Avaliação da drenagem linfática usando imagens no infravermelho próximo ICG e ultrassom após fratura

Resumo

Esse protocolo avalia a drenagem linfática após a fratura combinando imagens no infravermelho próximo verde de indocianina (ICG) com ultrassom para quantificar a depuração plantar do ICG e o aumento do linfonodo poplíteo em camundongos.

Resumo

Fraturas traumáticas frequentemente são acompanhadas por função linfática comprometida. Drenagem linfática reduzida e aumento dos linfonodos após fratura indicam processos contínuos e dinâmicos da resposta inflamatória aguda e do recrutamento de células imunológicas. Este artigo descreve um método no qual 6 μL de 0,2 mg/mL de verde de indocianina foram injetados intradérmicamente na região plantar de camundongos submetidos a cirurgia de fratura simulada ou tíbia. A imagem de fluorescência no infravermelho próximo quantificou o sinal plantar de ICG às 0 h e 24 h para calcular a taxa de eliminação em 24 horas como leitura da drenagem linfática murina. O ultrassom foi usado simultaneamente para reconstruir em 3D os linfonodos poplíteos (PLNs), comparar seus volumes e avaliar o aumento induzido por fraturas.  Os resultados demonstraram que, após a fratura, a taxa de depuração linfática diminuiu significativamente, a intensidade de fluorescência do ICG na região plantar foi marcadamente maior e o volume das PLNs aumentou significativamente.  Comparado a métodos anteriores de medição do sistema linfático, como as seções histopatológicas ou a linfocintilografia, que frequentemente não conseguem observação in vivo, dinâmica e contínua, este método demonstra alta estabilidade e reprodutibilidade. Notavelmente, possibilita o monitoramento dinâmico in vivo da função de drenagem linfática, fornecendo suporte técnico robusto para investigar mudanças no refluxo linfático em modelos de fraturas.

Introdução

Fraturas traumáticas frequentemente causam danos significativos aos tecidos e inchaço, aumentando o risco de complicações como infecção, necrose e não união^{óssea 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. mostraram que a disfunção de drenagem linfática, levando a edema tecidual, está ligada ao atraso na^{cicatrização 3}. Estudos indicam que, durante o processo de cicatrização da fratura, além do reparo do tecido ósseo, o sistema linfático no local da fratura também desempenha um papel importante. Os vasos linfáticos são responsáveis não apenas por drenar o líquido intersticial e prevenir o^inchaço, mas também por regular a migração das células imunes e eliminar resíduos metabólicos. No entanto, nos estágios iniciais da fratura, fatores pró-inflamatórios como TNF-α, IL-1, IL-6 e o Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos (MCSF) podem danificar as células endoteliais^{linfáticas 5}, levando a alterações patológicas como degeneração, edema e^{fibrose 6}. Estudos relevantes mostraram a presença de células endoteliais linfáticas no osso e perióstio, bem como nos tecidos adiposos e musculares ao redor. Além disso, a drenagem linfática também participa da regulação do microambiente do hematoma após fratura; drenagem linfática eficaz facilita a sobrevivência dos osteoblastos e a proliferação das células-tronco mesenquimatosas da medula óssea (BMSCs⁾⁷. Durante uma fratura, os fatores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-1 e IL-6) e os fatores de crescimento (TGFβ1 e PDGF) produzidos pelas células imunes no local danificado são fatores reguladores importantes para a apoptose dos osteoblastos e para a proliferação^{de BMSC 8}. Hüseyin Arslan e outros estudiosos confirmaram o impacto negativo do edema linfático nos osteoblastos. Esses achados destacam o papel importante da drenagem linfática na cicatrização de fraturas. Avanços recentes na imagem de fluorescência no infravermelho próximo (NIR) do ICG facilitaram a observação não invasiva e em tempo real da dinâmica do fluxo linfático tanto em modelos animais quanto em humanos ^9,10,11. Essa técnica permite uma avaliação quantitativa da contratilidade dos vasos linfáticos, velocidade de drenagem e integridade das^{vias 10,11}. Um estudo usando modelos murinos de artrite e inflamação mostrou que a imagem ICG-NIR pode diferenciar entre respostas linfáticas agudas e crônicas, destacando padrões distintos de drenagem durante lesão e recuperação tecidual. Além disso, a imagem linfática NIR tem demonstrado ser eficaz para monitorar a recuperação funcional após drenagem linfática manual e para avaliar a eficácia de terapias direcionadas a linfáticos. A ultrassonografia oferece uma modalidade quantitativa complementar para avaliar a morfologia e o volume dos linfonodos drenando, bem como edema tecidular associado à drenagem linfática comprometida. A integração da imagem por fluorescência NIR com ultrassom permite a avaliação simultânea da função linfática e das alterações anatômicas, proporcionando uma abordagem multimodal para investigar a dinâmica linfática in vivo. Apesar do crescente reconhecimento do papel crítico da disfunção linfática na cicatrização pós-traumática, ainda faltam métodos padronizados e reprodutíveis para avaliar a drenagem linfática após fraturas. Muitos métodos de imagem atuais são invasivos, carecem de resolução espacial adequada ou não monitoram dinamicamente o fluxo linfático. Portanto, espera-se que desenvolver um protocolo que combine ICG-NIR e imagens ultrassonológicas aborde essa deficiência metodológica e forneça uma ferramenta eficaz para avaliar a recuperação linfática e sua contribuição para a reparação óssea.

