Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a atividade sinérgica da fosfomicina em combinação com ceftriaxona, meropenema e gentamicina contra isolados resistentes a carbapênicos de Escherichia coli , utilizando o método de diluição de ágar. A sinergia foi observada com meropenema e gentamicina, mas não com ceftriaxona.
Artigo de revisão
Protocolo para análise em tabuleiro de xadrez por diluição de ágar de combinações de antibióticos à base de fosfomicina contra Escherichia coli resistente a carbapênemos
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Resumo
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Resumo
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Devido às opções limitadas de tratamento para os Enterobacterales resistentes a carbapenêmios, os regimes de terapia combinada têm ganhado cada vez mais importância. Este estudo teve como objetivo investigar as taxas de resistência à fosfomicina e avaliar as interações sinérgicas in vitro da fosfomicina em combinação com meropenem, gentamicina e ceftriaxona contra isolados resistentes a carbapenêmicos de Escherichia coli . Sessenta cepas resistentes a carbapenêmicos de E. coli isoladas de várias amostras clínicas (urina, sangue, aspiração, ferida, líquido cefalorraquidiano, aspiração endotraqueal) obtidas de pacientes em enfermarias clínicas e unidades de terapia intensiva dos hospitais da Faculdade de Medicina da Universidade Dicle foram incluídas no estudo. A identificação da espécie foi realizada usando um sistema automatizado de identificação microbiana. Testes de suscetibilidade a antibióticos e confirmação da resistência aos carbapênemos foram realizados por difusão de disco com ertapenem, imipenêmico e meropenem. A resistência à fosfomicina e as interações entre antibióticos foram avaliadas por diluição de ágar. Além disso, combinações de antibióticos foram avaliadas em gradientes de concentração duplos em série usando o protocolo baseado em diluição de ágar, e índices fracionários de concentração inibitória (FICI) foram calculados para determinar sinergia, indiferença ou antagonismo. As taxas de resistência foram de 76,6% para fosfomicina, 61,6% para meropenem, 85,0% para gentamicina e 98,3% para ceftriaxona. Interações sinérgicas foram observadas em 35% dos isolados para a combinação fosfomicina–meropenem, 33,4% para a combinação fosfomicina–gentamicina e 1,7% para a combinação fosfomicina–ceftriaxona. O antagonismo foi detectado em apenas um isolado da combinação fosfomicina–meropenem. Combinações de fosfomicina com meropenema e gentamicina mostraram atividade sinérgica in vitro contra E. coli resistente a carbapenêmicos. Estudos in vitro adicionais são necessários para confirmar esses achados.
Introdução
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A família Enterobacterales compreende um grupo altamente diverso de bacilos gram-negativos, muitos dos quais têm grande importância clínica1. Entre eles, Escherichia coli é a espécie mais frequentemente isolada em laboratórios clínicos de microbiologia e está amplamente associada a infecções envolvendo quase todos os sistemas de órgãos, incluindo infecções do trato urinário, infecções de feridas, pneumonia em pacientes imunocomprometidos, gastroenterite e meningite neonatal. Também é uma das principais causas de sepse Gram-negativa e choque séptico mediado por endotoxinas. Além da medicina humana, E. coli também é um importante patógeno veterinário, causando infecções respiratórias e sistêmicas em várias espécies animais, incluindo equinos, ampliando a perspectiva da faixa de hospedeiros da patogênese de E. coli em hospedeiros humanos eanimais 2,3,4.
Enterobacterales produtoras de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL), especialmente E. coli e Klebsiella pneumoniae, têm sido associadas ao aumento da mortalidade, hospitalizações prolongadas e custos de saúde mais elevados. O uso generalizado de antibióticos é um dos principais fatores que impulsionam a multirresistência (MDR) entre essesorganismos 1. Os mecanismos de resistência incluem produção de carbapenemase, ESBLs, enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs), mutações que conferem resistência a quinolonas e alterações em sistemas de porinas e efluentes. Em E. coli e Klebsiella pneumoniae, a resistência é principalmente mediada por plasmídeos, facilitando a transferência gênica horizontal. Tais características de resistência também são cada vez mais relatadas em E. coli de origem animal, incluindo isolados de bovinos, apoiando o conceito One Health e indicando risco potencial de transmissãozoonótica 2,3.
