Estimulação magnética de corpo inteiro reduz a alimentação semelhante à compulsão alimentar em um modelo camundono de transtorno alimentar

Resumo

A estimulação magnética de corpo inteiro (WB-MS) foi usada em um modelo de alimentação semelhante à compulsão alimentar, envolvendo acesso intermitente a uma dieta palatável. O WB-MS reduziu temporariamente a entrada durante a simulação sem alterar a entrada de comida. Ainda assim, os efeitos não foram sustentados, pois comportamentos semelhantes à compulsão compulsiva ressurgiram após o tratamento, sem alterações no peso, adiposidade ou expressão de accumbens c-Fos.

Resumo

A estimulação magnética de corpo inteiro (WB-MS) foi usada em um modelo de alimentação semelhante à compulsão alimentar, envolvendo acesso intermitente a uma dieta palatável. O WB-MS reduziu temporariamente a entrada durante a simulação sem alterar a entrada de comida. Ainda assim, os efeitos não foram sustentados, pois comportamentos semelhantes à compulsão compulsiva ressurgiram após o tratamento, sem alterações no peso, adiposidade ou expressão de accumbens c-Fos.

Introdução

A compulsão alimentar é um padrão alimentar desregulado, caracterizado pelo consumo rápido de grandes quantidades de alimentos altamente palatáveis na ausência de fome fisiológica. É uma característica central do transtorno de compulsão alimentar (BED), uma condição fortemente associada à obesidade e à disfunção^{metabólica 1,2}. Evidências crescentes destacam o papel dos circuitos de recompensa mesolímbicos na perda de controle sobre o comportamento^{alimentar 3,4}. A TED é cada vez mais conceituada como um transtorno de sinalização corticostrial, no qual a comunicação desregulada entre sistemas relacionados à recompensa e o controle executivo promove a ingestão compulsiva de alimentos. No nível neurobiológico, a sinalização dopaminérgica dentro da via mesolímbica, juntamente com entradas glutamatérgicas, contribui para a alteração da saliência dos incentivos e para a motivação excessiva por alimentos^{palatáveis 5,6}. Além disso, sinais metabólicos periféricos como GLP-1, insulina e grelina interagem com esses circuitos para modular a avaliação da recompensa e o comportamento^{alimentar 7}. Evidências recentes indicam ainda que comportamentos semelhantes a compulsão estão associados a mudanças na dinâmica neural dentro do NAc, incluindo oscilações de baixa frequência nas faixas delta e theta (2–8 Hz), que têm sido associadas à antecipação de recompensas e a estados de desejo que precedem a perda de controle⁸.

O NAc atua como um centro integrativo que conecta os sistemas límbico, cortical e motor, traduzindo sinais motivacionais em comportamentos direcionados a objetivos. A perturbação desse sistema, especialmente sob exposição repetida a alimentos palatáveis, promove padrões compulsivos e viciados de consumo ^9,10. Modelos experimentais que utilizam acesso intermitente a alimentos palatáveis induzem de forma confiável a compulsão alimentar semelhante à compulsão alimentar estão associados a uma ativação aumentada da NAc, apoiando seu papel no comportamento compulsivo^{de alimentação 11–14}. Neuromodulação não invasiva refere-se a técnicas que alteram a atividade cerebral sem intervenção cirúrgica, incluindo abordagens baseadas em campo magnético, como a estimulação magnética^{transcraniana 15}. Essas estratégias ganharam relevância clínica por sua capacidade de modular a excitabilidade neural e a atividade de rede em transtornos neuropsiquiátricos^16,17. Em humanos, a neuromodulação demonstrou reduzir os sintomas da compulsão alimentar e melhorar o controle comportamental, além de influenciar a regulação^{metabólica 18,19}.