Este estudo apresenta uma estrutura inovadora que combina imagens de fluorescência ICG-NIR com ultrassom de alta resolução para avaliar a drenagem linfática após fraturas da tíbia em camundongos. Essa abordagem permite uma análise semi-quantitativa da eficiência da drenagem e mede o volume dos linfonodos durante o processo de cicatrização da fratura. Também tem algumas limitações. Primeiramente, o ICG-NIR é usado principalmente para avaliar vasos linfáticos superficiais, e sua capacidade de imagem para estruturas mais profundas é limitada. Em segundo lugar, embora as alterações no volume dos linfonodos forneçam algumas informações, elas carecem de especificidade e não podem substituir totalmente as medições funcionais diretas. Essa metodologia tem potencial translacional significativo e melhora nosso entendimento da função linfática na regeneração óssea.

Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Centro de Organismos Modelo de Xangai (Aprovação nº NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). Camundongos machos C57 com modelo de fratura (6–8 semanas de idade) foram usados neste estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cuidados pré-operatórios

1. Aclimate os camundongos por pelo menos 1 semana com o método ad libitum. Acesso a comida e água. Atribua aleatoriamente os animais ao grupo fratura ou simulação usando uma lista de randomização gerada por computador.
2. Coloque os camundongos em uma almofada térmica para animais e mantenha uma temperatura constante de 37 °C.
3. Ligue a máquina de anestesia gasosa e coloque o rato na câmara de indução por 5 minutos a 2%–3% de isoflurano.
4. Após a indução, troque para isoflurano 1%–2% e mantenha anestesia por meio de um cone nasal até o final do procedimento.

2. Procedimento experimental

NOTA: Padronize configurações de anestesia, dose e volume de ICG, local e profundidade da injeção, tempo de exposição, definição de ROI e parâmetros de ultrassom em todas as sessões para minimizar a variabilidade entre animais.

