Síntese, encapsulamento de hemoglobina e PEGilação biortogonal em nanopartículas hierárquicas porosas de UiO-66 para aplicações de entrega de oxigênio

Resumo

Este protocolo detalha a síntese, encapsulamento da hemoglobina e PEGilação superficial de nanopartículas hierarquicamente porosas de UiO-66, projetadas para entrega de oxigênio. O procedimento combina engenharia de defeitos com conjugação biortogonal promovida por tensão para gerar portadores altamente permeáveis e fisiologicamente estáveis, adequados para aplicações biomédicas.

Resumo

Os transportadores de oxigênio à base de hemoglobina (HBOCs) são uma plataforma importante para a entrega de oxigênio a fim de mitigar a hipóxia em vários contextos biomédicos. No entanto, a hemoglobina livre (Hb) é instável e vasoativa fora dos glóbulos vermelhos. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo reproduzível e escalável para fabricar nanopartículas hierarquicamente porosas de UiO-66 (HP-UiO-66 NPs) que encapsulam Hb e são estabilizadas por cascas bioortogonais de polietilenoglicol (PEG). A mesoporosidade hierárquica é introduzida por modulação do ácido dodecanóico e subsequente lavagem ácida, resultando em NPs HP-UiO-66-NH₂ com cristalinidade preservada e isotermas combinadas tipo I/IV_N2 . As aminas de superfície são convertidas em azidas (HP-UiO-66-N₃ NPs), permitindo que a cicloadição de alcino-azida promovida por cepas sem catalisadores (SPAAC) produza NPs Hb@HP-UiO-66-PEG. O fluxo de trabalho compreende: i) engenharia de defeitos dos NPs UiO-66-NH₂, ii) remoção de moduladores, iii) instalação de azida, iv) carga de Hb em meios aquosos bufferizados e v) PEGylação mediada por SPAAC. Parâmetros experimentais críticos, modos padrão de falha e estratégias de solução de problemas são detalhados em cada etapa para aumentar a reprodutibilidade entre laboratórios. O protocolo é compatível com produção em gramas de NPs HP-UiO-66-NH₂ por lote. Eficiências de encapsulamento de ~35% (conteúdo de carga ~24 wt%) para Hb são obtidas sob condições amenas, com NPs redispersíveis com diâmetro hidrodinâmico de ~140 nm e baixa polidispersidade após PEGylação. A caracterização fisicoquímica abrangente verifica a integridade da estrutura, mesoporosidade, química de superfícies bem-sucedida e uma coroa PEG difusa de até ~12 nm de largura. Ensaios funcionais mostram oxigenação/desoxigenação reversível do Hb encapsulado, indicando capacidade de transporte de oxigênio mantida. A PEGylation melhora significativamente a estabilidade coloidal e estrutural em soro, HEPES e soro, prevenindo a degradação induzida por fosfato observada em contrapartes não PEGiladas. Ao integrar orientações detalhadas de solução de problemas, visualização assistida por vídeo de etapas críticas e considerações de escalonamento, esse protocolo modular oferece uma rota robusta e acessível para HBOCs baseados em estruturas metal-orgânicas. A estratégia é facilmente adaptável a outras biomacromoléculas ou enzimas que exigem microambientes protetores, porém acessíveis, para entrega terapêutica.

Introdução

A oxigenação adequada é fundamental para uma terapia eficaz e cicatrização dos tecidos em diversos contextos^{biomédicos 1}. Em traumas e hemorragias cirúrgicas, a perda severa de oxigênio pode ser fatal, destacando a necessidade de substitutos seguros do sangue quando o sangue doado não está disponível². Em oncologia, regiões tumorais hipóxicas limitam a eficácia dos tratamentos dependentes de oxigênio, e a entrega suplementar de oxigênio pode aumentar significativamente a eficácia terapêutica ^3,4,5,6. O oxigênio também desempenha um papel central na cicatrização de feridas, onde o aumento da disponibilidade de oxigênio promove a angiogênese e a reparação^{dos tecidos 7}. De forma semelhante, em condições isquêmicas e transplantes de órgãos, os portadores de oxigênio podem reduzir a lesão hipóxica e melhorar a viabilidade e recuperação dos^{tecidos 8,9}.

Os transportadores sintéticos de oxigênio à base de hemoglobina (Hb) representam uma abordagem promissora para mitigar a^{hipóxia 10}. No entanto, o Hb fora dos glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos) é inerentemente instável e se dissocia rapidamente em dímeros, o que pode causar nefrotoxicidade, danos oxidativos e vasoconstrição devido à absorção de óxido^{nítrico 11}. Para mitigar esses desafios, estratégias de encapsulamento foram desenvolvidas para estabilizar o Hb dentro de nanoportadores biocompatíveis, como^{lipossomos 12}, polimersomos¹³ e nanopartículas poliméricas (NPs^)14,15,16,17. Embora esses sistemas aumentem a estabilidade do Hb, alcançar alta eficiência de encapsulamento enquanto preserva a função nativa de ligação ao oxigênio continua sendo um^{desafio 18}. Além disso, a conversão oxidativa para metahemoglobina e o vazamento de heme pode comprometer o desempenho no transporte de^{oxigênio 19}. A rápida eliminação e o vazamento prematuro de Hb limitam ainda mais o tempo de circulação e a translação clínica²⁰.

Estruturas metal-orgânicas (MOFs) emergiram recentemente como nanoplataformas versáteis para entrega de fármacos e biomacromoléculas devido à sua arquitetura cristalina, grande área superficial e porosidade²¹ sintonizável. Compostos por nós metálicos coordenados com ligadores orgânicos, os MOFs possibilitam difusão molecular e personalização estrutural, tornando-os atraentes para aplicações biomédicas. No entanto, a maioria dos MOFs possui predominantemente cavidades microporosas (<2 nm), que restringem severamente o encapsulamento pós-sintético de macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos ou^enzimas 22,23,24,25. Uma abordagem para superar essa limitação é a mineralização biomimética in situ, onde as biomoléculas atuam como centros de nucleação durante o crescimento do MOF, como demonstrado para ZIF-8 e ZIF-90 26,27,28. Apesar de sua eficácia, essa estratégia requer condições de síntese leves, que restringem a gama de químicas MOF^{compatíveis 29,30}.

