
  9. Transfira fragmentos de tecido lavados para uma placa de 6 poços contendo 2 mL por poço de meio digestivo pré-aquecido. Mantenha a placa no gelo até que todas as amostras sejam processadas.

5. Primeira digestão enzimática (~1,5 - 2 h)

  1. Incube a placa em banho-maria agitada a 37 °C, 60 rpm por 30 minutos.
  2. Triture suavemente o tecido 15 vezes usando uma ponta de 1 mL de grande calibre, depois volte a placa ao banho-maria agitada a 37 °C, 60 rpm, por mais 30 minutos.
  3. Triture suavemente a amostra 10 vezes usando uma ponta comum de 1 mL, depois retorne a placa ao banho-maria agitada a 37 °C, 60 rpm, por mais 30 minutos.
  4. Triture suavemente a amostra 10 vezes e transfira a suspensão celular para tubos microcentrífugas Dolphin de 2 mL.
  5. Adicione 1 mL de BM1 frio a cada poço da placa para coletar o meio digestivo restante contendo células residuais. Coloque a placa sobre gelo até a próxima etapa.
    NOTA: Se grandes aglomerados celulares ou fragmentos de tecido ainda forem observados nesta fase, estenda cada etapa de incubação por mais 10 a 20 minutos. Não exceda o número indicado de passagens de trituração (máximo 10-15 passagens suaves), pois estresse mecânico adicional comprometerá a viabilidade celular.

6. Término da atividade enzimática e lavagens primárias (~ 15 min)

  1. Centrifuge os tubos contendo a suspensão da célula a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
  2. Descarte o sobrenadante. Transfira o BM1 de cada poço da placa inicial (contendo células residuais) para o tubo correspondente e ressuspenda suavemente os pellets das células.
  3. Enxágue cada poço com mais 600 μL de BM1 frio e combine a lavagem com o tubo correspondente para coletar todas as células restantes.
  4. Suspenda suavemente a suspensão da célula, centrifuge novamente a 300 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.

7. Tratamento com Accutase e DNase (~ 30 - 35 min)

  1. Adicione 1 mL de Accutase aos pellets celulares e ressuspenda suavemente. Incube o tubo por apenas 5-10 minutos a 37 °C e 60 rpm.
    NOTA: Coloque o tubo de lado durante a incubação para evitar que as células se assentem e grudem no fundo.
  2. Triture suavemente 10 vezes usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
  3. Adicione 1 mL de BM2 frio para encerrar a reação enzimática diluindo a Accutase.
  4. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  5. Resuspenda as células no meio para o tratamento com DNase, enchendo o tubo até o topo.
  6. Incube por 10 minutos na RT, resuspendendo suavemente uma vez após 5 minutos.
  7. Enquanto isso, pré-umedece um filtro de célula de 70 μm com 1 mL de BM3 colocado sobre um tubo cônico de 15 mL.
  8. Transfira a suspensão da célula para o filtro de pressão.
  9. Enxágue o tubo de coleta original com 1 mL de BM3 e transfira o enxágue para a mesma peneira.
  10. Lave o peneiro com mais 5 mL de BM3.

8. Contagem de células e verificação de viabilidade

  1. Retire 10 μL da suspensão de células filtradas em BM3 e misture com 10 μL de Azul de Tripano. Determine a concentração e viabilidade da célula usando exclusão do Azul de Tripano e quantifique por contagem manual ou contador automático de células (por exemplo, contador automático de células Countess 3). Prossiga além somente se a viabilidade atingir o limiar exigido para aplicações posteriores (tipicamente ≥70-80%).
    NOTA: Considere o volume total ~7-9 mL atualmente no tubo de 15 mL ao calcular o escoamento.
  2. Prossiga conforme a aplicação a jusante. Para scRNA-seq, continue para a Seção 9. Para a separação celular baseada em citometria de fluxo, continue para a Seção 10.
    NOTA: O fluxo de trabalho scRNA-seq inclui lise de glóbulos vermelhos e remoção magnética de células mortas para reduzir detritos e RNA ambiente e melhorar a qualidade dos dados. No entanto, essas etapas podem viesar a representação do tipo celular ao afetar preferencialmente populações epiteliais frágeis ou raras, incluindo células acinares. Para a classificação baseada em citometria de fluxo, essas etapas foram omitidas para maximizar a recuperação e preservar os epítopos da superfície celular. A seleção do fluxo de trabalho deve, portanto, ser guiada por objetivos experimentais, priorizando a qualidade dos dados para a recuperação de scRNA-seq ou célula e a viabilidade para ordenação e aplicações posteriores.