Com base nessas evidências, a estimulação magnética do corpo inteiro (WB-MS) pode representar uma abordagem terapêutica não invasiva capaz de modular circuitos envolvidos na alimentação compulsiva. Diferentemente das técnicas focais, campos magnéticos de baixa frequência podem influenciar a excitabilidade neuronal e as redes cerebrais distribuídas, sugerindo um possível impacto em estruturas subcorticais como a^{NAc 8}. Estudos experimentais mostraram que tais campos modulam a neurotransmissão dopaminérgica e glutamatérgica 6,7,8,19, fornecendo um mecanismo plausível para influenciar circuitos relacionados à recompensa. No entanto, seus efeitos sobre o comportamento semelhante à compulsão alimentar permanecem desconhecidos. Portanto, o presente estudo avaliou os efeitos da WM-MS de baixa frequência em um modelo murino de compulsão alimentar semelhante à compulsão alimentar induzida pelo acesso intermitente a alimentos palatáveis, avaliando a ingestão alimentar, peso corporal, adiposidade e expressão de c-Fos no NAc.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Norma Oficial Mexicana para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NOM-062-ZOO-199) e aprovados pelo Comitê Institucional para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (CICUAL) da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), sob o protocolo número 035-CIC-2023. Todos os materiais usados no estudo são mencionados na Tabela de Materiais.

Definição e aquisição populacional

Foram usados um total de 30 C57BL/6 camundongos (9 fêmeas e 21 machos) no dia pós-natal 30 (P30), com peso corporal inicial de 15–18 g. Os camundongos eram alojados individualmente em gaiolas domésticas sob condições ambientais controladas: um ciclo de 12:12 h claro-escuro (luzes acesas às 6:00 da manhã), temperatura ambiente de 23 ± 2 °C e umidade relativa de 70 ± 10%.

Habituação

A P30, os animais foram alojados individualmente em gaiolas domésticas com acesso improvisado à água e alimentação padrão. Todas as gaiolas foram enriquecidas ambientalmente com tubos de papelão, e aparas de madeira foram usadas como cama. Durante o período de habituação de 7 dias, o peso corporal, a ingestão de alimentos e o consumo de água foram registrados a cada 24 horas.

Ingestão tipo compulsão

O modelo experimental utilizado neste estudo baseia-se no paradigma intermitente de compulsão e consumo descrito por^{pesquisadores 14}. Antes da alocação de grupos, todos os animais foram levados a um peso corporal médio comparável (17 g) para reduzir a variabilidade do base. Os animais (N = 30) foram então designados aleatoriamente para grupos experimentais usando uma ferramenta digital chamada "spin-the-wheel", na qual os indivíduos eram listados e alocados sequencialmente a um dos três grupos. O grupo padrão incluía fêmeas (grupo feminino padrão, SFG; n = 3) e machos (grupo masculino padrão, SMG; n = 7), que tinham acesso contínuo a comida e água padrão. O grupo de acesso contínuo incluía fêmeas (grupo feminino contínuo, CFG; n = 3) e machos (grupo masculino contínuo, CMG; n = 7) com acesso contínuo ad libitum a comida padrão, água e alimentos palatáveis (M&M's). O grupo de acesso intermitente incluía mulheres (grupo feminino intermitente, IFG; n =3) e homens (grupo masculino intermitente, IMG; n = 7), que tinham acesso ad libitum a comida e água padrão, e recebiam acesso a alimentos palatáveis três vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira) por 2 horas (16h00 às 18h). Essas condições de alimentação foram mantidas por 35 dias.

Estimulação magnética de corpo inteiro (WB-MS)

Esse paradigma de estimulação foi selecionado com base em estudos anteriores usando campos eletromagnéticos de baixa frequência (50 Hz, 1 mT) em camundongos C57BL/6 sob condições experimentais^{semelhantes 20,21}. O WB-MS foi realizado usando um dispositivo de magnetoterapia pulsada (Dhan 1000, unidade de magnetoterapia) que gerou um campo magnético sinusoidal alternado de 10 Gauss (1 mT) a 50 Hz. Para as sessões de estimulação, os camundongos permaneciam alojados individualmente em suas gaiolas domésticas, que eram colocadas entre duas placas eletromagnéticas em lados opostos de cada gaiola. Para evitar interferência no campo magnético, componentes metálicos, incluindo a gaiola de arame, a grade e a garrafa de água, foram temporariamente removidos durante a estimulação. Esse sistema permitiu que os animais se movessem livremente durante todo o procedimento, sem restrições ou estresse adicional.