UiO-66, um MOF à base de zircônio construído a partir de nós octaédricos_{Zr 6O4}(OH)₄ e ligadores de 1,4-benzenodicarboxilato (BDC), destaca-se por sua excepcional estabilidade química e^{biocompatibilidade 31}. Sua estrutura robusta resiste à decomposição em ambientes aquosos e fisiológicos, tornando-a ideal para aplicações^{biomédicas 32}. No entanto, sua estrutura microporosa intrínseca limita sua utilidade para o encapsulamento de biomacromoléculas. Hb, com dimensão molecular de ~5 nm, não pode ser acomodado nos poros internos do UiO-66 pristino. Correspondentemente, apenas um número limitado de estudos explorou UiO-66 em sistemas relacionados a Hb, nos quais os MOFs são usados principalmente para detecção de Hb baseada em superfície, e não para encapsulamento^{de estruturas 33,34}. Como resultado, plataformas baseadas em UiO-66 para encapsulamento Hb permanecem relativamente subdesenvolvidas.

Muito recentemente, introduzimos um NP hierárquicamente poroso UiO-66 (HP-UiO-66 NP) que supera essa restrição de tamanho de poro incorporando domínios mesoporosos capazes de acomodar Hb, estendendo assim o escopo funcional do UiO-66 para o desenvolvimento^{do HBOC 35}. A porosidade hierárquica é introduzida por meio da engenharia de defeitos, especificamente empregando ácidos monocarboxílicos de cadeia longa, como o ácido dodecanóico (DA), como moduladores durante a^{síntese 36,37}. Esse modulador compete com o ligante BDC pela coordenação com Zr⁴⁺, levando à formação de defeitos e ao aumento dos mesóporos. A remoção subsequente do modulador gera NPs HP-UiO-66 contendo domínios micro- e mesoporosos coexistentes, com tamanho de poro ajustável por concentração do modulador ou comprimento^{da cadeia 36}.

Embora a introdução da mesoporosidade melhore a acessibilidade molecular, ela também pode comprometer a integridade da estrutura em tampões contendo fosfato. Íons fosfato podem se coordenar com os agrupamentos Zr, levando à desintegração estrutural parcial ou^{completa 38,39}. Assim, estratégias de estabilização superficial são essenciais para preservar a estabilidade coloidal e química sob condições^{fisiológicas 40}. Em geral, a estabilização da superfície MOF pode ser alcançada por interações não covalentes (por exemplo, interação de van der Waals e ligações de hidrogênio)⁴¹, interações de coordenação com sítios metálicos^{expostos 42}, ou fixação covalente a ligadores^{orgânicos 43}. Entre os diferentes ligadores, o polietilenoglicol (PEG) é particularmente atraente devido à sua ampla disponibilidade e complexidade sintética^{mínima 44}. Importante destacar que a modificação superficial do PEG, comumente chamada de PEGilação, confere várias propriedades favoráveis para os sistemas de liberação de fármacos, incluindo excelente biocompatibilidade, redução da adsorção de proteínas inespecíficas e redução do reconhecimento imunológico e da absorção^{de macrófagos 45,46}. Coletivamente, esses efeitos reduzem as respostas imunogênicas e prolongam a circulação sistêmica⁴⁷.

Técnicas tradicionais de PEGilação frequentemente dependem da química da carbodiimída ou maleimida, que normalmente requer catalisadores ou intermediários reativos capazes de danificar biomoléculas sensíveis, como o Hb. Para contornar essa limitação, empregamos a cicloadição alquina-azida promovida por tensão (SPAAC), uma reação bioortogonal livre de catalisadores entre espécies funcionalizadas por azida e dibenzilciclooctina (DBCO), possibilitando conjugação específica do local sob condições aquosas^{amenas 35,48}. Essa abordagem garante uma modificação eficiente da superfície sem comprometer a função de Hb encapsulado.

Com base em nossos NPs³⁵ HP-UiO-66 previamente reportados, que focavam em projeto estrutural e validação biofuncional, o protocolo atual enfatiza a transparência metodológica e a reprodutibilidade, fornecendo um fluxo de trabalho experimental detalhado e passo a passo, com faixas de parâmetros definidas e considerações críticas de manuseio. Orientações de solução de problemas estão incluídas para estágios-chave de síntese, encapsulamento de Hb e PEGylação via química SPAAC, resultando em NPs estáveis Hb@HP-UiO-66-PEG (ver Figura 1).

O fluxo de trabalho envolve: (i) engenharia de defeitos usando DA como modulador para sintetizar_NPs HP-UiO-66-NH 2 modificados por aminos; (ii) funcionalização azida de grupos amina de superfície; (iii) encapsulamento de Hb sob condições aquosas e amenas; (iv) conjugação covalente do PEG através do SPAAC.

Para cada etapa principal, esse protocolo identifica desafios experimentais comuns, como agregação de partículas, colapso de poros ou funcionalização ineficiente da superfície, e fornece estratégias práticas de solução de problemas para melhorar a reprodutibilidade entre laboratórios. Importante destacar que este artigo demonstra extensivamente que a síntese dos NPs HP-UiO-66 é facilmente escalável, permitindo uma produção confiável em escala de gramas por lote.

Os nanotransportadores finais PEGilados exibem alta estabilidade coloidal em soro, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfônico (HEPES) e soro, mantendo a capacidade de ligação e liberação de oxigênio do Hb^{de 35}. Métodos analíticos como espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN), difração de raios X em pó (PXRD), sorção de nitrogênio (N₂), análise de potencial zeta (ζ), espalhamento dinâmico de luz (DLS), microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirmam transformação química, integridade da estrutura, porosidade, morfologia em escala nanométrica e funcionalização bem-sucedida da superfície.

Ao enfatizar reprodutibilidade, escalabilidade e clareza operacional, apoiadas pela visualização baseada em vídeo de etapas tecnicamente sensíveis, essa metodologia oferece uma rota reproduzível, robusta e acessível para fabricar transportadores de oxigênio estáveis baseados em MOF. Importante, a abordagem é modular e facilmente adaptável a outras biomacromoléculas ou enzimas que exigem um microambiente protegido, porém permeável ao oxigênio, para manter a funcionalidade. Assim, as NPs Hb@HP-UiO-66-PEG representam um passo promissor rumo à criação de HBOCs capazes de fornecer oxigênio de forma eficiente, resistindo à degradação em fluidos biológicos.