Os carbapenêmicos são considerados agentes de última linha para infecções graves multirresistentes. No entanto, os Enterobacterales resistentes a carbapenêmicos (CRE) emergiram como uma grande preocupação globalde saúde 4. Essa resistência é mediada principalmente por carbapenemases, incluindo metalo-beta-lactamases classe B, contribuindo para fenótipos extensivamente resistentes a medicamentos epan-resistentes 5.
As cepas MDR de E. coli limitam significativamente as opções terapêuticas e complicam o manejo da infecção. Isso ressalta a necessidade de estratégias de tratamento alternativas, como terapias combinadas, para melhorar os resultados clínicos. Além disso, essas cepas resistentes são cada vez mais relatadas não apenas em ambientes clínicos, mas também em fontes alimentares, como laticínios. Isso amplia o contexto epidemiológico da disseminação da resistência aos antimicrobianos e apoia a terapia combinada como uma estratégia potencial para mitigar sua disseminação e impactoclínico 6,7. Aminoglicosídeos, tigeciclina e polimixinas são agentes terapêuticos comumente usados em infecções porMDR 8. A fosfomicina também demonstrou atividade contra E. coli produtora de ESBL, especialmente em infecções urinárias9.
A fosfomicina, descoberta pela primeira vez em 1969, inibe a síntese inicial da parede celular bacteriana e ressurgiu como um agente promissor na terapiacombinada 10. Efeitos sinérgicos entre fosfomicina e aminoglicósidos ou β-lactâmicos foram relatados em organismosMDR 11,12. Além disso, a fosfomicina tem sido avaliada em grandes coortes clínicas, demonstrando eficácia em infecções graves quando usada isoladamente ou em regimescombinados 13. No entanto, a maioria dos estudos anteriores inclui populações bacterianas heterogêneas, e os dados que abordam especificamente E. coli resistente a carbapenêmicos continuam limitados.
Os métodos padrão de teste de suscetibilidade a antimicrobianos incluem diluição de ágar, diluição de caldo e difusão de disco. Testes combinados baseados em diluição de ágar permitem a avaliação quantitativa das interações antimicrobianas por meio da determinação de MICs e do cálculo dos FICIs. Métodos alternativos, como time-kill e difusão por gradiente, fornecem dados de interação dinâmicos ou simplificados, mas podem diferir em reprodutibilidade epadronização 13,14. Esse protocolo é mais adequado para avaliação in vitro controlada de combinações definidas de antibióticos. No entanto, não reflete totalmente as condições farmacocinéticas invivo 15. Entre eles, a diluição de ágar é considerada um método de referência para a determinação da CIM; no entanto, seu uso na avaliação da atividade combinada de fosfomicina contra E. coli resistente a carbapenêmicos permanece limitado.
Este estudo fornece uma avaliação sistemática das combinações à base de fosfomicina contra isolados de E. coli resistentes a carbapenêmicos clinicamente confirmados. Foi utilizada uma abordagem padronizada de tabuleiro de xadrez por diluição de ágar, gerando dados comparativos diretos de interação sob condições in vitro controladas.
Portanto, o presente estudo testa a hipótese de que a fosfomicina, em combinação com meropenem, gentamicina ou ceftriaxona, apresenta atividade sinérgica in vitro contra isolados de CRE E. coli.
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Revisão e perspetiva
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A aprovação deste estudo foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica Não Intervencionista da Faculdade de Medicina da Universidade Dicle (Decisão nº 100, Data: 01.01.2021).
O protocolo abaixo descreve um método padronizado de tabuleiro de diluição de ágar para avaliar a sinergia da combinação de fosfomicina contra isolados de E. coli resistentes a carbapênemos.
