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Artigo de investigação
Este estudo demonstra que a Fórmula Shengdu Pingmu alivia a constipação em ratos ao aumentar o teor de água fecal e a propulsão intestinal. Os efeitos estão associados à ativação da via PI3K/AKT, à regulação para cima de AQP3 e AQP8, e à modulação da composição da microbiota intestinal.
A constipação é um distúrbio gastrointestinal comum, e os tratamentos atuais frequentemente apresentam limitações. A Fórmula Shengdu Pingmu (SDPF), uma formulação modificada derivada da Medicina Tradicional Chinesa, tem sido usada clinicamente para tratar constipação, mas seu mecanismo de ação ainda não está claro. Este estudo utilizou a análise UPLC-Q/TOF-MS para identificar 188 compostos na SDPF, dos quais 50 foram confirmados de forma conclusiva. Em experimentos com animais, o tratamento com SDPF melhorou significativamente a propulsão intestinal, aumentou o teor de água fecal e encurtou o tempo até a primeira fezes pretas. A farmacologia de rede e as análises de acoplamento molecular sugeriram o envolvimento da via PI3K/AKT, que foi posteriormente validada pela observação de regulação para cima dessa via e pelo aumento da expressão de AQP3 e AQP8 no reto. Além disso, o sequenciamento do gene 16S rRNA revelou que a SDPF restaurou a homeostase da microbiota intestinal ao elevar bactérias benéficas como Lactobacillus e Bacteroides , ao mesmo tempo em que reduziu as bactérias associadas à inflamação. Coletivamente, a SDPF alivia efetivamente a constipação por meio de mecanismos que regulam a via PI3K/AKT e modulam a microbiota intestinal.
A constipação é um distúrbio gastrointestinal generalizado caracterizado por evacuações pouco frequentes, esforço e fezes duras, afetando aproximadamente 20% da população mundial com implicações socioeconômicassignificativas. A constipação crônica não só causa complicações físicas, como hemorróidas, fissuras anais e impactação fecal, mas também contribui para o sofrimento psicológico, incluindo ansiedade e depressão, comprometendo gravemente a qualidade de vida dospacientes 2. Terapias convencionais, incluindo laxantes osmóticos e suplementação com fibras alimentares, frequentemente apresentam resultados subótimos devido à eficácia limitada, possíveis efeitos colaterais e risco dedependência 3. A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) oferece uma abordagem holística, utilizando formulações herbais e acupuntura para regular a motilidade intestinal ao restaurar o fluxo do Qi e a homeostasevisceral 4. No entanto, a falta de protocolos padronizados e clareza mecanicista limita uma adoção clínica mais ampla. Pesquisas emergentes destacam o potencial de intervenções inovadoras, como a modulação da microbiota intestinal e compostos bioativos derivados da MTC, que podem melhorar sinergicamente a função intestinal com efeitos adversosmínimos 5. Consequentemente, o desenvolvimento de uma terapia integrativa baseada em evidências, que combina princípios da MTC com a farmacoterapia moderna, tem potencial para revolucionar o manejo da constipação.
A constipação de trânsito lento (STC) é um modelo patológico vital em pesquisa básica, simulando efetivamente o característico transtorno de motilidade da constipação humana — trânsito cólico significativamenteatrasado 6. Ele serve como um "decodificador" para elucidar os mecanismos moleculares da constipação, permitindo que pesquisadores examinem diretamente as alterações patológicas no tecidoretal 7, no sistema nervosoentérico 8, nas células intersticiais de Cajal9 e nas vias principaisde sinalização 10, conectando assim sintomas macroscópicos com anomalias celulares e moleculares além do alcance dos estudosclínicos 11. Internacionalmente, métodos estabelecidos para desenvolver modelos de STC em ratos incluem principalmente abordagens induzidasquimicamente 12, notadamente usando loperamida — um agonista periférico do receptor opioide que suprime a atividade neuronal e a liberação de acetilcolina para induzir consistentemente atraso no trânsito em 5–7 dias — e estratégias que imitam aetiologia 13, como a administração prolongada de laxantes estimulantes em alta dose, que leva ao comprometimento do nervo cólon, melanose coli, e subsequente inércia do cólon dependente de laxantes. Assim, o modelo do rato STC não apenas oferece uma janela para a complexa etiologia da constipação, mas também serve como uma ponte crucial que conecta conhecimentos mecanicistas básicos às aplicações clínicas.