1. Imagem NIR-ICG
   NOTA: O procedimento passo a passo para imagens no infravermelho próximo do ICG é mostrado na Figura 1.
   1. Pese 0,2 mg de verde de indocianina (ICG), transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e dissolva em 1 mL de PBS para preparar uma solução de 0,2 mg/mL de ICG. Enrole o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz.
   2. Ligue o sistema de imagem e abra o FluoBeam v1.46. Ajuste a altura da câmera conforme necessário.
   3. Umedecida um cotonete com 75% de etanol e desinfete a superfície plantar da pata traseira modelada.
   4. Usando uma microseringa de 10 μL, aspire 6 μL da solução ICG. Insira a agulha aproximadamente 1 mm na superfície plantar e injete a solução em taxa constante até que o volume total seja entregue.
   5. No software, ative tanto as funções "câmera" quanto "laser". Clique em "modificar" para criar uma nova pasta e defina como o diretório de salvamento. Mantenha o tempo de exposição idêntico para aquisição de imagem em 0 h e 24 h.
   6. Coloque o rato sob a câmera na posição deitado, com o membro posterior modelado centralizado no campo de visão. Certifique-se de que o membro traseiro modelado esteja centralizado no campo de visão.
   7. Defina o tempo de exposição para 30 ms e mantenha idêntico tanto para as imagens de 0 h quanto para as de 24 horas. Adquira imagens do mesmo ROI da injeção plantar às 0 h e 24 h após a injeção para medir a intensidade do sinal ICG. Mantenha o tempo de exposição idêntico em 0 h e 24 h.
   8. Quando os vasos linfáticos do membro posterior estiverem claramente visíveis no campo de visão, clique em "foto" para capturar as imagens.
   9. Após a aquisição da imagem, exporte os dados e utilize um software de análise de imagem para quantificar a intensidade de fluorescência em 0 h e 24 h, e então calcule a taxa de resolução da fluorescência.
   10. Abra o software de análise de imagem.
   11. Importe as imagens de fluorescência clicando em Arquivo → Abrir e abra a imagem plantar de 0 h correspondente ao mesmo animal e ao mesmo dia de exame (em seguida, abra a imagem correspondente de 24 h em seguida).
   12. Selecione Oval, depois clique em Editar → Selecionar → Especificar; defina Largura = 30 e Altura = 30, escolha Oval e clique em OK.
   13. Coloque o círculo sobre uma área de fundo.
   14. Clique em Analisar → Mede e registre o valor médio na janela de Resultados como intensidade de fluorescência a 0 h de fundo (FI0hbg).
   15. Coloque o círculo sobre o local de observação do alvo, clique em Analisar → Medir e registre o valor médio na janela de Resultados como FI0h.
   16. Calcule a intensidade de fluorescência corrigida em 0 h como FI0h Corrigido = FI0h − FI0hbg.
   17. Abra a imagem correspondente de 24 horas e repita os Passos 3 a 7 para obter o FI24h Corrigido.
   18. Calcule a taxa de resolução usando a intensidade de fluorescência corrigida pelo fundo da seguinte forma: Taxa de resolução = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%.
2. Ultrassonografia em modo B
   NOTA: O procedimento passo a passo para ultrassom e delimitação dos linfonodos é mostrado em Figura 2.
   1. Ligue o sistema de ultrassom, conecte o transdutor e posicione o rato de modo que o membro posterior fique claramente visualizado. Sob anestesia contínua, coloque o camundongo na posição deitada no palco de imagem, com a cabeça orientada para longe do operador e a cauda voltada para o operador. Flexione o joelho de modo que a fossa poplítea fique voltada para cima e levemente lateralmente, e posicione o transdutor sobre a depressão da fossa poplítea.
   2. Apresente gel de acoplamento por ultrassom no membro traseiro modelado.
   3. Gire o transdutor de modo que seu ângulo permaneça paralelo ao eixo longitudinal do membro posterior.
   4. Ajuste a distância de varredura para 4 mm e o tamanho do passo para 0,04 mm. Identifique o linfonodo poplíteo na imagem de acordo com sua localização anatômica.