Para garantir consistência experimental, manuseio idêntico e condições ambientais foram mantidas tanto durante as sessões de estimulação quanto de não estimulação. Durante as sessões de controle (dias 15–21), as placas magnéticas foram posicionadas de forma idêntica, mas permaneceram inativas, controlando assim os possíveis efeitos do manuseio, manipulação da gaiola, ruído ambiental ou posicionamento eletromagnético das placas.

A WB-MS consistiu em exposições diárias de 20 minutos, das 15h40 às 16h, durante sete dias consecutivos (dias 22–28 do protocolo experimental), imediatamente antes do período de avaliação da compulsão alimentar (16h00–18h). Dos dias 29 a 35, os camundongos foram novamente submetidos a sessões sem estimulação, após as quais sua ingestão alimentar foi avaliada.

Coleta de tecido adiposo

Ao final do protocolo experimental (dia 36, 8h), tecido adiposo foi coletado de todos os grupos experimentais. O SG era composto por três mulheres e dois homens (n = 5), o CG por três fêmeas e três machos (n = 6), e o IG por três fêmeas e quatro machos (n = 7). Todos os animais foram anestesiados com cetamina (60 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg⁾²², e a ausência de resposta nociceptiva à estimulação pelo beliscão dos dedos confirmou profundidade adequada de anestesia. Foi então realizada uma incisão ventral na linha média usando uma lâmina de bisturi nº 3, estendendo-se pelas regiões subcostais, inguinais e médias do abdome, seguida por uma suave retração lateral da pele para expor a cavidade abdominal.

Depósitos de tecido adiposo gonadal, retroperitoneal e subcutâneo foram cuidadosamente identificados, dissecados e excisados sob condições padronizadas para minimizar a variabilidade entre amostras. Imediatamente após a dissecação, os tecidos foram pesados usando uma balança analítica calibrada (capacidade máxima 220 g, legibilidade 0,1 mg), previamente verificada conforme as especificações do^{fabricante 23}. Todas as amostras foram processadas sob condições idênticas entre os grupos para garantir consistência experimental.

Preparação do tecido cerebral e imunofluorescência

Os ratos foram eutanasiados 90 minutos após a última sessão de consumo^{alimentar 24}. Cérebros foram coletados após perfusão intracardíaca com 4% de paraformaldeído e posteriormente processados para análise histológica. As seções coronárias cerebrais (30 μm) foram obtidas usando um criostato mantido a −18 °C e armazenado em PBS contendo azida de sódio até o processamento. Um subconjunto de animais machos de cada grupo experimental foi alocado à preparação do tecido cerebral para análises de imunofluorescência (SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), enquanto os demais animais foram usados para coleta de tecido adiposo. Essa alocação diferencial foi determinada a priori com base em requisitos metodológicos, já que a perfusão intracardíaca com paraformaldeído resulta em fixação do tecido incompatível com a colheita subsequente do tecido adiposo devido à perturbação da integridade do tecido adiposo. Portanto, a distribuição da amostra era orientada exclusivamente por restrições técnicas e era independente da atribuição experimental de grupos ou dos resultados biológicos.

Para imunofluorescência c-Fos, as cênicas foram incubadas por 72 horas com um anticorpo monoclonal anti-c-Fos de camundongos (1:1000, sc-166940) diluído em PBS contendo 0,25% de gelatina de pele suína e 0,5% de Triton X-100, que serviu como solução de bloqueio e permeabilização. A incubação primária de anticorpos foi realizada por 24 horas em temperatura ambiente, seguida por 48 horas a 4 °C. Após a incubação, as seções foram cuidadosamente enxagueadas em PBS e incubadas por 2 horas com um anticorpo secundário anti-camundongo policlonal donkey (Alexa Fluor 488-conjugado, 1:500, AB_2338840) diluído na mesma solução. Por fim, as seções eram montadas em slides de vidro usando meio de montagem.