De uma perspectiva prática, essa estratégia pode ser estendida a outras biomacromoléculas além do Hb, desde que possuam dimensões abaixo de aproximadamente 20 nm, correspondentes ao tamanho máximo acessível do mesóporo, e exibam uma ou mais das seguintes características: (i) sensibilidade a condições químicas severas, favorecendo síntese leve e modificação superficial; (ii) a necessidade de um microambiente hidratado e permeável ao oxigênio para manter a atividade funcional; e (iii) suscetibilidade à degradação da MOF induzida por fosfato, exigindo estabilização superficial. A abordagem baseia-se em densidades moderadas de defeitos para equilibrar a acessibilidade do mesóforo com a integridade do framework. Quando a modificação superficial específica e sem catalisadores é necessária para preservar a função da biomolécula, a PEGylação baseada em SPAAC oferece vantagens claras. Consequentemente, esse protocolo é bem adequado para carregamento eficiente de biomacromoléculas, preservação funcional e estabilidade coloidal de longo prazo sob condições fisiológicas, enquanto biomoléculas substancialmente maiores ou sistemas que exigem estabilidade térmica ou ácida extrema podem requerer plataformas alternativas de MOF.

Protocolo

1. Extração de Hb (Duração esperada: 2 dias)

NOTA: A extração de Hb do sangue bovino comercialmente disponível (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) é realizada seguindo nosso protocolo⁴⁹ previamente reportado.

1. Transfira sangue bovino (tipicamente 10 mL por extração) para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL. Adicione um volume igual de solução fisiológica de 0,9% (p/v) para diluir o sangue e reduzir a viscosidade. Inverta suavemente várias vezes até obter uma suspensão homogênea.
2. Centrifuge o sangue diluído a 1.500 x g por 20 minutos a 4 °C. Após a centrifugação, um sobrenadante amarelo claro (plasma) aparece acima de um comprimido vermelho denso (RBCs). Se a pelletagem completa não for alcançada, continue a centrifugação conforme necessário.
3. Decante cuidadosamente e descarte a camada de plasma sem mexer no pellet. Adicione soro salino fresco (10 mL), ressuspenda o pellet de glóbulos vermelhos por inversão suave e repita a etapa de centrifugação sob condições idênticas. Realize dois ciclos de lavagem no total para remover proteínas plasmáticas e plaquetas.
   NOTA: O processo de lavagem é crucial para obter glóbulos vermelhos puros livres de contaminantes plasmáticos que possam interferir na extração de tolueno a jusante.
4. Após a segunda lavagem, descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota de glóbulos vermelhos limpa em uma mistura de tolueno, água ultrapura e soro fisiológico com a razão de volume de 1:0,4:1. Por exemplo, misture 10 mL de tolueno, 4 mL de água ultrapura e 10 mL de soro fisiológico em um funil separatório de 50 mL antes de adicionar o pellet.
5. Sele o funil e inverta suavemente várias vezes para misturar as fases. Coloque o funil a 4 °C durante a noite (~12-16 horas) para permitir a separação completa das fases. A fase tolueno extrai as membranas lipídicas, deixando uma fase aquosa clara enriquecida em Hb.
6. No dia seguinte, colete cuidadosamente a camada aquosa inferior usando a torneira do funil separador. Essa camada parece transparente e vermelha escura.
7. Transfira a solução aquosa de Hb para tubos de centrífuga e centrifuge a 8.000 x g por 20 minutos a 4 °C para remover qualquer detrito celular ou material emulsionado.
8. Filtre o sobrenadante através de uma frita de terra de diatomáceas usando um sistema de filtragem a vácuo. Aplique apenas um vácuo suave (evite pressão negativa alta que pode causar espuma ou desnaturação de proteínas).
9. Colete o filtrado contendo Hb livre de estroma. Armazene esse estoque em gelo se usado imediatamente, ou aliquota (~1 mL) e congele a −80 °C para uso prolongado.
   NOTA: As alíquotas de Hb podem ser armazenadas congeladas por vários meses sem degradação detectável.
10. Quantifique a concentração de Hb usando um ensaio de proteína de ácido bicincônico conforme o protocolo do fabricante, usando Hb bovino puro como padrão de calibração. Ajuste o estoque final de Hb para a concentração de trabalho desejada (tipicamente 20 mg ^mL-1 no tampão HEPES, pH 7,4).
    NOTA: Espere uma solução de Hb clara e vermelha, livre de material celular.
11. Opcional: medir os espectros de absorção UV-vis (375-700 nm) do Hb extraído para avaliar sua capacidade de ligação e liberação de oxigênio. Grave o espectro UV-vis inicial. Adicione ditionito de sódio e purge com gás_N2 por 10 minutos para liberar oxigênio, e registre o espectro de Hb desoxigenado. Em seguida, purge com ar por 10 minutos para permitir a reoxigenação e re-gravar o espectro.
    NOTA: A presença de bandas características de Soret e Q, de Hb oxigenado (~412 nm para a banda de Soret; ~541 e ~577 nm para bandas Q) e desoxigenado (~430 nm para banda Soret; ~557 nm para banda Q) após purga com ar e N₂, respectivamente, indica que Hb permanece funcional (Figura Suplementar 1).
    ATENÇÃO: Manuseie o tolueno com cuidado dentro de uma exaustão, usando equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jaleco, óculos de proteção e luvas. No presente estudo, todos os resíduos líquidos contendo tolueno foram coletados e descartados como resíduos químicos orgânicos líquidos em recipientes designados (Grupo C), rotulados como "tolueno e mistura", de acordo com as diretrizes do Ministério do Meio Ambiente da Dinamarca. A documentação correspondente sobre descarte de resíduos é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

2. Fabricação de NPs HP-UiO-66-NH₂ (Duração esperada: 3 dias)

ATENÇÃO: HCl (37%) é corrosivo; Use a alça dentro de uma exaustão com jaleco, luvas resistentes a ácido e proteção ocular adequada. Adicione ácido lentamente e evite inalar vapores.

