Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Resumo

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de >90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Resumo

Células-tronco derivadas do adiposo (ADSCs) emergiram como células semente ideais na medicina regenerativa devido às suas fontes abundantes, colheita minimamente invasiva, potencial de diferenciação multilinhagem e propriedades imunomoduladoras. Suas aplicações abrangem reparo de tecidos, modelagem de doenças e terapia celular; no entanto, o isolamento eficiente de ADSCs de alta viabilidade continua sendo fundamental para o avanço da pesquisa e da tradução clínica. Métodos convencionais de isolamento, como a digestão enzimática combinada com dissociação mecânica via pipeteamento, são limitados por longos tempos de processamento (1–3 h), baixa viabilidade celular (frequentemente <70%) e variabilidade substancial de lote para lote, comprometendo experimentos posteriores.

Aqui, apresentamos o sistema SoniConvert (um sistema mecânico de separação celular baseado em ondas), que combina digestão mecânica por ondas e enzimática para enfrentar esses desafios. O sistema integra uma unidade de controle baseada em microprocessador que regula a dissociação mecânica mediada por ondas via feedback digital, juntamente com um reagente de soltura específico para tecido, otimizado para tecido adiposo (incubação de 5 a 15 minutos). Essa abordagem permite a conversão rápida do tecido para uma suspensão unicelular, com dissociação mecânica completada em 3–9 segundos.

O sistema oferece três vantagens: (1) processamento ultra-rápido, com o processo de isolamento do núcleo — desde a digestão enzimática até a separação inicial da fração celular — concluído em aproximadamente 30 minutos (>90% de redução em comparação com métodos convencionais); (2) alta preservação de viabilidade, com coloração com azul de tripano confirmando a viabilidade celular de 80–95%, superando os protocolos tradicionais; e (3) ampla compatibilidade, pois as suspensões unicelulares resultantes atendem aos requisitos de cultura celular primária, citometria de fluxo, ensaios de citotoxicidade e construção de organoides adiposos. Ao reduzir o tempo de processamento, melhorar a integridade celular e limitar a variabilidade, esse sistema oferece uma plataforma prática para pesquisas relacionadas ao adipo.

Introdução

Células-tronco derivadas de gordura adiposa (ADSCs), um subconjunto crítico de células-tronco mesenquimatosas (MSCs) isoladas do tecido adiposo, exibem potencial terapêutico substancial devido à sua acessibilidade, colheita minimamente invasiva, robusta capacidade proliferativa, potencial de diferenciação multilinhagem e potentes propriedades paracrinas e^{imunomoduladoras} 1,2,3,4 . Esses atributos posicionaram os ADSCs como candidatos promissores para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e imunoterapia. No entanto, a utilidade translacional dos ADSCs depende da capacidade de isolar populações funcionalmente intactas e de alta pureza — um processo que continua tecnicamente desafiador. A biologia única do tecido adiposo introduz dois obstáculos principais: (1) o alto teor lipídico dos adipócitos os torna propensos a rompimento durante o processamento mecânico, liberando lipídios livres que contaminam a fração vascular estromal (SVF) e comprometem a viabilidade e rendimento celular ^5,6; e (2) a complexidade estrutural do tecido, que compreende fáscia, células endoteliais, células imunes e componentes^{sanguíneos 7}, complica a separação das células derivadas do adipo. Essas limitações ressaltam a necessidade urgente de um método eficiente, rápido e que preserve a viabilidade para isolar ADSCs e adipócitos de alta qualidade, que são igualmente críticos para aplicações posteriores, como modelagem metabólica de doenças e terapias baseadas em células.