Coleção de isolados
Entre 15.02.2021 e 15.12.2021, um total de 60 cepas resistentes a carbapenêmicos de E. coli isoladas de várias amostras clínicas (urina, sangue, aspiração, ferida, líquido cefalorraquidiano e aspiração endotraqueal) obtidas de pacientes hospitalares nos Hospitais da Faculdade de Medicina da Universidade Dicle. A identificação foi realizada usando um sistema de espectrometria de massa MALDI-TOF. Quando múltiplos isolados foram recuperados do mesmo paciente, apenas o primeiro isolado foi incluído. Amostras de clínicas ambulatoriais e pacientes hospitalizados por menos de 48 horas foram excluídas. Todos os isolados resistentes a carbapenêmios de E. coli que atenderam aos critérios de inclusão pré-definidos durante o período do estudo foram incluídos consecutivamente; Portanto, o tamanho da amostra foi determinado pelo número total de isolados elegíveis disponíveis, e nenhum cálculo a priori do tamanho da amostra foi realizado. E. coli ATCC 13846 e E. coli ATCC 25922 foram usadas como cepas de controle de qualidade. Cepas de controle de qualidade foram testadas em paralelo com isolados clínicos sob condições idênticas de diluição de ágar. Todas as corridas foram avaliadas por dois observadores independentes. Os resultados das cepas de controle de qualidade mostraram padrões esperados de inibição de crescimento em todos os experimentos, e nenhum resultado fora da faixa ou inválido foi observado.
Todos os procedimentos envolvendo isolados clínicos foram realizados sob condições de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas e proteção ocular) foram utilizados, e todas as manipulações foram realizadas em um gabinete certificado de segurança biológica.
Identificação de espécies e testes de suscetibilidade a antimicrobianos
Testes de resistência aos carbapênemos e suscetibilidade aos antimicrobianos foram realizados usando um sistema automatizado de identificação microbiana e testes de suscetibilidade. A resistência a carbapênemos detectada pelo sistema foi confirmada por testes de difusão de disco com discos de ertapenêmico, imipenêmico e meropenem. Os diâmetros das zonas foram interpretados de acordo com os pontos de interrupçãoEUCAST 16,17 (Tabela 1). Todos os isolados foram preservados em caldo de soja tríptico contendo 20% de glicerol e armazenados a −20 °C.
Tabela 1: Pontos de ruptura do diâmetro da zona para carbapenêmicos determinados para E. coli por teste de difusão de disco (DDT). Critérios interpretativos de difusão de disco usados para testes de suscetibilidade a carbapênemos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Frascos de hemocultura adequados para amostras pediátricas e aeróbicas foram incubados em um sistema automatizado de hemocultura. As garrafas positivas foram subcultivadas em ágar EMB, ágar de sangue de ovelha 5% e ágar de dextrose Sabouraud.
Amostras de urina e aspirado endotraqueal foram cultivadas usando métodos quantitativos, enquanto outras amostras foram processadas por métodos semi-quantitativos. Amostras de aspiração endotraqueal foram avaliadas por meio de coloração de Gram, e apenas amostras com escore de Bartlett > 0 e escore de Murray > 3 foram consideradas significativas e incluíram18.
Para amostras de feridas, a avaliação por coloração de Gram foi realizada de acordo com o sistema de pontuação Q; amostras com pontuação Q maior que 0 foramincluídas 19.
Isolados bacterianos foram identificados por Espectrometria de Massas de Dessorção a Laser Assistida por Matriz/Tempo de Ionização em Voo. Uma pontuação de ≥2,0 foi considerada confiável para identificação em nível de gênero e espécie, enquanto escores entre 1,7 e 2,0 indicaram identificação confiável em nível degênero 20,21. Apenas isolados com pontuações de ≥2,0 foram incluídos.
Determinação da suscetibilidade à fosfomicina pelo método de diluição do ágar
De acordo com o Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST), o método de diluição do ágar é recomendado para determinar a suscetibilidade à fosfomicina em membros da famíliaEnterobacterales 16.
Preparação de fosfomicina e outras soluções antibióticas eficazes
Para o método de diluição do ágar, foi usado hidrato de sal dessódico de fosfomicina em pó, e água destilada estéril foi usada para criar a diluição. Oito diluições diferentes foram planejadas para cada antibiótico, variando de 4 vezes abaixo e 3 vezes acima do valor limite de CMI determinado pelo EUCAST.