1. Pese_{ZrCl 4} (400 mg, 1,715 mmol) em um frasco de fundo arredondado de 250 mL. Adicione lentamente DMF (80 mL) e ultrasultrasonice por 5 minutos para dissolver completamente o_{ZrCl 4}. Adicione DA (12 g, 60 mmol) e ultrassone por mais 30 minutos até obter uma solução clara e homogênea. Meça o volume total da solução usando um cilindro graduado e adicione DMF conforme necessário para ajustar o volume final para 100 mL. O DA atua como um modulador competitivo, introduzindo defeitos controlados na rede.
   NOTA: Adicione DMF lentamente ao dissolver ZrCl₄, pois o processo de coordenação é exotérmico e pode causar leve fumaça; Realize todas as operações em uma exaustão. Considere o aumento de volume causado pela incorporação de DA usando um volume inicial de 80 mL DMF para dissolver_{ZrCl 4} e DA, e ajuste o volume final para 100 mL somente após a dissolução completa para garantir um controle preciso da concentração.
2. Adicione ácido 2-amino-1,4-benzenedicarboxílico (_{BDC-NH 2}, 155 mg, 0,857 mmol) ao mesmo frasco e faça sonicação por mais 30 minutos. Continue até obter uma solução homogênea amarelo-pálido.
3. Transfira a mistura para um autoclave revestido de Teflon ou recipiente de pressão de fundo arredondado de 150 mL, adequado para síntese solvotérmica. Sele bem e coloque em um forno de abafamento pré-aquecido a 120 °C por 18 horas. Não perturbe o reator durante o aquecimento para evitar nucleação descontrolada.
4. Após a reação, desligue o forno e deixe o recipiente esfriar naturalmente até a temperatura ambiente (~2 h). Observe uma fina suspensão amarela aparecendo uniformemente em todo o meio.
5. Colete o produto por centrifugação (11.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) e descarte o sobrenadante. Lave o pellet com DMF (100 mL) três vezes usando as mesmas condições de centrifugação para remover o excesso de ligante e o DA não reagido. Se o produto não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
6. Prepare uma solução de remoção de ácido composta por DMF (100 mL) contendo 0,5 mL concentrado de HCl (37%). Imerga completamente o pellet lavado nessa solução e aqueça-o em um forno abafador a 90 °C por 12 horas. Esse passo remove o modulador DA, criando mesóporos dentro da estrutura.
7. Após 12 horas, centrifuge (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) e descarte o sobrenadante. Repita o tratamento ácido usando um novo lote de DMF contendo 0,5 mL de HCl para garantir a remoção completa da DA. Se o produto não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
8. Lave o pellet sequencialmente com DMF, acetona e etanol (100 mL, 11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para remover qualquer ácido e solvente residual. Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário. Entre cada lavagem, redisperse suavemente o pellet por meio de vórtice ou sonicação leve.
9. Seque o produto em um forno a vácuo (140 °C) durante a noite após secar ao ambiente dentro de uma exaustora de fumaça. Os materiais finais (HP-UiO-66-NH₂ NPs) aparecem como pó amarelo fino. Espere um rendimento típico de ~428 mg.
10. Confirme que os picos do PXRD em 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° permanecem nítidos (Figura 2A), indicando retenção da topologia cristalina UiO-66. Verifique a remoção completa da DA por ^{RMN de 1}H após digestão alcalina (2 M KOH em_{D 2}O) (sem picos de metileno a 1,2 ppm) (Figura 2B).
11. Caracterize a porosidade por adsorção-dessorção N₂ em 77 K⁵⁰. A curva apresenta uma isotermia combinada Tipo I/IV com um laço de histerese (Figura 2C), confirmando a formação do mesóporo.
    NOTA: Secagem incompleta em alta temperatura ou massa insuficiente da amostra levam a medições de porosidade imprecisas usando isotermas de adsorção-dessorção N₂ ; repita o processo de secagem a vácuo a 140 °C e certifique-se de que o peso da amostra exceda 100 mg se a área Brunauer−Emmett−Teller (BET) for < 1.000^{m 2 g-1}.
12. Opcional: avalie a morfologia dos NPs usando SEM. Os NPs HP-UiO-66-NH₂ apresentam morfologia esférica com uma distribuição estreita de tamanhos de ~100 nm (Figura 2D).
    NOTA: Espere_{HP-UiO-66-NH 2} NPs possuindo tanto micro- quanto mesóporos, adequados para encapsulamento subsequente de Hb.
13. A síntese_{dos NPs} HP-UiO-66-NH 2 pode ser ampliada aumentando proporcionalmente todos os reagentes e solventes usados nos passos 2.1 a 2.9 e realizando múltiplas reações solvotérmicas paralelas. Ao manter as mesmas proporções molares, concentrações, temperatura de reação e tempo de reação, e aumentar as quantidades de reagentes e solventes em 1,5 vezes, dois ou mais autoclaves revestidos de Teflon ou vasos de pressão de fundo arredondado de 150 mL podem ser operados simultaneamente, permitindo a produção em escala de gramas_{de NPs} HP-UiO-66-NH 2 (Figura 3).
    NOTA: Manuseie todos os solventes orgânicos dentro de uma capela enquanto usa jaleco, luvas resistentes a ácido e proteção ocular adequada. Coletar todos os resíduos líquidos contendo DMF e descartá-los como resíduos líquidos químicos orgânicos em recipientes designados (Grupo C) rotulados como "DMF e mistura", de acordo com as diretrizes do Ministério do Meio Ambiente da Dinamarca. Soluções de resíduos contendo traços de_{ZrCl 4} e HCl foram tratadas de acordo. A documentação correspondente sobre descarte de resíduos é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

3. Funcionalização azida_{dos NPs} HP-UiO-66-NH 2 (HP-UiO-66-N₃ NPs) (Duração esperada: 1 dia)

ATENÇÃO: A trimetilsilyazida (TMSN₃) e o nitrito tert-butil (tBuONO) são tóxicos e voláteis. Realize todas as etapas com um exaustor de fumaça, usando jaleco, luvas de nitrilo e proteção ocular.