Vários métodos estabelecidos estão atualmente disponíveis para isolar células derivadas do adipo, incluindo digestão enzimática, cultura explant e separação^{mecânica 8,9,10}. A digestão enzimática, a abordagem mais amplamente adota, utiliza colagênase para degradar componentes da matriz extracelular (ECM), liberando células-tronco encapsuladas. Esse método normalmente envolve a trituração de tecidos, digestão de colagênase (37 °C, 1–2 h), isolamento de SVF por centrifugação e purificação em cultura aderente. Embora eficaz para a quebra da MEC, a digestão enzimática apresenta desvantagens notáveis: tempo de processamento prolongado (3–4 horas no total), dependência de grandes volumes de amostras e riscos de citotoxicidade enzimática ou variabilidade de lote para lote devido a colagènases de origem animal — todos os quais dificultam a tradução clínica. A cultura explantada, que aproveita a migração de células-tronco a partir de fragmentos de tecido, produz células com viabilidade preservada, mas sofre de baixo rendimento e recuperação celular atrasada (7–10 dias). A dissociação mecânica, que depende de perturbações físicas (por exemplo, oscilação, cisalhamento), reduz o tempo de processamento, mas frequentemente compromete a integridade celular, levando à redução da viabilidade e à contaminação de populações. Coletivamente, esses métodos falham em conciliar eficiência, pureza e viabilidade — critérios críticos para isolamento celular de grau clínico. Assim, propomos um método inovador para isolar células derivadas do adipó (adipócitos e ADSCs) que combina digestão enzimática com dissociação mecânica mediada por^{ondas 11}. Essa abordagem alcança dois avanços principais: (1) eficiência temporal: ao combinar cocktails enzimáticos pré-otimizados e livres de animais com ondas mecânicas de baixa frequência, o tempo total de processamento é reduzido de 3–4 horas para ~30 minutos (Figura 1); (2) Preservação da viabilidade: A dispersão mecânica suave minimiza a ruptura de adipócitos e a liberação de lipídios. Importante destacar que o período de 30 minutos refere-se ao fluxo de trabalho central de isolamento (digestão, dissociação mecânica, filtragem e centrifugação inicial) para obter frações brutas de adipócitos e SVF; etapas opcionais de purificação a jusante, como a lise de glóbulos vermelhos (RBC), exigem tempo adicional de manuseio.

Nosso método otimizado de isolamento de células adiposas demonstra potencial significativo para aplicação em múltiplos domínios de pesquisa e clínicos. Na pesquisa fundamental, as células de alta viabilidade obtidas exibem desempenho excepcional em estudos de diferenciação adipogênica e osteogênica, fornecendo uma fonte celular confiável para aplicações de engenharia de tecidos. Na medicina translacional, estudos clínicos demonstraram o potencial terapêutico dos ADSCs no tratamento de condições como osteoartrite¹², doenças^{cardiovasculares 13}, esclerose^{múltipla 14} e doença inflamatória intestinal (DII)/doença de Crohn¹⁵. Os ADSCs rapidamente isolados servem como blocos ideais para construir organoides de tecido adiposo e implementar aplicações de terapia celular, avançando significativamente a triagem de medicamentos e a pesquisa em modelagem de doenças. Além disso, suspensões de célula única de alta qualidade são adequadas para sequenciamento de RNA de célula única. Em conclusão, essa abordagem integrada estabelece uma plataforma tecnológica robusta para o tecido adiposo, apoiando tanto a pesquisa básica quanto a tradução clínica em medicina regenerativa.

Protocolo

Todas as pesquisas com animais foram conduzidas de acordo com o Regulamento para a Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais (Ministério da Ciência e Tecnologia, China, revisado em março de 2017), e aprovadas pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da Universidade Agrícola de Sichuan (Permissão: 20230089). Esse protocolo requer o uso do sistema SoniConvert, um dispositivo comercialmente disponível para dissociação mecânica assistida por ondas de tecidos (doravante chamado de sistema de dissociação mecânica). O protocolo é otimizado para tecido adiposo suíno, e sua dependência desse equipamento especializado é uma limitação fundamental.