9. Preparação de células para scRNA-seq (~ 1 - 1,5 h)

  1. Prepare uma solução de 1x RBC reconstituindo a solução 10x com água miliQ.
  2. Centrifuge o tubo de 15 mL contendo a suspensão da célula a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de 1x tampão de glóbulos vermelhos e incube por 5 minutos na RT.
  4. Centrifuge novamente a 300 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  5. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de BM4 frio.
  6. Retire 10 μL da suspensão celular filtrada em BM4 e misture com 10 μL de Azul de Tripano para avaliar a concentração e viabilidade celular.
  7. Pré-umeda o filtro MACS 30 μm com 1 mL 1x HBSS e filtre a suspensão da célula através do filtro até um tubo de 15 mL.
  8. Enxágue o tubo de coleta anterior com 2 mL de BM4 frio e passe a lavagem pelo mesmo coador até o tubo de 15 mL.
  9. Lave a peneira com mais 10 mL de BM4 frio.
  10. Centrifuge o tubo de 15 mL a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e remova completamente o sobrenadante.
  11. Resuspenda suavemente o pellet em 100 μL de microesferas MACS e incube por 15 minutos em RT.
  12. Enquanto isso, prepare 1x Binding Buffer (BB) do Kit de Remoção de Células Mortas usando água estéril dupla destilada.
  13. Lave uma coluna de MS MACS com 500 μL 1x BB para equilibrar.
  14. Adicione 400 μL de BB à amostra, ressuspenda as células com microesferas e aplique todo o volume na coluna de MS equilibrada. Colete o fluxo em um tubo de 15 mL.
  15. Lave a coluna quatro vezes com 500 μL BB cada, coletando todas as frações de fluxo contínuo.
  16. Centrifuge o fluxo coletado a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  17. Resuspenda as células em 400 μL de buffer MSC e transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL.
  18. Enxágue o tubo anterior com tampão MSC de 700 μL e agrupe o enxágue com a amostra.
  19. Centrifuge a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  20. Resuspenda o pellet da célula no buffer MSC usando uma ponta de grande cilindrada até um volume final de cerca de 1,5 mL.
  21. Centrifuge novamente a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  22. Deixe ~100 μL de sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet e conte novamente as células misturando células de 6 μL com 6 μL de Trippan Blue.
  23. Ajuste o volume final com o tampão MSC para alcançar 700-1200 células/μL e reconte as células para confirmar a concentração celular.
  24. Garantir que a viabilidade celular após a lise dos glóbulos vermelhos e a remoção de células mortas seja ≥ 70% (tipicamente 70-95%) antes da carga para processamento de cromo 10x (Solução V3 de Célula Única de Cromo 3').
  25. Aplique critérios básicos de controle de qualidade do scRNA-seq: nUMI > 500, nGene > 200 e fração do gene mitocondrial <15%. Use um limiar mitocondrial permissivo (15%) para preservar populações epiteliais com maior atividade metabólica. Inclua apenas células que atendam a todos os critérios de QC em análises posteriores.
    NOTA: Esses limiares de QC representam valores de exemplo derivados de nossos conjuntos de dados (Figura Suplementar 1) e foram relatados em nossa publicaçãoanterior 18.