1. Pese com precisão_{HP-UiO-66-NH 2} NPs (50 mg) em um frasco de fundo arredondado de 25 mL. Adicione THF (10 mL) e ultrasultrasonice por 5 minutos para dispersar completamente as partículas. A suspensão fica opaca, mas uniforme.
   NOTA: A dispersão uniforme dos NPs após a sonicação é fundamental para o contato eficaz com os reagentes. Se a dispersão estiver incompleta, aumente o volume da solução e repita a sonicação.
2. Coloque o frasco em um banho de água gelada (0 °C) em um agitador magnético ajustado para 400 rpm. Usando uma seringa de vidro, adicione tBuONO (0,4 mL) em gota em direção ao longo de 5 minutos, mantendo a temperatura abaixo de 5 °C.
3. Adicione imediatamente TMSN₃ (0,35 mL) em gota a gota sob as mesmas condições frias. Pode aparecer uma leve efervescência, indicando progresso de nitrosação. Envolva o banho com papel alumínio para proteger a reação da luz...
4. Continue mexendo a mistura de reação durante a noite (~16 h) no banho de água gelada para permitir a substituição completa de azidas dos grupos aminas na superfície do MOF.
5. Remova o banho de gelo e deixe a suspensão atingir a temperatura ambiente. Centrífuga (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para coletar os NPs modificados. Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
6. Lave o pellet cuidadosamente com THF (10 mL) três vezes, coletando-o por centrifugação (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) após cada lavagem. Em seguida, três lavagens adicionais usando acetona (10 mL), centrifugando sob as mesmas condições, para remover reagentes e subprodutos residuais. Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
7. Seque o produto (HP-UiO-66-N₃ NPs) usando um forno (140 °C) sob vácuo durante a noite após secagem ambiente dentro de uma exaustão de fumaça. Espere um rendimento típico de ~45 mg.
8. Verifique a transformação química por espectroscopia FTIR: um estiramento assimétrico acentuado de azida aparece em ~2122 ^cm-1 (Figura 4A). A intensidade da banda está correlacionada com a eficiência da substituição superficial.
   NOTA: Conversão incompleta pode prejudicar a conjugação subsequente de cliques. Se a banda de azida for fraca, repita a funcionalização usando quantidades 2 vezes maiores de tBuONO e TMSN₃. Espere_{HP-UiO-66-N 3} NPs com terminação azido-terminada com cristalinidade preservada e arquitetura mesoporosa (Figura 4B-D), prontas para encapsulamento em Hb e PEGilação SPAAC.
   ATENÇÃO: Colete todos os líquidos residuais contendo TMSN₃, incluindo misturas com outros reagentes (por exemplo, tBuONO e THF), em recipientes designados do Grupo O de resíduos perigosos, de acordo com as diretrizes do Ministério do Meio Ambiente dinamarquês. Rotule claramente todos os recipientes para indicar a presença de TMSN₃ e suas misturas. A documentação relevante para descarte de resíduos é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

4. Carregamento e Quantificação de Hb (Duração esperada: 2 dias)

1. Transfira_{HP-UiO-66-N 3} NPs (5 mg) para um tubo centrífugo de 2 mL, seguido por uma sonicação de ~2 min em 0,5 mL de buffer HEPES (20 mM, pH 7,4). Adicione 0,5 mL de buffer HEPES contendo Hb (20 mg ^mL-1) e invista suavemente o tubo várias vezes para dispersar completamente os NPs.
2. Coloque o tubo em um termoshaker e incube em temperatura ambiente (22-25 °C) sob 1.000 rpm agitando por 2 horas.
3. Após a incubação, centrifuge 13.500 x g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar os NPs resultantes Hb@HP-UiO-66-N₃ . Colete cuidadosamente o sobrenadante para quantificar o Hb não preso. Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
4. Lave o pellet suavemente com água ultrapura (1 mL) pipetando para cima e para baixo para remover o Hb solto e absorvido e repita a lavagem duas vezes. Colete cuidadosamente o sobrenadante de cada lavagem para quantificar o Hb não preso. Ressuspenda o pellet final em 0,5 mL de água ultrapura para caracterização. Guarde as amostras na geladeira (4 °C) para evitar oxidação.
5. Determine o Hb não aprisionado nos supernadantes coletados usando o ensaio⁵¹ de lauril sulfato de sódio (SLS)-Hb. Pipete 10 μL de cada sobrenadante em uma microplaca de 96 poços e adicione 100 μL de reagente SLS (0,6 mg ^mL-1 em água ultrapura). Incube por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro, depois leia absorvância a 412 nm usando um espectrofotômetro UV-vis.
6. Prepare uma curva padrão usando soluções Hb stock (0-10 mg ^mL-1) em buffer HEPES para converter os valores de absorção em concentração.
7. Calcule a eficiência de encapsulamento (EE) e o conteúdo de carga (LC) como:
   EE (%) = [(Hb inicial - Hb sobrenadante)/Hb inicial] × 100
   LC (%) = [(Hb encapsulado)/(Hb encapsulado + massa NP)] × 100
8. Para aumentar a escala do encapsulamento de Hb, incube 100 mg de NPs com 20 mL de solução de Hb (10 mg mL⁻¹). Para avaliar a porosidade após a encapsulação, mergulhe os NPs resultantes em etanol por 24 horas, depois seque durante a noite em um forno a vácuo a 140 °C, registrando a isotérmica de adsorção-dessorção_N2 para avaliar a porosidade. A cor vermelha do pó indica encapsulamento bem-sucedido de Hb (Figura 5A), e uma diminuição significativa na absorção de N₂ confirma o preenchimento bem-sucedido dos mesóboros com Hb (Figura 5B).
9. Meça o potencial ζ usando um Zetasizer Nano ZS. A carga superficial diminui de ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NPs) para ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs), consistente com adsorção de Hb (Figura 5C).
10. Opcional: adquirir micrografia SEM (Figura 5D) e difractograma PXRD (Figura 5E) para garantir integridade morfológica e estabilidade estrutural.
11. Registre espectros UV-vis (375-700 nm) para avaliar a ligação reversível de oxigênio dos NPs. Adicione ditionito de sódio e faça a purga com N₂ por 10 minutos para liberar oxigênio, registre o espectro, depois purge com ar por 10 minutos para permitir a religação, e grave novamente o espectro (Figura 5F).
    NOTA: A presença de bandas características de Soret e Q, de Hb oxigenado (~412 nm para a banda Soret; ~541 e ~577 nm para bandas Q) e desoxigenado (~430 nm para banda Soret; ~557 nm para banda Q) após purga com ar e N₂, respectivamente, indica que Hb permanece funcional.
12. Espere_{Hb@HP-UiO-66-N 3} NPs vermelhos uniformes contendo Hb funcionalmente ativo com comportamento reversível de oxigenação.