1. Coleta e preparação do tecido adiposo

1. Desinfecção pré-operatória e depilação
   1. Eutanasiar o porco por overdose intravenosa de pentobarbital sódico (100 mg/kg de peso corporal). Confirme a morte antes da coleta do tecido.
   2. Aplique gaze estéril embebida em iodóforo a 2% para desinfecção em espiral do dorso suíno, estendendo-se 15 cm a partir da linha média. Deixe secar por 30 segundos.
   3. Use uma lâmina estéril para raspar o pelo de uma área de 16 cm × 8 cm. Certifique-se de que todos os pelos da área operatória sejam removidos.
   4. Limpe a parte de trás duas vezes com etanol 75% usando gaze estéril.
2. Coleta de tecido adiposo
   1. Faça uma incisão transversal de 20 cm ao longo da linha média dorsal com um bisturi estéril.
   2. Levante a borda da incisão com pinças estériles. Dissecar ao longo do plano natural entre o tecido adiposo e a derme para obter uma camada superior completa de tecido adiposo subcutâneo dorso (ULB) com aproximadamente 2–3 mm de espessura.
   3. Enxágue o ULB uma vez em soro sorológico estéril gelado e coloque-o em um recipiente de cultura estéril (Figura 2).

Figura 2: Coleta de ULB de porco para isolamento celular. (A) Ilustração da estrutura do tecido adiposo das costas do porco; (B) Local de corte do minipig Bama; (C) Apresentação do tecido adiposo das costas, a camada adiposa subcutânea das costas de porco contém duas camadas, a camada superior (ULB) e a camada interna (ILB); (D) Coletou o ULB. Abreviação: ULB = camada superior das costas; ILB = camada interna das costas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Ponto de pausa: O tecido adiposo coletado pode ser mantido em solução soro fisiológica estéril gelada ou solução de D-Hanks a 4 °C por um curto período antes de uma dissecação adicional.
NOTA: O objetivo é coletar a ULB. Evite incluir a camada inferior do tecido adiposo subcutâneo das costas (ILB) durante a dissecação.

3. Dissecação e limpeza do tecido adiposo
   1. Adicione 10 mL de D-Hanks Buffer gelado para cada 1,8 g de papel de papel na panela e certifique-se de que o tecido esteja totalmente submerso.
   2. Identifique e retire todos os vasos sanguíneos visíveis do tecido usando tesouras cirúrgicas estériles. Remova qualquer tecido conjuntivo e componentes fibróticos. Descarte os materiais excisados em recipientes designados para riscos biológicos.
      NOTA: Use extremo cuidado ao manusear instrumentos afiados; Sempre corte do corpo e descarte as lâminas e tesouras usadas em recipientes para objetos cortantes imediatamente após o uso.
   3. Enxágue o tecido dentro do D-Hanks Buffer para remover sangue residual e detritos.
      NOTA: Para amostras com hematoma excessivo, substitua o tampão 1–3 vezes conforme necessário para obter clareza visual. Mantenha todas as etapas de dissecação no gelo para preservar a viabilidade do tecido.
4. Dissociação mecânica do tecido adiposo
   1. Transfira 1,8 g dos fragmentos de tecido enxaguados para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 800 μL do Buffer de Dissociação de Tecidos do Tipo A (A-Buffer) ao tubo.
   2. Usando tesouras oftálmicas estéreis, triture o tecido do tubo em pequenos pedaços de aproximadamente 1–2^{mm 3} de tamanho.
      NOTA: Se for observado vazamento lipídico significativo durante ou após a trituração, lave novamente o tecido com 1 mL de solução pré-resfriada de D-Hanks antes de iniciar a digestão enzimática para remover lipídios de adipócitos quebrados. Essa etapa preserva a integridade dos adipócitos para análise a jusante.