   5. Estabilize o rato segurando a cauda e o membro posterior modelado com ambas as mãos. Não mova o animal enquanto o transdutor está escaneando.
   6. Adquira imagens. Identifique o linfonodo poplíteo como um pequeno nódulo oval ou levemente em forma de feijão, com ecogenicidade intermediária a baixa, um pouco menor que a da gordura ao redor, e claramente demarcado do músculo estriado mais escuro adjacente.
   7. Exporte as imagens para um software de reconstrução 3D para processamento tridimensional de imagens.
   8. Após concluir a varredura 3D no console do sistema de imagem de ultrassom, salve a varredura como um conjunto de dados 3D e registre a identificação do animal, o código do grupo e o momento (0 h / 24 h).
   9. Exportar os dados brutos do console de aquisição para o computador de análise, mantendo a estrutura original de pastas inalterada; Use uma pasta para cada animal em cada momento sempre que possível.
   10. Abra o software de reconstrução 3D.
   11. Clique em "Estudar" para entrar no módulo e selecione "Importar."
   12. Clique na pasta de dados , marque os dados a serem importados e clique duas vezes para abri-la.
   13. No modo de exibição, selecione "Processamento de Imagem" → "Carregar em 3D" → "Visualização Transversal" → "Medição de Volume" → "Iniciar."
   14. Confirme se a orientação do slice e os parâmetros de step ("voxel/espaçamento") são consistentes com as configurações de aquisição.
   15. Use a roda do mouse ou o controle deslizante de fatia para deslocar da extremidade proximal à extremidade distal e identificar a primeira fatia em que o PLN aparece (geralmente aparece como uma estrutura oval ou em forma de feijão, levemente hipoecoica em relação à gordura ao redor, com um limite relativamente claro).
   16. Comece a traçar a primeira fatia em que o PLN aparece clicando com o botão esquerdo para iniciar o contorno.
   17. Traçe um contorno fechado ponto por ponto ao longo da borda do linfonodo, mantendo o contorno o mais próximo possível da cápsula externa e evitando a inclusão da gordura ou lúmen vascular ao redor.
   18. Use a roda do mouse para se mover até a fatia que mostra a área máxima da seção transversal do PLN, e repita o Passo 10 para completar o segundo contorno.
   19. Use a roda do mouse para mover até a fatia pouco antes do PLN desaparecer, e repita o Passo 10 para completar o terceiro contorno.
   20. Clique em "Terminar" para gerar o volume segmentado 3D e gerar a medição de volume.
   21. Registre o volume do PLN (mm³) no painel de resultados.
   22. No painel de resultados da medição, selecione "Exportar" e exporte os resultados como um arquivo .csv ou .xls.
   23. Selecione o tipo de arquivo e exporte a imagem como Área da Imagem TIFF (.tif).
   24. Mantenha o cegamento durante a análise exibindo apenas o código animal e o ponto de tempo, sem mostrar a atribuição de grupo (fratura/simulação), até que toda a extração de volume seja concluída e os grupos sejam decodificados para análise estatística.
3. Análise estatística usando software de análise estatística
   1. Selecione Nova Tabela e Gráfico, escolha Agrupados.
   2. Defina o formato de entrada de dados para Insira valores replicados, empilhados em subcolunas.
   3. Insira os valores brutos para 1 / 7 / 14 e Sham / Fratura. - Abra o gráfico.
   4. Mude o tipo de grafo para Dispersão (valores individuais) + média + barras de erro.
   5. Formate os eixos: defina o eixo Y e mude o título do eixo.
   6. Clique em Analisar e execute uma ANOVA bidirecional.
   7. Compare Sham versus Fracture em cada momento.
   8. Adicione os resultados de significância ao gráfico.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Ao final do experimento, coloque o rato em uma almofada térmica e deixe que ele se recupere da anestesia.
2. Monitore sua condição de perto e, se não houver anomalias, devolva-o à gaiola para continuar sendo alojado.