Uma solução de estoque de fosfomicina (contendo 2560 μg/mL de fosfomicina) foi preparada dissolvendo 51,2 mg de fosfomicina disódio estéril, calculada usando a fórmula volume/peso/potência (Volume (mL) = Peso (mg) × Potência (μg/mg)/ Concentração (μg/mL)) e pesada em condições estéreis, em 20 mL de água destilada estéril. A concentração final foi planejada para ser de 256 μg/mL, resultante de uma diluição de 10 vezes da solução original quando o MHA foi adicionado.
Assim, foram determinadas as faixas de diluição para fosfomicina (2-256 μg/mL), meropenema e gentamicina (0,125–16 μg/mL) e ceftriaxona (0,0625–8 μg/mL).
As diluições foram preparadas por diluições em série em duas fases em tubos cônicos estéreis contendo 10 mL de água destilada estéril. Um total de 7 diluições em série com dupla dupla foram realizadas nos tubos até que uma concentração de 2 μg/mL fosse atingida. Os 10 mL restantes no último tubo foram descartados. Isso resultou em oito diferentes concentrações de antibióticos: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 e 2 μg/mL.
O mesmo método usado para a fosfomicina foi usado para os outros antibióticos para preparar a solução inicial de estoque. 1,6 mg de antibiótico em pó foram ponderados para ceftriaxona e 3,2 mg para meropenem e gentamicina usando uma balança de precisão. Sete diluições foram feitas para cada antibiótico. Assim, foram obtidas oito diferentes concentrações de diluições antibióticas para meropenem, gentamicina e ceftriaxona (Figura 1).
Figura 1: Etapas de preparação das soluções de diluição de fosfomicina. Etapas de diluição serial usadas para obter concentrações de trabalho. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Preparação do meio de ágar
O ágar Mueller-Hinton ajustado por catiônios (CAMHA) foi preparado seguindo as instruções do fabricante. Foi esterilizado a 121 °C e 1 atm por 15–20 minutos usando um autoclave, depois mantido a 45–55 °C em banho-maria.
Todos os materiais biológicos foram esterilizados por autoclavagem a 121 °C por 15–20 minutos antes do descarte. Resíduos contendo antibióticos foram descartados de acordo com os protocolos institucionais de biossegurança e resíduos químicos.
Passo Crítico: Mantenha a temperatura do ágar entre 45–55 °C antes da adição do antibiótico. Calor excessivo pode reduzir a atividade da fosfomicina e afetar os resultados da CMI.
Adição do G6P ao meio
Para determinar a suscetibilidade à fosfomicina, a EUCAST recomenda adicionar 25 μg/mL de glicose-6-fosfato (G6P) ao ágar e ao meio5 do caldo. Para cada litro de ágar, 25 mg de G6P foram dissolvidos em 20 mL de MHA, filtrados para esterilizar e depois misturados ao lote principal de ágar.
Preparação de placas de diluição de ágar
Para determinar os valores de CIM em monoterapia para fosfomicina, meropenem, gentamicina e ceftriaxona, uma placa de Petri foi usada por diluição (por exemplo, 8 diluições para fosfomicina, variando de 2 a 256 μg/mL). As concentrações de antibióticos foram registradas nas placas.
No estudo combinado, as concentrações de fosfomicina e do outro antibiótico investigado foram observadas nas placas (por exemplo, fosfomicina 256 μg/mL e meropenema 32 μg/mL). Assim, 64 placas foram preparadas para cada combinação, e a concentração de fosfomicina e do outro antibiótico utilizado foi registrada nas placas. Um total de 32 placas de meropenem-gentamicinetri foram preparadas para monoterapia e 192 para combinação. Um desenho padrão contendo 56 pequenos quadrados de 1 cm foi feito sobre uma superfície de mármore. Todas as placas foram inoculadas diretamente neste desenho. Assim, leitura e inoculação foram padronizadas (Figura 2 e Figura 3).