2. Isolamento celular e homogeneização

1. Processamento enzimático
   1. Adicione 200 μL do Agente de Dissociação de Tecidos do Tipo A (Solução do Tipo A) a um novo tubo de microcentrífuga. Gire e agite suavemente o tubo à mão 3 vezes para misturar o conteúdo e garantir que os fragmentos adiposos estejam totalmente imersos na solução de dissociação.
   2. Verifique se a tampa do tubo está bem fechada. Coloque o tubo em um banho metálico a 37 °C e incube por 5 a 10 minutos.
      NOTA: Monitore a solução até que ela fique turva e os fragmentos de tecido pareçam parcialmente digeridos. A Solução do Tipo A contém colagênase e protease neutra. Use luvas de nitrila, jaleco de laboratório e óculos de proteção ao manusear. Evite contato com a pele; Se houver exposição, enxágue imediatamente com água abundante por 15 minutos. O A-Buffer não será descartado após adicionar a Solução do Tipo A.
2. Dissociação mecânica assistida por ultrassônico
   1. Transfira os fragmentos de tecido adiposo parcialmente digeridos junto com o tampão ao redor do tubo da microcentrífuga para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL designado para o sistema de dissociação mecânica.
   2. Execute o programa pré-definido para o tecido adiposo no sistema de dissociação mecânica para realizar a dissociação mecânica usando uma onda senoidal de 200 Hz.

3. Filtração para obter uma suspensão de célula única

1. Filtração e centrifugação
   1. Colete a suspensão celular e passe-a por um filtro de célula de 200 μm para um novo tubo centrífugo de 50 mL para remover grandes detritos e aglomerados de tecido não digeridos.
   2. Adicione 5 mL de solução D-Hanks pré-resfriada (4 °C) ao peneirador. Enxágue o coador com a solução D-Hanks duas vezes para maximizar o rendimento da célula.
   3. Centrifuge a suspensão filtrada a 500 × g por 5 minutos a 4 °C.
      Ponto de pausa: Após a centrifugação, a suspensão da célula pode ser processada imediatamente ou mantida no gelo por um curto período antes da separação da camada.
   4. Coleta de adipócitos: Para coletar os adipócitos, aspire e descarte a camada lipídica sobrenadante usando uma pipeta pasteur estéril, deixando 1 mL de tampão para proteger a camada de adipócitos. Colete a segunda camada para análise a jusante dos adipócitos. Evite perturbar a terceira e a quarta camadas.
   5. Coleta de SVF (fração vascular estromal): Após remover as camadas superiores, ressuspenda suavemente o pellet inferior contendo a fração vascular estromal (SVF) em 1 mL de D-Hanks/PBS. Ressuspenda suavemente o pellet celular em 1 mL de D-Hanks/PBS para alcançar uma concentração celular de 2–5 × 10⁶ células/mL.
      NOTA: Idealmente, quatro camadas podem ser observadas após a centrifugação: a camada lipídica no topo; a segunda camada contém adipócitos; a terceira é a camada tampão hidrofílica; e a camada inferior é a SVF, que contém células-tronco (Figura 1).
2. Lisis dos glóbulos vermelhos
   1. NOTA: Se o pellet celular apresentar uma cor vermelha significativa, indicando contaminação por glóbulos, realize a lise dos glóbulos vermelhos.
      Ressuspenda o pellet celular em 1–3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) usando uma pipeta P1000 com pontas de largura larga. Incube no gelo por 15 minutos com mistura ocasional.
   2. Pré-resfrie todas as soluções e rotores da centrífuga a 4 °C para minimizar a atividade metabólica durante o processamento.
   3. Centrifuge a 500 × g por 10 minutos a 4 °C. Aspire completamente o sobrenadante.
   4. Lave as células novamente ressuspendendo o pellet em 5 mL de solução pré-resfriada de D-Hanks e centrifuge a 500 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
3. Resuspensão final
   1. Resuspenda o pellet da célula final em D-Hanks/PBS para aplicações posteriores.