A Fórmula Shengdu Pingmu (SDPF), composta por Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), é uma preparação hospitalar modificada derivada da teoria da Medicina Tradicional Chinesa e tem sido usada há muito tempo em nosso departamento para distúrbios relacionados. Observações clínicas preliminares do nosso hospital sugeriram que a SDPF pode aliviar os sintomas de constipação (dados não publicados). Pesquisas demonstraram que a via de sinalização PI3K/AKT está envolvida na regulação da motilidade docólon 14, na qual a microbiota intestinal e seus metabólitos podem desempenhar um papel crítico ao modular as atividades neurais entéricas e músculoslisos 15. No entanto, os mecanismos regulatórios precisos ainda são incompletamente compreendidos. Propomos que a via PI3K/AKT e a microbiota intestinal formam juntas um eixo essencial para regular a motilidade do cólon. Hipotetiza-se que os efeitos terapêuticos das formulações da MTC sobre a dismotilidade do cólon podem estar associados à modulação da via PI3K/AKT e ao reequilíbrio do eixo microbiota-intestino. Este estudo aborda essa lacuna propondo e testando uma hipótese nova e integrada: que a via PI3K/AKT e a microbiota intestinal funcionam como um eixo crítico e interdependente para a motilidade do cólon. O objetivo principal deste trabalho é determinar se o efeito terapêutico da SDPF na constipação de trânsito lento é mediado pela modulação dupla desse eixo. Especificamente, usando um modelo de ratos, investigamos os efeitos do SDPF nas principais proteínas sinalizadoras PI3K/AKT, alterações na composição da microbiota intestinal e na função de motilidade do cólon. Ao elucidar esse mecanismo combinado, esta pesquisa fornece, até onde sabemos, a primeira evidência experimental para um eixo microbiota-PI3K/AKT como alvo unificado de intervenção baseada em MTC, oferecendo assim uma base molecular mais abrangente para o tratamento dos distúrbios de motilidade do cólon.
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Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institutos Nacionais de Saúde, revisado em 2011) e foram aprovados pelo Conselho de Ética da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (Licença de Ética em Bem-Estar: SDUTCM20250421238).
Preparação do SDPF
A mistura herbal consiste em Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Essa razão combinativa foi determinada com base na experiência clínica. A fórmula foi extraída primeiro por imersão em água desionizada em uma proporção sólido-líquido de 1:9 (g/mL) por 30 min, seguida de fervura por 60 min. A solução resultante foi imediatamente filtrada através de gaze e centrifugada a 4.500 × g por 5 minutos para coletar o sobrenadante. O resíduo foi então reextraído duas vezes sob as mesmas condições (razão 1:9, água desionizada), com um tempo de ebulição reduzido de 30 minutos para cada extração subsequente. Os supernadantes das três extrações foram combinados, concentrados e liofilizados a vácuo por 5 a 7 dias para obter o pó SDPF, que foi armazenado sob refrigeração para uso posterior.
Análise dos constituintes da SDPF
Para preparar amostras sólidas, uma quantidade adequada de material homogeneizado foi transferida para um tubo centrífugo de 2 mL, combinado com 1 mL de metanol a 70% em água e esferas de aço inoxidável de 3 mm, depois processado em um moedor automatizado por 3 minutos, seguido por 10 minutos de vórtice. Amostras líquidas foram diluídas com metanol puro e em vórtice por 10 minutos. Posteriormente, todas as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C, e os supernadantes resultantes foram filtrados através de um filtro de 0,22 μm. Antes da análise instrumental, a 2-clorofenilalanina (padrão interno, 100 μg/mL) foi incorporada ao filtrado para alcançar uma concentração final de 1 mg/L. A separação cromatográfica foi realizada em um sistema LC-MS equipado com uma coluna de C18 (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), mantida a 30 °C, com vazão de 0,3 mL/min. A fase móvel consistia em 0,1% de ácido fórmico na água (A) e acetonitrila pura (B). O volume de injeção foi ajustado para 2 μL, e o autoamostrador foi mantido em 4 °C. A detecção por espectrometria de massa foi realizada em modos de ionização positiva e negativa sob as seguintes condições: temperatura do aquecedor a 325 °C, gás da bainha a 45 unidades arbitrárias, gás auxiliar a 15 arb, gás de varredura a 1 arb, tensão de eletrospray a 3,5 kV, temperatura capilar a 330 °C e nível de RF da lente S a 55%. Os dados foram adquiridos em uma faixa m/z de 100–1500 em modo MS de varredura completa com resolução de 120.000, enquanto a fragmentação MS/MS foi realizada em modo de aquisição dependente dos dados (dd-MS2, TopN=5) com resolução de 60.000 usando dissociação colisional de energia mais alta.