Aquisição e quantificação de imagens

A imagem confocal foi realizada usando um microscópio equipado com um laser de 488 nm e uma lente objetiva de 20x. As imagens Z-stack eram adquiridas usando o software NIS-Elements C e armazenadas sob identificadores codificados para análise cega. A quantificação dos núcleos c-Fos positivos foi realizada usando ImageJ (ImageJ 2.9.0 / 1.53t). Apenas núcleos totalmente contidos foram incluídos nas contagens, e uma abordagem baseada em quadrantes foi aplicada para evitar a contagem dupla de células individuais. Para cada animal, uma imagem foi adquirida de cada uma das três seções imunocoloradas independentes, usando parâmetros de aquisição idênticos em todos os grupos experimentais. O número de núcleos c-Fos positivos foi quantificado individualmente para cada imagem, e os valores obtidos das três seções correspondentes ao mesmo animal foram somados. Esse valor total foi posteriormente normalizado para a área total analisada e expresso como densidade c-Fos (núcleos positivos/mm²). O esquema geral dos procedimentos experimentais utilizados está ilustrado na Figura 1A–H.

Figura 1: Desenho experimental e linha do tempo do protocolo de compulsão alimentar e intervenção em BM-EM. (A) mostra uma imagem representativa de um camundongo indicando as condições iniciais de moradia. Um total de 30 camundongos (9 fêmeas e 21 machos) foram alojados individualmente em gaiolas caseiras a partir de P30 e passaram por um período de habituação de 1 semana. (B) ilustra as condições alimentares implementadas ao longo do protocolo de compulsão alimentar do dia 1 ao dia 35 experimental. O grupo controle tinha acesso ad libitum a comida e água padrão. Grupos de acesso contínuo tinham acesso ad libitum a comida padrão, água e alimentos palatáveis. Grupos de acesso intermitente tinham acesso improvisado a comida e água padrão. Ao mesmo tempo, alimentos palatáveis eram fornecidos apenas às segundas, quartas e sextas-feiras, das 16h às 18h (C), o que indica que, dos dias 15 ao 21, os animais continuaram sob as mesmas condições alimentares, enquanto placas magnéticas de estimulação foram colocadas sob as gaiolas sem fornecer estimulação (exposição simulada). (D) mostra que, dos dias 22 a 28, a WB-MS foi administrada 20 minutos antes da exposição alimentar palatável, mantendo as condições alimentares correspondentes para cada grupo. (E) indica que dos dias 29 a 35, o WB-MS foi interrompido, embora as condições alimentares tenham permanecido inalteradas. (F) mostra que os cérebros foram coletados no dia pós-natal 72 (P72), seguidos pela coleta de tecido adiposo no dia pós-natal 73 (P73). (G) ilustra a secção cerebral usando um criostato e procedimentos imunohistoquímicos. Por fim, (H) mostra a análise por microscopia confocal da imunorreatividade do c-Fos. As imagens foram criadas pelos autores usando o Biorender, e uma licença adequada foi obtida. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas usando a versão 25 do SPSS. Como a distribuição normal não pôde ser assumida, testes não paramétricos foram usados ao longo de todo o estudo. As diferenças entre o SG, CG e IG foram avaliadas usando o teste de Kruskal–Wallis. Comparações repetidas dentro de cada grupo experimental foram analisadas usando o teste de Friedman, seguidas por testes de múltipla comparação quando apropriado. Devido ao tamanho limitado das amostras para certos desfechos experimentais, especialmente em fêmeas (n = 3 por grupo), dados de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foram agrupados para as análises apresentadas nas Figuras 2, Figura 3 e Figura 4 , para melhorar a robustez estatística e apoiar uma avaliação exploratória dos desfechos experimentais. Além disso, dados combinados de ingestão semelhante a compulsão compulsiva de camundongos machos e fêmeas C57BL/6 foram analisados usando uma ANOVA bidirecional, seguidos por testes de múltiplas comparações para avaliar os efeitos do grupo experimental e do tempo durante todo o protocolo de alimentação, incluindo a semana de estimulação WB-MS. A significância estatística foi definida como p ≤ 0,05.