5. Fabricação de NPs Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGylação via SPAAC (Duração esperada: 2 dias)

1. Prepare um tubo centrífugo de 2 mL contendo Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs (10 mg) dispersos em 0,5 mL de água ultrapura. Adicione DBCO-PEG (MW ~2.000, 20 mg em 0,5 mL de água ultrapura) para obter uma proporção de 2:1 (p/w) de PEG para NPs. Leve o vórtice suavemente até estar totalmente misturado.
2. Incube a mistura em um termoshaker em temperatura ambiente e 1.000 rpm por 1 hora, depois transfira para uma geladeira (4 °C) para reação durante a noite (~16 h). Essa reação de clique SPAAC sem catalisadores acopla covalentemente DBCO aos grupos azídeos, formando ligações triazólicas estáveis.
3. Centrifuge a 12.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar os NPs PEGilados Hb@HP-UiO-66-PEG. Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário. Descarte o sobrenadante contendo PEGO não reagindo.
4. Lave o pellet três vezes com água ultrapura (2 mL cada, pipetando para cima e para baixo) sob condições idênticas de centrifugação. Isso garante a remoção de cadeias livres de PEG e pequenos subprodutos moleculares.
5. Ressuspenda as NPs purificadas Hb@HP-UiO-66-PEG em 2 mL de água ultrapura e armazene a 4 °C.
   O coloide parece homogêneo e levemente opalescente, indicando boa estabilidade de dispersão.
6. Confirmar PEGilação bem-sucedida por espectroscopia FTIR (Figura 6A): desaparecimento da banda de azida em 2122 ^cm-1 e emergência de sinais de metileno (−CH₂−) e ligação de éter (−O−) derivados de PEG em 2883 e 1097 ^cm-1, respectivamente.
7. Verifique por ^{RMN de 1}H (Figura 6B) após digestão alcalina em 2 M KOH/_{D 2}O; Amostras PEGiladas mostram um sinal adicional em δ = 3,53 ppm correspondente aos prótons oxietileno do PEG.
8. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersidade (PDI) por DLS (Figura 6C).
   Um aumento de ~115 nm (PDI ~0,1) para ~140 nm (PDI ~0,17) confirma o revestimento superficial com uma fina camada polimérica.
9. Opcional: medir o potencial ζ-real da superfície usando um Zetasizer Nano ZS para verificar o efeito negligenciável da PEGylação superficial na carga superficial (Figura 6D). Uma pequena alteração após a PEGylação (de ~+20 mV para ~+17 mV) indica impacto mínimo na carga superficial.
10. Observe a morfologia por TEM (Figura 6E). O TEM revela uma borda difusa de ~10-12 nm ao redor da borda da partícula, representando a coroa PEG.
11. Realize o ensaio de liberação de oxigênio usando um eletrodo de oxigênio (Figura 6F) para mostrar que a função Hb permanece intacta após a PEGilação, semelhante à forma não PEGilada. Espere uma NP estável, dispersa em tons avermelhados de Hb@HP-UiO-66-PEG, exibindo forte estabilidade coloidal e capacidade de ligação ao oxigênio retida, adequada para testes fisiológicos de longo prazo.
12. Opcional: conduzir curvas de dissociação de oxigênio (ODCs) de Hb e Hb livres encapsuladas em NPs Hb@HP-UiO-66-PEG para identificar a pressão parcial de oxigênio a 50% de Hb, saturação de oxigênio (p50) e coeficiente de Hill (Hill-n) (Figura 7).

6. Avaliação da estabilidade dos NPs (duração esperada: 7 dias)

1. Dispense NPs Hb@HP-UiO-66-PEG (~5 mg) em sete tubos centrífugos de 2 mL. Adicione 2 mL de cada meio: água ultrapura, soro fisiológico (0,9% NaCl), HEPES (20 mM), soro de camundongo, plasma humano, glicose média modificada de Eagle (DMEM) modificada de Dulbecco e soro salino tamponado com fosfato (PBS). Certifique-se de que as tampas dos tubos da centrífuga estejam bem fechadas para evitar a evaporação do meio durante a incubação. Soro de camundongos CD-1 e plasma humano são adquiridos pela Innovative Research (Novi, MI, EUA).
2. Incube as amostras a 37 °C em um termoshaker a 1.000 rpm por até 7 dias.
3. Após 3 e 7 dias, colete partículas por centrifugação (12.000 g, 10 min, temperatura ambiente), lave uma vez com água ultrapura e seque para PXRD (Figura 8A). Se o precipitado não estiver completamente pelletado, estenda o tempo de centrifugação conforme necessário.
4. Em 0, 24, 72 e 168 horas, retire alíquotas (~50 μL) e dilua-as 20 vezes para análise DLS (tamanho e PDI) (Figura 8B).
5. Opcional: prepare amostras de SEM após 48 horas no PBS para verificar visualmente a morfologia (Figura 8C).
   NOTA: Diluir a suspensão dos NPs (em PBS) com água ultrapura é essencial para a análise de MEB, pois reduz a interferência de fundo dos componentes do tampão e facilita a imagem clara dos NPs.
6. Compare com NPs Hb@HP-UiO-66-N_não PEGilados sob condições idênticas; o rápido desaparecimento de reflexões cristalinas características e o surgimento de amplas características amorfas de espalhamento indicam instabilidade sem revestimento PEG.
   NOTA: Amostras PEGyladas permanecem estruturalmente intactas após 7 dias em todos os meios, enquanto as não PEGyladas se decompõem em 24 horas em PBS ou DMEM.

7. Caracterização fisicoquímica (Duração esperada: ~15 dias)

NOTA: Esta seção descreve os métodos analíticos necessários para confirmar a morfologia, composição, porosidade e integridade dos NPs. Essas técnicas de caracterização validam coletivamente a reprodutibilidade dos processos de síntese e modificação.