Figura 2: Diagrama padrão criado para fins de inoculação e leitura. Esquema padronizado utilizado para inoculação e avaliação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Método de avaliação das placas de diluição de ágar. Avaliação do crescimento bacteriano para determinação da CMI. F = fosfomicina; M = meropenem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Dois mililitros de solução antibiótica foram misturados com 18 mL de CAMHA fundido para obter a concentração final de trabalho. Esse meio, preparado conforme o folheto do fabricante, era resfriado a 45−55 °C em banho-maria. Uma parte (2 mL) da mistura antibiótica foi usada, e 9 partes (18 mL) de MHA foram misturadas nas placas de Petri (o antibiótico foi diluído em 1/10). O volume final da placa de ágar foi padronizado para aproximadamente 20 mL por placa (18 mL de ágar + 2 mL de solução antibiótica), e as concentrações finais de antibiótico foram calculadas após diluição. Dessa forma, as concentrações de antibióticos foram alcançadas nas placas de diluição do ágar (2–256 μg/mL para fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL para ceftriaxona e 0,125–16 μg/mL para meropenema e gentamicina). Placas preparadas a partir do meio sem solução antibiótica foram usadas como controles de crescimento (Figura 4). As misturas compostas por meio e solução antibiótica foram deixadas solidificar em temperatura ambiente.
Figura 4: Meio de controle sem solução antibiótica. Meio sem antibióticos é usado para confirmar a viabilidade bacteriana. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Passo Crítico: Profundidade desigual do ágar ou mistura insuficiente de antibióticos pode levar a interpretações imprecisas da CIM e resultados falsos de interação.
Preparação e inoculação de isolados
Cepas puras previamente armazenadas foram transferidas sobre ágar sanguíneo de ovelha a 5% em temperatura ambiente e incubadas a 37 °C por 16–24 horas. Colônias de culturas frescas foram suspensas em solução salina estéril, e uma turbidez McFarland de 0,5 foi alcançada usando um leitor óptico.
O método de diluição do ágar exigia um inoculo bacteriano de aproximadamente 10,4 CFU por mancha. Um valor de McFarland de 0,5 contém aproximadamente 10,8 CFU/mL de bactérias. Uma densidade bacteriana de10,7 CFU/mL foi alcançada diluindo a solução 1:10 com soro fisiológico estéril.
2 μL de cada suspensão bacteriana eram coletados do tubo usando uma pipeta automática. Esse volume corresponde a aproximadamente 2 × 104 CFU por mancha. A inoculação foi realizada em áreas-alvo da superfície do ágar, começando pela placa contendo a menor concentração de fosfomicina e progredindo para a maior.
Assim, a inoculação foi definida como CFU por mancha, com cada ponto de inoculação contendo aproximadamente 10UFC 4 . A inoculação de cada suspensão bacteriana foi concluída em até 15 minutos.
Antes de inocular as placas contendo fosfomicina, uma placa de controle de crescimento foi inoculada para verificar a contaminação. A inoculação foi deixada secar em temperatura ambiente. A incubação foi realizada entre 35 e 37 °C por 16 a 24 horas em condições aeróbicas, e a turbidez foi medida com um densitômetro calibrado.
Densidade excessiva de inóculo pode causar crescimento de trilha e dificuldade na determinação do desfecho final. Reajuste a turbidez para 0,5 McFarland e repita a inoculação se ocorrer crescimento confluente.
Testes combinados
Foram usados antibióticos em pó meropenem, fosfomicina, gentamicina, ceftriaxona e glicose-6-fosfato.
As quantidades de antibiótico foram calculadas usando a fórmula volume/peso/potência. Após o preparo das soluções padrão, as soluções antibióticas foram preparadas em concentrações de três diluições em dobro acima e quatro diluções em duas vezes abaixo da faixa suscetível de CMI. As faixas de diluição foram calculadas como 2–256 μg/mL para fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL para ceftriaxona e 0,125–16 μg/mL para gentamicina e meropenema (Tabelas 2, Tabelas 3 e Tabelas 4).
Tabela 2: Preparação de Soluções Antibióticas para a Combinação Fosfomicina-Gentamicina. Etapas de preparação e concentrações usadas para estoques e soluções de trabalho. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 3: Preparação de Soluções Antibióticas para a Combinação Fosfomicina-Meropenem. Etapas de preparação e concentrações usadas para estoques e soluções de trabalho. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 4: Preparação de Soluções Antibióticas para a Combinação Fosfomicina-Ceftriaxona. Etapas de preparação e concentrações usadas para estoques e soluções de trabalho. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Neste estudo, soluções separadas de estoque de fosfomicina foram preparadas para monoterapia e experimentos combinados, a fim de compensar diferenças nos fatores finais de diluição durante testes baseados em agar. Uma solução padrão de stock foi usada para experimentos de monoterapia, enquanto uma solução de stock ajustada de maior concentração foi usada para experimentos combinados, a fim de compensar a diluição adicional durante a pré-mistura de antibióticos.