Experimento com animais
Setenta e dois ratos machos de Sprague-Dawley (com 6 semanas de idade, peso corporal inicial de 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) foram alojados sob condições de FPS (24 ± 1 °C, ciclo de 12 horas luz/escuro) com acesso livre a alimentos e água. Após uma semana de aclimatação, eles foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n=12/grupo) com base no peso corporal: (1) controle em branco (soro fisiológico normal), (2) grupo modelo de constipação (10 mg/kg de cloridrato de loperamida), (3) grupos baixos (SDPF-L), (4) grupos médios (SDPF-M) e (5) grupos SDPF em dose alta (SDPF-H) (6, 9 e 12 g/kg, respectivamente), e (6) controle positivo (2 mg/kg de citrato de mosaprida). O SDPF era preparado fresco em uma suspensão em água destilada em concentrações de 3, 4,5 e 6 g/mL e administrado por gavage oral em volume fixo de 2 mL/kg, correspondendo a doses de 6, 9 e 12 g/kg, respectivamente. O cloridrato de loperamida era preparado fresco em suspensão em água destilada a uma concentração de 5 mg/mL e administrado por gavage oral em volume fixo de 2 mL/kg (equivalente a 10 mg/kg). Após uma semana de aclimatação, a constipação foi induzida em grupos (2) – (6) pela aplicação oral de cloridrato de loperamida uma vez ao dia durante uma semana. O grupo controle em branco recebeu um volume equivalente de soro fisiológico normal. Posteriormente, na semana seguinte, ratos dos grupos (3)–(5) receberam tratamento com SDPF via gavage oral uma vez ao dia, o grupo controle positivo (6) recebeu citrato de mosaprida (2 mg/kg) simultaneamente, enquanto ratos dos grupos (2) – (6) continuaram a receber cloridrato de loperamida (10 mg/kg) uma vez ao dia para manter o modelo de constipação. O grupo de controle em branco continuou recebendo soro fisiológico normal. Ao final do período de tratamento, todos os ratos eram jejuados durante a noite com acesso livre à água. Os animais foram então anestesiados com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg/kg de peso corporal). Após anestesia profunda confirmada pela ausência de reflexos pedais, os ratos foram eutanasiados por luxação cervical. Imediatamente depois, os tecidos retais foram rapidamente extraídos. Para análises histológicas e imunohistoquímicas, os segmentos de tecido foram fixados em 4% de paraformaldeído. Para análise de expressão proteica, amostras de tecido foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C até novo uso.
Primeira fezes preta
O tempo até a excreção da primeira fezes preta foi registrado para três ratos por grupo. Antes do experimento, todos os ratos eram jejuados por 12 horas com acesso livre à água. Cada animal então recebeu uma administração intragástrica de uma suspensão de tinta preparada (5% carvão ativado e 5% goma arábica) em uma dose de 10 mL/kg de peso corporal, com o tempo exato de administração registrado. Após o galo, os ratos foram alojados individualmente em gaiolas separadas, com acesso ad libitum a comida e água. A aparição das primeiras fezes pretas de cada rato foi cuidadosamente observada e registrada para calcular o tempo de trânsito intestinal.