1. PXRD
   1. Seque ~5 mg de cada amostra de NP em um secador de freezer durante a noite antes da medição para remover a umidade adsorvida.
   2. Carregue a amostra em um suporte plano de silício sem fundo e achate suavemente usando uma lâmina de vidro limpo para formar uma camada fina e uniforme.
      NOTA: Evite pressionar com muita força, pois isso pode induzir efeitos de orientação preferencial.
   3. Registrar padrões de PXRD usando um difractômetro de bancada equipado com radiação Kα (λ = 1,5418 Å). Defina parâmetros de varredura para 2θ = 4-50°, tamanho do passo = 0,02°, permanência = 1 s por passo.
   4. Compare os padrões obtidos com a estrutura simulada de UiO-66 gerada usando o software Mercury com base nos dados cristalinos^{previamente reportados 31}. A presença de picos agudos em 7,3°, 8,4° e 25,7° indica integridade cristalina.
2. N₂ Adsorção-Dessorção (área de superfície BET e distribuição do tamanho dos poros)
   1. Desgasificar ~100 mg de cada amostra de NP a 140 °C sob vácuo por 24 horas usando um sistema Micromeritics Smart VacPrep com purga de ultra-alta pureza_{N 2}.
   2. Transfira imediatamente as amostras desgasificadas para a porta de análise de um analisador de área de superfície Micromeritics Trister. Registro de_{N 2} isotermas a 77 K dentro de uma faixa de pressão relativa (P/P₀) de 0-1.
   3. Calcule as áreas de superfície usando o método BET seguindo o critério estendido^{de Rouquerol 52}. Calcule a distribuição do tamanho dos poros usando a teoria funcional da densidade não local implementada no software Micromeritics.
   4. Gerar as curvas de adsorção/dessorção e os gráficos de distribuição de tamanho de poros usando o Origin 2022. Importe os dados de adsorção/dessorção para o software, com pressão relativa (P/P₀) no eixo X e o volume adsorvido de N₂ no eixo Y.
   5. Plote os dados de distribuição do tamanho dos poros com a largura dos poros como eixo X e volume incremental de poros como eixo Y. Apresente os resultados como gráficos "Linha + Símbolo". Realize todas as análises usando as configurações padrão do software.
3. Espectroscopia FTIR
   1. Moa ~5 mg de cada amostra seca em um pó fino usando um almofariz de ágata limpo. Coloque o pó sobre o cristal ATR de um espectrômetro ALPHA-P^{Bruker 53}.
   2. Colete espectros na faixa de 4.000-400 ^cm-1 com resolução de 2 ^cm-1 .
   3. Identificar picos característicos: A aparição do estiramento de N₃ em ~2122 ^cm-1 confirma a formação de azida (Figura 4A). Após a PEGylação, observe as bandas −CH₂− e C-O-C em ~2883 ^cm-1 e ~1097 ^cm-1, respectivamente, junto com o desaparecimento do estiramento N₃ (Figura 6A). Espera-se o desaparecimento da banda de azida e o surgimento de sinais de metileno (−CH₂−) e osso do éter (−O−) derivados de PEG confirmam a conclusão da reação SPAAC.
   4. Plote as curvas FTIR usando o Origin 2022. Importe os dados brutos para o software com os valores X (número de onda) e Y (transmitância). Gerar gráficos no formato "Linha" usando as configurações padrão do software.
4. ¹H RMN
   1. Adicione ~10 mg de NPs a 0,5 mL de 2 M KOH em D_2Ocolocado em um frasco de vidro, e aqueça a 80 °C por 1-2 horas para digerir a estrutura.
   2. Centrífuga (12.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) para centrifugar os resíduos não dissolvidos. Transfira o sobrenadante para um tubo de RMN de 5 mm.
   3. Grave espectros de RMN ^{de 1}H em um espectrômetro Bruker Avance de 400 MHz.
   4. Atribua as mudanças químicas características, incluindo os prótons aromáticos do BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) e os sinais PEG (δ = ~3,53 ppm, Figura 6B), usando o software do MestReNova. Analise os dados de RMN usando o módulo de processamento de RMN do software com suas configurações padrão.
5. SEM
   1. Depositar uma gota de ~5 μL de suspensão NP em uma pastilha de silício; Deixe secar ao ar em um armário sem poeira. Se ocorrer carga, faça sputter-coat com ouro de 5 nm.
   2. Imagem em um FEI Quanta 200 SEM em tensão de aceleração de 10-20 kV.
   3. Analise as imagens usando o ImageJ. Importe as imagens TIFF originais com informações de escala embutidas para o software e ajuste o brilho e o contraste apenas para visualização. Não aplique nenhum processamento adicional que possa afetar a informação dimensional. Gerar as barras de escala usando a função Analyze do software.
6. TEM
   1. Coloque ~5 μL de dispersão NP em uma grade de de carbono lacey (malha 300). Limpe o excesso com papel de filtro e seque em condições ambientes.
   2. Examine sob um FEI Tecnai T20 G2 TEM a 200 kV.
   3. Analise as imagens usando o ImageJ. O processamento de imagem segue os procedimentos descritos na Seção 7.5.3.
7. DLS e ζ-Potencial
   1. Diluir NPs ~20 vezes em água ultrapura para tamanho e análise PDI; para potencial ζ, diluir em buffer HEPES (20 mM, pH 7,4).
   2. Meça usando um Zetasizer Nano ZS a 25 °C. Pelo menos três amostras independentes (n = 3) são preparadas, e cada amostra é medida em triplicado.
   3. Plote os dados DLS e ζ-potencial usando o Origin 2022. Apresente a distribuição do tamanho das partículas ponderada pela intensidade como grafos "Linha + Símbolo" e os resultados do potencial ζ como grafos "Colunas". Reporte os dados como média ± desvio padrão (n = 3). Realize todas as análises usando as configurações padrão do software.
8. Espectroscopia UV-vis para funcionalidade Hb
   1. Disperse 3 mg de Hb livre ou uma quantidade correspondente de NPs (ou seja, contendo uma quantidade equivalente de Hb encapsulado) em 3 mL de água ultrapura. Transfira as suspensões para uma cuveta de quartzo. Grave espectros UV-vis de 375-700 nm usando um espectrofotômetro UV-2600 UV−vis.
   2. Adicione uma pitada de ditionita de sódio à solução de Hb ou à suspensão NP e purge com_N2 por 10 minutos para desoxigenar a amostra. Grave a mudança da banda Soret de 412 para 430 nm e a fusão das bandas Q. Reoxigene a amostra borbulhando o ar por 10 minutos para observar a reversão (Figura 5F e Figura Suplementar 1).
   3. Plote os dados usando o Origin 2022. Apresente os espectros como grafos "Linha", com comprimento de onda no eixo X e absorção no eixo Y.
9. Quantificação do oxigênio liberado
   1. Disperse 1 mg de Hb livre ou uma quantidade correspondente de Hb@HP-UiO-66-N₃ e Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (contendo uma quantidade equivalente de Hb encapsulado) em água ultrapura de 600 μL. Transfira as suspensões para frascos de vidro de 2 mL e sele-os firmemente com tampas de borracha.
   2. Insira cuidadosamente a sonda de agulha do eletrodo de oxigênio através da tampa de borracha na suspensão para monitorar o nível de oxigênio dissolvido usando um medidor de agulha_O2 .
   3. Adicione rapidamente a solução de K₃[Fe(CN)₆] (10% em 100 μL de água ultrapura) à suspensão usando uma agulha de seringa e registre continuamente a mudança no nível de oxigênio.
   4. Calcule o oxigênio liberado subtraindo o valor máximo observado após a adição de K₃[Fe(CN₎₆] do valor inicial antes da adição. Normalize os valores obtidos para o oxigênio liberado da mesma quantidade de Hb livre (Figura 6F) usando Origin 2022. Meça três amostras independentes (n = 3) para Hb livre ou cada NP.
      NOTA: As NPs_{Hb@HP-UiO-66-N 3} e Hb@HP-UiO-66-PEG apresentam liberação de oxigênio comparável, cada uma liberando ~60% do oxigênio liberado pelo Hb livre.
10. Medição de ODCs e cálculo de p50 e Hill-n
    1. Prepare NPs livres de Hb bovino ou Hb@HP-UiO-66-PEG a uma concentração final de Hb de ~1 mg ^mL-1 em 3 mL de tampão de soro fisiológico (20 mM HEPES, 0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4). Transfira a amostra para uma cuvette de quartzo equipada com uma barra magnética de mexida.
    2. Coloque a cuvette em um analisador Hemox. Ajuste a temperatura de medição para 37 °C e permita que o sistema se equilibre sob agitação contínua até que uma linha de base estável seja alcançada.
    3. Registre as ODCs por desoxigenação gradual em uma faixa de pressão parcial de 1-148 mmHg. Use o software de análise Hemox pré-instalado para medir ODCs e calcular p50 e Hill-n usando as configurações padrão de análise. Meça três amostras independentes (n = 3) para cada amostra.
    4. Exporte os dados processados e plote os ODCs usando o Origin 2022 no formato padrão de gráfico "Linha".