Soluções padrão eram preparadas como o passo inicial para a diluição em série. Para fosfomicina, 256 mg de pó foram pesados com precisão usando uma balança analítica em condições estéreis e dissolvidos em 50 mL de água destilada estéril com mistura contínua (agitador magnético) até que a dissolução completa fosse alcançada, resultando em uma concentração final de 5120 μg/mL de fosfomicina desódio. Soluções de estoque separadas de gentamicina, meropenema e ceftriaxona foram preparadas.
Para diluições em série em dupla fase, sete tubos cônicos estéreis contendo 25 mL de água destilada estéril foram preparados. A partir da solução padrão, 25 mL foram transferidos para o primeiro tubo usando uma pipeta ajustável, seguidos por transferência sequencial para tubos subsequentes para alcançar diluições seriadas em duas partes. Cada tubo foi misturado cuidadosamente com um misturador de vórtice por 5–10 segundos após cada etapa de transferência. Do tubo final, 25 mL foram descartados para manter volumes iguais. Dessa forma, foi obtida uma série de diluição, resultando na menor concentração de 40 μg/mL, e um total de oito diferentes concentrações de fosfomicina foram preparadas.
O mesmo procedimento foi aplicado para gentamicina, meropenem e ceftriaxona. No entanto, devido às diferenças nas faixas de concentração-alvo, 16 mg de gentamicina e meropenem (para uma faixa de 0,125–16 μg/mL) e 8 mg de ceftriaxona (para uma faixa de 0,0625–8 μg/mL) foram pesados e dissolvidos separadamente em água destilada estéril de 50 mL sob condições assépticas em temperatura ambiente. Diluições em série em dupla foram realizadas conforme descrito acima. As concentrações finais mais baixas foram 2,5 μg/mL para gentamicina e meropenem, e 1,25 μg/mL para ceftriaxona. Para cada antibiótico, foram preparados oito tubos contendo 25 mL de diferentes concentrações. Como a fosfomicina foi testada em combinação com três antibióticos, um total de 24 tubos de diluição de fosfomicina (8 × 3) foram preparados.
Para a preparação do ágar, 18 mL de ágar Mueller–Hinton suplementado com glicose-6-fosfato (25 μg/mL) foram pré-resfriados a 45–50 °C e dispensados em placas de Petri estéreis. Posteriormente, 1 mL de solução de fosfomicina e 1 mL da segunda solução antibiótica foram adicionados usando pipetas estéreis. As placas eram suavemente misturadas por rotação circular para garantir uma distribuição homogênea e deixadas solidificar em temperatura ambiente. Devido à mistura em volume igual e à adição de ágar, as concentrações de antibióticos foram reduzidas aproximadamente 9 vezes.
Para testes combinados, 1 mL da menor concentração de fosfomicina (40 μg/mL) foi combinado com 1 mL de cada uma das oito diluições de gentamicina (2,5–320 μg/mL), depois adicionado a placas de Petri separadas e misturado suavemente. O mesmo procedimento foi repetido para a próxima concentração de fosfomicina (80 μg/mL) e continuou em etapas até 5120 μg/mL, garantindo que todas as combinações possíveis de concentração fossem testadas. Uma nova ponta estéril de pipeta foi usada para cada transferência para evitar contaminação cruzada. No total, 64 placas de Petri (8 × 8 combinações) foram preparadas para a combinação fosfomicina–gentamicina (Tabela 5).
O mesmo procedimento foi aplicado à fosfomicina em combinação com meropenema e ceftriaxona, resultando em 64 placas para cada combinação de antibióticos (Tabela 6 e Tabela 7).