4. Aplicações e análise a jusante

1. Viabilidade das células SVF e avaliação do rendimento celular
   1. Prepare a suspensão da célula SVF obtida em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha a suspensão no gelo até o uso.
   2. Misture 10 μL da suspensão da célula SVF com 10 μL de solução de Trippan Blue 0,4% em um tubo estéril de microcentrífuga de 0,5 mL. Pipete suavemente para cima e para baixo 3 vezes para garantir uma mistura uniforme.
      NOTA: A concentração final de Trippan Blue na mistura é de 0,2%. Evite introduzir bolhas de ar durante a mistura, pois podem interferir na contagem automática de células.
      Transfira 10 μL da mistura de células coradas para uma lâmina de contagem apropriada para o Contador Automático de Células. Certifique-se de que a amostra preencha completamente a câmara sem transbordar.
   3. Insira o slide de contagem no Contador de Células. Selecione o tipo de ensaio Trypan Blue e ajuste a faixa de concentração celular, se necessário.
   4. Pressione o botão Contar para iniciar a contagem automática de células. O instrumento capturará imagens da câmara de contagem e automaticamente distinguirá células vivas de células mortas.
   5. Registre a porcentagem de viabilidade das células e conte o número total de células viáveis exibidas na tela do instrumento. Realize três medições independentes para cada amostra e calcule a viabilidade média e o rendimento celular por grama de tecido adiposo.
      NOTA: Limpe a lâmina de contagem e a porta de carregamento do instrumento com etanol 70% após cada uso para evitar contaminação cruzada entre amostras.
2. Observação da morfologia dos adipócitos
   1. Tinga os adipócitos isolados com 5 μg/mL de Hoechst para núcleos e 1 μM de BODIPY para lipídios em D-Hanks/PBS por 15 minutos a 37 °C.
      Ponto de pausa: Após a coloração, as amostras devem ser capturadas prontamente; se necessário, podem ser mantidas protegidas da luz a 4 °C por um curto período antes da microscopia.
   2. Use um sistema de vidro com cobertura de lâminas amigável aos adipócitos para preparação das lâminas, evitando a compressão das células.
   3. Observe os núcleos (corados com Hoechst) e as gotículas lipídicas (coradas com BODIPY) sob um microscópio de fluorescência.
      NOTA: Devido ao grande tamanho (20–300 μm) e ao alto teor de lipídios, os adipócitos são frágeis, tendem a flutuar e se empilham em múltiplas camadas, tornando os métodos convencionais de montagem inadequados para observação microscópica clara (Figura 3A). Para resolver isso, foi desenvolvido um sistema de montagem caseiro amigável aos adipócitos, utilizando slides e coverslips padrão (Figura 3B).
3. Purificação dos componentes vasculares estromais e observação morfológica de ADSCs
   1. Semear o SVF recém-isolado em um frasco de cultura celular T25 contendo 5 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Após 48 horas, lave suavemente o frasco duas vezes com PBS pré-aquecido para remover células não aderentes. Adicione um fresco de cultivo e continue a incubação.
   3. Substitua o meio de cultivo a cada 2–3 dias. Monitore a morfologia celular e a confluência sob um microscópio invertido.
   4. Quando as células atingem 80–90% de confluência (tipicamente após 7–10 dias), separe-as usando 0,25% de tripsina-EDTA por 3–5 minutos a 37 °C. Neutralize com meio de cultivo e colete a suspensão celular.
   5. Realize a coloração com Trippan Blue para detectar a viabilidade da célula antes da detecção e triagem do FACS.
   6. Observe a morfologia dos ADSCs purificados e cultivados sob um microscópio óptico.
   7. Filtre a suspensão das células coletadas por uma peneira de 70 μm para remover quaisquer agregados restantes. Resuspenda as células em PBS contendo 2% de FBS para análise FACS.
   8. Tinga as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra CD73, CD90, CD11b e CD45 por 30 minutos a 4 °C no escuro.