Resultados

Durante a compulsão alimentar, os participantes dos grupos de acesso intermitente (IMG para homens, IFG para mulheres) apresentaram ingestão calórica significativamente maior do que os dos grupos padrão (SFG e SMG) e contínuos (CFG e CMG) nos dias 15, 17 e 19 (teste de Kruskal-Wallis; p < 0,05; Figuras 2A–B). O WB-MS foi administrado com intensidade de 1 mT e frequência de 50 Hz por 20 minutos por dia ao longo de sete dias consecuti...

Discussão

Os achados atuais sugerem que a WB-MS pode modular transitoriamente o comportamento semelhante à compulsão alimentar em um modelo murino induzido pelo acesso intermitente a alimentos palatáveis. Embora nenhuma mudança significativa na atividade neuronal tenha sido detectada no NAc, a ingestão de alimentos palatáveis diminuiu progressivamente ao longo das sessões de acesso intermitente durante o período de estimulação, culminando em uma diminuição significativa durante a última sessão de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ImageJ	imagej.net	Domínio Público, BSD-2	Software. Programa de processamento de imagem baseado em Java. Desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde e no Laboratório de Instrumentação Óptica e Computacional (LOCI, Universidade de Wisconsin)
Coverslips	Corning	2935	Vidro de cobertura 24 x 50 mm (Espessura 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	Anticorpo secundário policlonal de jumento anti-rato
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	Comida padrão. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composição%20do%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	Cryostat para histologia de rotina.
M&Ms 43.8g (Embalagem marrom)	M&M´s	NA	Comida saborosa. Conteúdo nutricional por 100: 480 kcal, 19 g de gordura, 70 g de carboidratos, 5,1 g de proteína, 0,13 g de salIngredientes: açúcar, massa de cacau, leite em pó desnatado, manteiga de cacau, lactose, amido, gordura do leite, gordura de palma, xarope de glicose, gordura de karité, estabilizador (goma arábica), dextrina, agentes de cobertura (cera de abelha, cera de carnaúba), corantes (E100, carmim, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), concentrado de beterraba, emulsificantes (lecitina de soja, E445), sal, aromatizantes, óleo de palmiste, antioxidante (E306). (Pode conter: amendoim, avelã, amêndoa). Chocolate ao leite contém sólidos de leite 14% no mínimo. Chocolate ao leite contém gorduras vegetais além da manteiga de cacau.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	Dispositivo de magnetoterapia pulsada
PBS	MEYER	Monobásico 2415. Dibásico 2410.  NaCl S3014	Monohidrato de Fosfato de Sódio Monobásico. Fosfato de Sódio Dibásico hepta-hidratado. Cloreto de Sódio cristalino grau molecular de biologia.
Nikon Microscope	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	Microscópio Confocal
Gaiola para ratos em policarbonato	Orchid Scientific	EM01	Gaiola de policarbonato não ferromagnética usada para exposição WB-MS, totalmente transparente e autoclave (373 x 190 x 138 mm).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	Solução injetável de cetamina
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	Solução injetável de xilazina
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	Anticorpo monoclonal de rato anti-c-Fos
Balança de laboratório	Sartorius		Balança analítica
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	Meio de montagem antifade é especialmente formulado para preservar sinais de fluorescência na microscopia de imunofluorescência (IF) minimizando o fotobranqueamento.
Lâminas de vidro	VELAB	VE-P30	Lâminas de vidro para microscópio Frisadas de um lado 26 x 76 mm (Espessura 0.8–1.1 mm)
Azida de sódio		K 6048.0100	99% Azida de sódio