8. Reprodutibilidade e análise estatística

1. Execute todos os procedimentos descritos neste protocolo pelo menos três vezes independentes. Relate os resultados como resultados típicos observados nessas repetições. Mantenha os principais parâmetros experimentais, como tempos de reação e temperaturas, dentro de uma faixa razoável para garantir reprodutibilidade e confiabilidade para outros usuários.
2. Caracterização estrutural presente (PXRD, N₂ adsorção-dessorção, FTIR, ¹H NMR, SEM, UV-VIS) como dados representativos para confirmação qualitativa sem realização de análise estatística.
3. Relate medições quantitativas (DLS, ζ-potencial, p50, Hill-n) como média ± DS (n ≥ 3). Determinar significância estatística usando o teste t de Welch bicauda-desparelhado ou ANOVA unidirecional, conforme apropriado. Indique os níveis de significância como ns (sem significativo), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Resultados

A síntese bem-sucedida_{dos NPs} HP-UiO-66-NH 2 foi verificada pelo PXRD (Figura 2A), que exibiu os picos característicos de difração em 2θ = 7,3°, 8,4° e 25,7°, em boa concordância com a estrutura simulada de UiO-66³⁶. O leve alargamento do pico em relação ao padrão simulado foi atribuído às dimensões em nanoescala das partículas e confirmou a preservação da integridade cristalina após a síntese⁵⁴. A r...

Discussão

Este protocolo apresenta uma rota robusta e reprodutível para sintetizar, funcionalizar e caracterizar NPs HP-UiO-66 projetados para encapsulamento de Hb e aplicações de entrega de oxigênio. Ao adotar uma abordagem de engenharia de dentro para fora, este trabalho estabelece uma estrutura generalizável para o projeto de NPs MOF para aplicações biomédicas, incluindo entrega de biomacromoléculas e medicamentos. Embora o conceito material subjacente e o desempenho funcional já tenham sido re...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-amino-1,4-benzeno-carboxilico ácido	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	381071-25G
4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	H3375-100G
Acetona (99%)	VWR International (Sø borg, DK)	23J244030
Ensaio de proteína do ácido cincinônico	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Sangue bovino	SSI Diagnostica A/S (Hillerø d, DK)	77667
Tubo centrífuga
Centrifugadora	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, EUA)	75009903	Megafuge ST Plus série & nbsp;
Óxido de deutério	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	151882
Dibenzociclooctino-polietilenoglicol	BroadPharm	BP-23949
ácido dodecanoico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco' s Modified Eagle' s médio e negativo; glicose alta	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	11965092
Etanol (100%)	VWR International (Sø borg, DK)	24L044013
Espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier	Bruker (Billerica, EUA)
Analisador de hemox	TSC Scientific CRP (PA, EUA)
Plasma citado humano	TebuBio	SER-PLP25
Ácido clorídrico (37%)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	320331-500ML
Software ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde (EUA)		Versão 1.47t
Grade de carbono lacey (malha 300)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Reino Unido)	AGS166-3H
Agitador magnético	IKA-Werke GmbH & Co. KG (,DE)	Identificação. Não.: 0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Research (Espanha)		Versão 12
Analisador de área de superfície Micromeritics Tristar	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini centrífuga	Eppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)	Nº de catálogo   5452000010
Soro de camundongo	Pesquisa Inovadora (Novi, MI, EUA)	IGMSCD1SER10ML
Aquecedor de abafamento	Nabertherm GmbH (Bremen, DE)	Fornalha de abafamento LE 6/11
N,N′-dimetilformamida (99,9%)	VWR International (Sø borg, DK)	250131a008
Equipamentos Nanodrop 2000c	Thermo Fisher
Ressonância magnética nuclear	Bruker (Billerica, EUA)
O2 metro	PreSens (Regensburg, Alemanha)
Software Origin 2022	OriginLab Corporation (MA, EUA)		Versão 2022
Sensor de oxigênio	PreSens (Regensburg, DE)	Traço OXY-1 ST
Soro tampão com fosfato & nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	P4417-50TAB
Leitor de placas	Tecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Hexacianoferrato de potássio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	60299-100G
Hidróxido de potássio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	221473-500G
Difração de raios X em pó	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Reino Unido)		Modelo: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD para medições de pó (Lançado em 2020)
Vaso de pressão de fundo arredondado	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170004-1EA
Microscopia eletrônica de varredura	Companhia FEI (Hillsboro, EUA)	Helios Nanolab 600 de feixe duplo FEI
cloreto de sódio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71376
Ditionita de sódio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71699-250G
Dodecilsulfato de sódio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L4509-100G
Synthware & comércio; Vaso de pressão de fundo arredondado	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170003
Nitrito tert-butil	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	20370-100ml-F
Tetrahidrofurano (99,7%)	VWR International (Sø borg, DK)	201022A004
Termoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Reino Unido)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Microscopia eletrônica de transmissão	Companhia FEI (Hillsboro, EUA)	FEI Tecnai T20
Trimetilsilylazida	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	155071-10G
Sistema TSC HEMOX DAQ	TSC Scientific CRP (PA, EUA)		Software analisador Hemox
Ultrosound sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, EUA)	SKU: 2410240003
Espectrofotômetro UV-Vis	Shimadzu (Kyoto, JP)
Forno a vácuo	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, EUA)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Reino Unido)	Número de série MAL1188530
Cloreto de Zircônio(IV)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	357405-100G