   9. Lave as células duas vezes com tampão de coloração e resuspenda em PBS contendo 2% de FBS.
   10. Realize análise citométrica de fluxo usando um bico de 70 μm a 20 psi e uma vazão abaixo de 3,0.
   11. Exclua detritos celulares por meio de controlo na população principal usando parâmetros de área de dispersão frontal (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A).
   12. Remover doublets por meio de FSC-A versus FSC-H gating e selecionar a população viável de singlets para análise a jusante.
   13. Analise células com base na expressão dos marcadores de superfície. Use CD73 e CD90 como marcadores positivos e CD11b e CD45 como marcadores negativos para verificar o fenótipo ADSC.
   14. Observe a morfologia dos ADSCs enriquecidos e cultivados sob um microscópio óptico. Morfologia característica em forma de fuso, semelhante a fibroblasto, indica enriquecimento bem-sucedido do ADSC.
4. Diferenciação adipogênica ADSC
   1. Semear a terceira geração de ADSCs com densidade de 1 × 10⁴ células/^{cm 2}. Quando a confluência celular atinge aproximadamente 90%, inicia a indução adipogênica.
   2. Prepare o meio de indução adipogênico usando o meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com alta glicose, que contém 10% de soro fetal bovino (FBS), 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 10 μg/mL de insulina e 1 μM de rosiglitazona.
   3. Após 3 dias de indução, substitua o meio por meio de manutenção e troque a solução a cada 2 dias.
   4. Após 14 dias de indução, tinga as células com óleo vermelho O e observe as gotículas lipídicas sob um microscópio invertido.
5. Diferenciação osteogênica ADSC
   1. Quando a confluência celular atinge 80–90%, inicie a indução osteogênica. Formule o meio de indução osteogênico com DMEM de alta glicose que contenha 10% de FBS, 10 mM β-glicerfosfato, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 μM de calcitriol e 1 μM de dexametasona.
   2. Troque o meio a cada 2–3 dias e continue o processo de indução por aproximadamente 14 dias.
   3. Tinga as células com 2% de Alizarina Vermelha S (pH 5,2) e observe-as sob um microscópio invertido.
6. Construção e identificação de organoides
   1. Prepare uma suspensão de ADSCs em célula única em meio de cultura completo e ajuste a concentração celular para 2 × 10⁴ células/20 μL.
   2. Inverta a tampa de um prato de cultura de 100 mm e despeje gotas de 20 μL da suspensão da célula na superfície interna da tampa.
   3. Adicione PBS estéril no fundo do recipiente para manter a umidade, cubra cuidadosamente a tampa e incube as gotas penduradas em condições padrão de cultura.
   4. Observe as gotas diariamente e permita que as células se agreguem e formem esferoides por 6 dias.
   5. Recolha os esferoides delicadamente usando uma pipeta e transfira-os para um Matrigel pré-gelado sobre gelo.
   6. Incorpore os esferoides no Matrigel e coloque a mistura em placas de cultivo antes de incubá-la sob condições padrão de cultura.
   7. Substitua o meio regularmente e monitore o crescimento dos organoides até os dias 18–28, quando as estruturas se tornam compactas e maduras.
   8. Fixe os organoides com 4% de paraformaldeído, permeabilize-os com 0,1% de Triton X-100 e bloqueie a ligação inespecífica com 5% de BSA.
   9. Incube as amostras com anticorpos primários contra CD73, CD90, CD11b e CD45, e então incube-as com os correspondentes anticorpos secundários fluorescentes.
   10. Tinga os organoides com Hoechst e BODIPY para visualizar núcleos e gotículas lipídicas, respectivamente, e observe as amostras coradas sob um microscópio de fluorescência.
       NOTA: Realize a separação celular e todas as manipulações envolvendo culturas abertas, incluindo semeadura, alimentação e preparação de coloração, sob condições assépticas rigorosas em um gabinete de biossegurança.