Tabela 5: Organização da combinação fosfomicina-gentamicina no meio MHA. Arranjo das concentrações de antibióticos no ágar Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; GN = gentamicina. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 6: Arranjo da combinação fosfomicina-meropenema no meio MHA. Arranjo das concentrações de antibióticos no ágar Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; MEM = meropenem. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 7: Organização da combinação fosfomicina-ceftriaxona no meio MHA. Arranjo das concentrações de antibióticos no ágar Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; CRO = ceftriaxona. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Após preparar as misturas antibióticas, 18 mL de ágar Mueller–Hinton fundido (45–50 °C) foram adicionados a cada placa contendo 1 mL da mistura antibiótica, garantindo que as condições de temperatura não comprometessem a atividade antibiótica. Isso resultou em uma diluição aproximada de 9 vezes a solução antibiótica inicial.
Para avaliação sistemática, as placas foram organizadas em formato de tabuleiro de xadrez (diluição bidimensional). As concentrações de fosfomicina foram organizadas ao longo do eixo vertical (fileiras A–H), com a maior concentração na linha A e concentrações decrescentes em direção à linha H. O segundo antibiótico foi organizado ao longo do eixo horizontal (colunas 1–8), com concentrações crescentes da coluna 1 até a coluna 8. Cada posição bem equivalente, portanto, representava uma combinação única de duas concentrações de antibióticos, permitindo uma avaliação abrangente dos efeitos de interação.
Avaliação de resultados
Os resultados da Concentração Inibitória Mínima foram avaliados de acordo com as recomendações do EUCAST v.11. As placas de controle de crescimento mostraram crescimento bacteriano visível, enquanto as placas de controle de esterilidade (não inoculadas) não mostraram crescimento. A CMI foi definida como a menor concentração na qual não ocorreu crescimento visível. Para testes combinados, os efeitos de interação foram interpretados usando valores FICI. Sinergia foi definida como FICI ≤ 0,5, indiferença como > 0,5–4, e antagonismo como > 4. Para a fosfomicina, valores de CIM ≤ 32 μg/mL foram considerados suscetíveis, e aqueles > 32 μg/mL foram considerados resistentes. Para gentamicina e meropenema (em infecções por meningite), valores de CIM ≤ 2 μg/mL foram considerados suscetíveis, e aqueles > 2 μg/mL foram considerados resistentes. Para meropenema (em infecções não meningites), valores de CMI ≤ 2 μg/mL foram considerados suscetíveis. Valores > 8 μg/mL foram considerados resistentes, a CMI ≤ 1 μg/mL para ceftriaxona (para infecções não meningites) foram consideradas suscetíveis, a CMI ≤ 2 μg/mL para ceftriaxona (para infecções por meningite) foi considerada suscetível, e a CMI > 1 μg/mL para ceftriaxona (para infecções por meningite) foi considerada resistente16.
A análise estatística dos dados do estudo foi realizada usando software estatístico.
Estatísticas: Variáveis categóricas foram expressas como números e percentuais. O teste qui-quadrado de Pearson foi usado para comparações em que todas as contagens celulares esperadas eram ≥5. O teste exato de Fisher foi usado para análises com amostras pequenas ou quando a contagem celular esperada era <5. Especificamente, o teste qui-quadrado foi usado para comparações gerais das taxas de resistência à fosfomicina, enquanto o teste exato de Fisher foi usado para análises de subgrupos das taxas de interação sinérgicas, aditivas e antagônicas devido a distribuições de baixa frequência em algumas combinações. Um valor P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Nota de Interpretação: Colônias pequenas e simples dentro das zonas de inibição não foram consideradas como crescendo, a menos que fossem confluentes ou reproduzíveis em testes repetidos.
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Conclusões
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Um total de 60 isolados resistentes a carbapenêmicos de E. coli foram incluídos no estudo. Todos os isolados foram obtidos de pacientes hospitalizados em unidades de terapia intensiva ou enfermarias clínicas dos hospitais da Faculdade de Medicina da Universidade Digle. Pacientes adultos representaram 83,3% dos casos, enquanto pacientes pediátricos representaram 16,7% (Tabela 8 e Tabela 9). A resistência multirrepetitiva foi observada em 80% (n = 48) dos ...
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Divulgações
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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Agradecimentos
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Este estudo foi apoiado pela Unidade de Coordenação de Projetos de Pesquisa Científica da Universidade Dicle (DÜBAP), com o número de projeto SBE.21.004.
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