4. Avaliação

NOTA: Faça com que um pesquisador cego à alocação de grupos realize a aquisição de imagens e análises quantitativas, e mantenha todos os conjuntos de dados codificados até que as análises estatísticas sejam concluídas.

1. Imagem NIR-ICG
   1. Use softwares de análise de imagens para realizar uma análise quantitativa relativa da intensidade de fluorescência em imagens ICG coletadas em almofadas de mouse.
      NOTA: A fórmula de cálculo para a taxa de resolução do ICG em tapetes de mouse é a seguinte:
      Taxa de resolução (%) = [(FI_0h – FI_24h) / (FI_0h)] × 100%
   2. Use o mesmo método para registrar a taxa de apuração de cada medição e analise a relação entre a taxa de apuração linfática e o tempo usando softwares de análise estatística.
2. Ultrassonografia em modo B
   1. Analise imagens em modo B e tridimensionais usando software de reconstrução 3D para determinar o volume do PLN.
   2. Avalie mudanças na drenagem linfática e no volume dos gânglios linfáticos ao longo do tempo criando gráficos de dispersão com softwares de análise estatística.
3. Análise estatística
   1. Analise medições repetidas obtidas nos dias 1, 7 e 14 usando medidas repetidas bidirecionais ANOVA.

Resultados

Nos dias 1, 7 e 14 após estabelecer o modelo de fratura, a intensidade de fluorescência plantar de ICG (_{FI 24h}) a 24 horas no grupo fratural foi consistentemente maior do que no grupo de cirurgia simulada (Figura 3). A análise quantitativa relativa da intensidade da fluorescência do ICG a partir de imagens plantares coletadas mostrou que a taxa de eliminação do ICG linfático no grupo fraturado foi significativamente menor do que no grupo de cirurg...

Discussão

O protocolo inclui vários detalhes facilmente ignorados. Por exemplo, o tempo de exposição não é fixo e deve ser determinado com base na intensidade específica de fluorescência. No entanto, o tempo de exposição para o mesmo grupo de camundongos em 0 h e 24 h deve permanecer consistente; caso contrário, os resultados podem ser pouco confiáveis. Ao usar o ultrassom para observação, é essencial cobrir completamente os membros inferiores do camundongo com agente de acoplamento, pois áreas de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	O microseringue Hamilton 80330/00 é um instrumento de precisão com capacidade de 10L, apresentando uma agulha calibre 26s, comprimento de 51mm e estilo de ponta 2. É projetado para entrega precisa de pequenos volumes em aplicações de cromatografia, injeção de amostras e química analítica.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	O Vevo 2100 é um sistema de imagem de ultrassom de alta frequência para pesquisa pré-clínica, fornecendo visualização 3D em tempo real de pequenos animais. Oferece resolução superior para estudos cardiovasculares, oncologia e biologia do desenvolvimento, integrado com o software Vevo LAB para análise de dados.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	O etanol a 75% é uma solução desinfetante amplamente utilizada em laboratórios para esterilização de superfícies, limpeza de equipamentos e antissepsia. Efetivamente mata bactérias, vírus e fungos por desnaturação de proteínas e é comumente aplicado em ambientes biológicos e clínicos.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	Os cotonetes são aplicadores estéreis e absorventes usados para coleta precisa de amostras, aplicação de soluções ou limpeza em procedimentos médicos, diagnósticos e laboratoriais. Apresentam hastes de madeira ou plástico com pontas de algodão para manuseio higiênico.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	O agente de acoplamento, comumente conhecido como gel de ultrassom, é um meio à base de água usado para melhorar a transmissão acústica entre o transdutor de ultrassom e a pele. Elimina bolsões de ar para uma imagem clara, não é irritante e é fornecido em um recipiente de 250mL para uso médico e diagnóstico.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Um software científico de gráficos e análise estatística usado para análise de dados, visualização e apresentação.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Um programa de processamento e análise de imagem baseado em Java de domínio público amplamente utilizado para análise de imagens biológicas e médicas.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	O verde de indocianina é um corante aniônico solúvel em água usado em diagnósticos médicos para determinar o débito cardíaco, função hepática, fluxo sanguíneo hepático e angiografia oftálmica. É fornecido em frascos de 25mg para administração intravenosa e exibe fluorescência no espectro do infravermelho próximo para fins de imagem.
isoflurance	RWD	R650-IE	O isoflurano é um anestésico geral inalado. Possui um pequeno coeficiente de partição sangue/gás. Quando usado para anestesia animal, pode induzir a anestesia de forma suave, rápida e confortável, com rápida recuperação, boa relaxação muscular e sem efeito excitatório sobre o sistema nervoso simpático. A taxa metabólica do isoflurano no fígado é baixa, então tem pouca toxicidade para o fígado, e não há efeitos colaterais óbvios mesmo com uso repetido. Para evitar os efeitos adversos do gás residual do anestésico no meio ambiente e no pessoal do laboratório, recomenda-se usá-lo junto com um sistema de recuperação de gás.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	O microbalance FA1004B é um instrumento analítico de alta precisão projetado para pesagem precisa de pequenas amostras, oferecendo precisão de até 0,0001g e adequado para aplicações laboratoriais que requerem medições precisas em pesquisa e controle de qualidade.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	O Olympus MVX10 é um sistema de microscópio de fluorescência macro zoom otimizado para imagem de infravermelho próximo. Oferece visualização de alta resolução de grandes espécimes com uma ampla faixa de zoom, óptica avançada para penetração em tecidos profundos e compatibilidade com técnicas de fluorescência em pesquisa biológica e de materiais.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Um pacote de software de análise de imagem usado para analisar dados de imagem Vevo, incluindo medição, cálculo e geração de relatórios.