Resultados

Figura 1: Ilustração esquemática do processo de isolamento de células derivadas da adiposa. O diagrama retrata o método tradicional e o método atual como fluxos de trabalho ilustrativos. Três etapas principais estão envolvidas no isolamento de células derivadas do adipo: a primeira é o pré-tratamento; a segun...

Discussão

O presente estudo apresenta uma abordagem integrada inovadora para isolar células derivadas do adiposo (principalmente adipócitos e ADSCs) que aborda limitações críticas dos métodos convencionais. Ao combinar afrouxamento enzimático específico do tecido com dissociação mecânica por ondas de precisão, esse sistema alcança rápida (tempo total de processamento ~30 min), alta viabilidade (80–95%) e isolamento celular reprodutível.

A digestão enzimática convenciona...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Dissociação de Tecidos do Tipo A	Docsense	TM001	Contém o Agente de Dissociação Tecidual Tipo A (Solução Tipo A) e o Buffer de Dissociação Tecidual Tipo A (A-Buffer).
Kit de Meio de Diferenciação Adipogênica	OriCell	GUXMD-90031	Usado para diferenciação adipogênica, incluindo o meio Eagle's modificado (não modificado) de Dulbecco com alta glicemia, e meio de manutenção
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Coloração mineralizada para diferenciação osteogênica (pH 5,2)
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Ácido L-ascórbico, cultura celular testada, para indução osteogênica
Bama minipigs	Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd		Animais machos, de um ano, grau SPF, mantidos sob procedimentos padronizados de vacinação, desparasitação e limpeza. https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Contador Automático de Células Bio-Rad TC20	Laboratórios Bio-Rad	1450011	Contador automático de células para avaliação de viabilidade e rendimento
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Corante lipídico neutro
BSA (5%)	Sigma-Aldrich	A9418	Albumina sérica bovina, pó liofilizado, para bloqueio
Calcitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1&alfa;,25-Dihidroxivitamina D3, para indução osteogênica
Peneira de células (70 & mu; m)	Corning	352350	Falcon 70 & mu; Filtro de células M, estéril, para preparação de amostras FACS
Filtro de células (200 & mu; m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStrainer, tela PET, encaixa tubos de 50 mL, estéreis e nbsp;
tubo de centrífuga (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL tubo cônico de alta clareza, estéril, polipropileno
Slide de contagem (para Bio-Rad TC20)	Laboratórios Bio-Rad	1450011	Slide de contagem de câmaras duplas para contador automático de células TC20 & nbsp;
Prato de cultura (100 mm)	Corning	430167	Prato de poliestireno estéril, para formação de organoides de gotas penduradas
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902	≥ 98%, para indução adipogênica e osteogênica
Solução Salina Balanceada de D-Hanks ou PBS	Gibco	10010015	Pré-resfriado a 4 °C; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Essa é usada para cultivo de SVF isolado fresco
DNase I	Beyotime	D7073	Opcional, recomendado se houver aglomeração.
etanol	Sigma-Aldrich	459836	75% para desinfecção superficial.
Soro Bovino Fetal (FBS)	Gibco	A4736201	Sistema Tet aprovado, origem americana, estéril e nbsp;
Citômetro de Fluxo	BD em Biociências	BD FACSCanto II	3 lasers (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 canais de fluorescência, para análise de marcadores de superfície (CD73, CD90, CD11b, CD45), atende a 70 meu requisito de bocal a 20 psi
Microscópio de fluorescência	Olympus		Modelo invertido ou vertical capaz de conjuntos de filtros FITC e DAPI.
Anticorpos secundários fluorescentes	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (anti-rato), A-11008 (anti-coelho)	Alexa Fluor conjugada, para imunofluorescência
Anticorpos conjugados com fluorocromo (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD em Biociências	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Para análise citométrica de fluxo do fenótipo ADSC