10. Preparação de células para a separação celular baseada em citometria de fluxo (~ 1 - 1,5 h)

  1. Para o isolamento baseado em citometria de fluxo de MECs e fibroblastos, foram usadas, respectivamente, linhas de camundongos repórteres Pdgfra EGFP e Acta2 GFP para possibilitar a identificação precisa de cada população.
  2. Centrifuge o tubo de 15 mL com suspensão de célula a 400 × g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  3. Resuspenda a célula em buffer FACS frio até uma concentração final de 5 x 10⁵ a 2 x 106 células por 100 μL.
  4. Prepare os controles necessários para compensação de FACS: controle negativo - células não coradas de um camundongo do tipo selvagem, controle de fluorescência de fundo - células não coradas de camundongosActa2 GFP e PdgfraEGFP , controle de uma única coloração - células de um camundongo selvagem coloridas individualmente com cada anticorpo usado no experimento.
    NOTA: Para cada amostra controle, use pelo menos 1 × 10⁵ células ressuspensas em 100 μL de buffer FACS.
  5. Adicione FcBlock (1:100) e incube por 5 minutos no gelo.
  6. Adicione anticorpo monoclonal CD326 (EpCAM)-APC (1:100) ou CD140a (PDGFRα) (1:100). Incube por 45 minutos no gelo, protegido da luz.
  7. Resuspenda suavemente as células a cada 15 minutos durante a incubação dos anticorpos.
  8. Encha cada tubo até o topo com um buffer FACS frio e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
  9. Prepare a solução de trabalho FxCycle (1:1000) no buffer FACS.
  10. Resuspenda as amostras em 1 mL e controle em 500 μL de buffer FACS frio com FxCycle.
  11. Transfira todas as amostras para tubos FACS e mantenha-as no gelo, protegidas da luz.
  12. Prossiga imediatamente para o Núcleo de Citometria de Fluxo para a separação. Colete as células separadas em buffer FACS, meio de cultura, buffer de lise ou RNAlater, dependendo das aplicações posteriores.
    NOTA: Configurações do instrumento (por exemplo, tamanho e pressão do bico) e taxas de eventos dependem da configuração do classificador e da população de células-alvo; portanto, recomenda-se uma execução piloto preliminar para determinar parâmetros ideais para cada experimento.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glândulas exocrinas envelhecidas dissociativas é desafiadora devido ao acúmulo de lipídios e à extensa deposição de MEE. Glândulas envelhecidas apresentam infiltração linfocítica marcada e dilatação ductal pronunciada com material intraluminal, refletindo as mudanças estruturais e inflamatórias que complicam a dissociação tecidual. A glândula lacrimal é um órgão exocrino composto por três principais tipos celulares epiteliais: células acinar, ducais e mioepiteliais. Células acinares prod...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, otimizamos e avaliamos um protocolo significativamente melhorado para gerar suspensões unicelulares a partir de tecidos exocrinos, focando na glândula lacrimal. Usando essa abordagem, geramos suspensões unicelulares limpas e de alta qualidade tanto de LGs velhos quanto jovens, adequadas para sequenciamento de célula única e outras aplicações posteriores.

Apesar da disponibilidade de numerosos protocolos de dissociação tecidual, foi necessário modificá-l...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado pelo National Institute of Health, pelo National Eye Institute (NEI), EUA, com bolsas 5R01EY026202, R01EY035333; pelas bolsas do National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, e pelo National Cancer Institute (NCI) 5R01CA271500.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  Solução M)BioVisionB1010-100
Colagenase IVSigma-AldrichC5138
Kit de Remoção de Células MortasMiltenyi biotec130-090-101
Kit de Remoção de Células MortasMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNase ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Soro bovino fetal, IgG ultra-baixoGibco# 16250078
Solução Equilibrada de Sal de Hank (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  Solução M)Sigma-AldrichH0887
Solução de isofluranoCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 & micro; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 & micro; m)Miltenyi biotec130-110-916
Médio/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
Colunas MSMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (estoque 5M)Invitrogen & troca;AM9759
Comprimidos de Soro Salino Tamponado de Fosfato (PBS)Sigma-AldrichP8920-500ML
Solução de Lisis de Hemácios (10 vezes)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Solução Trippan Blue, 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
EDTA ultra-puro (0,5M, pH 8,0)Invitrogen15575020
Anticorpos
CD140a (PDGFRA) Anticorpo Monoclonal (APA5), APC-eFluor & trade; 780, Rato / IgG2a, kappaeBiociência47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (bloqueador de Fc CD16/CD32)BD em Biociências 553141; RRID:AB_394656
FxCycle & trade; Mancha de VioletaThermo Fisher ScientificF10347
Anticorpo monoclonal de rato CD326 (EpCAM)-APC (G8.8), IgG2a de rato, kappaeBiociência17-579182; RRID:AB_2716944
ratos
Acta2GFP  Presente gentil do Dr. Ivo KalajzicPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JO laboratório JacksonRRID:IMSR_JAX:007669
Equipamento
Invitrogen & troca;   Condessa e comércio; 3 Contador Automático de CélulasFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

Referências

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Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

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