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Coloração nuclear para avaliação de células vivas/mortas.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ 99% (HPLC), para meio de indução adipogênica
Solução fisiológica estéril gelada	Baxter	2F7124	Injeção de Cloreto de Sódio 0,9%, USP, para enxágue de tecido
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Recombinante, expresso em leveduras, para indução adipogênica
Iodofor	Sigma-Aldrich	25104	Solução desinfetante 2%.
Matrigel	Corning	354230	Fator de crescimento reduzido, sem fenol vermelho, para embutição de esferoides
Banho de Metal	Servicebio	SMB-H	Usado para incubação a 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Coloração lipídica para diferenciação de adipócitos
Microscópio óptico	Olympus		Microscópio padrão de campo claro com 10x– 40x objetivos.
Kit de Médio de Diferenciação Osteogênica	OriCell	GUXMD-90021	Usado para diferenciação osteogênica, incluindo o médio Eagle's modificado (não modificado) de Dulbecco com alta glicose, e meio de manutenção
Pipeta P1000 com pontas de grande diâmetro	Beckman Coulter	B01113	Pontas de diâmetro largo do Biomek P1000 Span-8, estéreis
Paraformaldeído (4%)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Solução aquosa, para fixação de organoides
Pipeta pasteur	Corning	7095S-5C	Estéril, descartável.
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070063	10.000 U/mL penicilina, 10.000 e mu; g/mL estreptomicina, estéril
Pentobarbital sódico	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Injetável, para eutanásia (100 mg/kg de peso corporal, intravenosa). ANDA 203619
Anticorpos primários (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD em Biociências	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Para imunocoloração organoide
Tampão de Lise de Glóbulos Vermelhos (RBC)	Solarbio	R1010	Se necessário para aplicações posteriores.
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5702R	Usado para etapas de centrifugação a 4 °C.
Rosiglitazone	Cayman Chemical	71740	≥ 98%, PPAR&gama; agonista para indução adipogênica
Recipiente para objetos cortantes	Becton Dickinson	305270	Recipiente resistente a perfurações para lâminas e tesouras usadas
Sistema de Preparação para Suspensão de Célula Única SoniConvert	Docsense	SC-L1W	Usado para dissociação mecânica de tecido.
Buffer de coloração (Buffer de Coloração por Citometria de Fluxo)	eBiociência (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, pronta para uso, contém FBS e 0,09% azida de sódio como conservante, para diluição de anticorpos e células, coloração superficial e etapas de lavagem em citometria de fluxo
Tubo Eppendorf estéril de 1,5 mL	Eppendorf	30121.517	Tubo microcentrífuga Safe-Lock, estéril, para trituração de tecidos
Prato de cultura estéril	Corning	430167	Recipiente de cultura estéril de 100 mm x 20 mm, para coleta de tecidos
Pinça estéril	Sklar	96-1719	Pinças estériles para o polegar, serrilhadas, para manuseio de tecidos
Gaze estéril	Corporação Dukal	7060033	Compressas estéreis de gaze, para desinfecção e limpeza
Tesoura oftálmica estétil	Sklar	10023-580	Tesoura de mola estilo Vannas, para triturar tecido em 1-2 mm de altura; Peças
Navalha estéril	3M	9681	Barbeador de preparação cirúrgica, para remoção de pelos da área cirúrgica
Bisturi estéril	Integra Miltex	4-415	Bisturi descartável estéril, para fazer incisão
Tesoura cirúrgica estéreis	Sklar	10022-580	Tesoura Merit Sterile Iris, para dissecar vasos sanguíneos e tecido conjuntivo
Frasco de cultura celular T25	Corning	430639	Frasco de cultura celular Falcon T25, tampa ventilada, estéril
Triton X-100 (0,1%)	Sigma-Aldrich	T8787	Grau laboratorial, para permeabilização
Trippan Blue	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Solução de 0,4% para contagem de viabilidade celular.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	0,25% de tripsina, 1 mM de EDTA, para descolar ADSCs
β-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Sal dissódico pentahidratado, para indução osteogênica