Conteúdo de água fecal
Após o estabelecimento bem-sucedido do modelo e ao final do tratamento, amostras fecais frescas excretadas em até 2 horas foram coletadas de cada grupo de ratos (n = 6) e colocadas em tubos EP secos pré-pesados. O peso úmido das fezes foi imediatamente registrado. Posteriormente, as amostras foram transferidas para um forno de secagem e desidratadas a 60 °C por 36 horas. Após o período inicial de secagem, as amostras eram pesadas e devolvidas ao forno, com as medições de peso repetidas a cada 2 horas até atingir o peso constante (indicando desidratação completa). A porcentagem de teor de água fecal foi então calculada usando a seguinte fórmula:
Conteúdo de água fecal (%) = [(Peso úmido - Peso seco) / Peso úmido] × 100%
Taxa de propulsão intestinal
Após um período de jejum de 12 horas (com acesso livre à água), ratos de cada grupo (n = 6) receberam uma dose intragástrica (10 mL/kg) de suspensão de tinta contendo 5% de carvão ativado e 5% de goma arábica. Vinte e cinco minutos depois, os animais foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 5% de cloral hidrato. A região abdominal foi desinfetada com limpeza com etanol a 75% antes da coleta do tecido, e os membros foram então fixados em uma placa de dissecação. A cavidade abdominal foi cuidadosamente exposta com tesoura cirúrgica, e o trato intestinal, do pilor até a junção ileocecal, foi excisado. O intestino isolado foi endireitado sobre papel filtro estéril, e duas medições foram registradas: (1) o comprimento total do intestino delgado e (2) a distância percorrida pela frente da tinta. A razão de propulsão intestinal foi então calculada usando a seguinte fórmula:
Taxa de propulsão intestinal (%) = (Distância de migração da tinta / Comprimento intestinal total) × 100%
Mancha HE
Para os grupos controle, modelo, SDPF-M e Mos (n = 3 por grupo), amostras retais foram coletadas e processadas para coloração de hematoxilina e eosina (HE). As amostras foram fixadas em 4% de paraformaldeído, desidratadas em etanol graduado e incorporadas em blocos de parafina. Seções finas, medindo 4–5 μm de espessura, foram preparadas e fixadas em lâminas de vidro antes da coloração convencional por hematoxilina e eosina. O procedimento começou com desparafinização usando xileno, seguida de reidratação por meio de uma série de concentrações descendentes de etanol. Os núcleos foram coloridos expondo seções à hematoxilina por 5–8 minutos. Após diferenciação em álcool ácido a 1% e azulamento em água de amônia a 0,2%, o citoplasma e a matriz extracelular foram contra-coloridos com eosina por 1–2 minutos. Por fim, as seções manchadas foram desidratadas, limpas e montadas com coberturas para observação microscópica. Essa abordagem permitiu uma avaliação detalhada da morfologia da mucosa intestinal, incluindo a estrutura das vilosidades e criptas, a condição das células epiteliais e a presença de infiltrados inflamatórios na lâmina própria.
Análise de enriquecimento de vias KEGG e GO
Aproveitando o perfil químico previamente estabelecido do SDPF, as previsões de sílico dos alvos proteicos para cada componente foram realizadas usando a plataforma SwissTargetPrediction. Alvos supostos relevantes para constipação foram filtrados e submetidos a anotação funcional usando o banco de dados DAVID 6.8, com corte de significância de P < 0,05. O conjunto de genes resultante foi posteriormente submetido à classificação GO para elucidar seus papéis nos processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares. Para elucidar ainda mais seu envolvimento na patogênese da doença, esses alvos foram posteriormente mapeados para as vias KEGG, revelando várias cascatas de sinalização significativamente enriquecidas e potencialmente implicadas no aparecimento e desenvolvimento da constipação.
Construção da rede "Caminho-Componente-Alvo"
Uma rede "Caminho-Componente-Alvo" foi montada no Cytoscape (versão 3.6.1) integrando sistematicamente os constituintes químicos da SDPF, seus respectivos alvos terapêuticos para constipação e as vias enriquecidas relevantes. Dentro desse modelo gráfico, diferentes geometrias de nós foram empregadas para representar os três tipos de dados: círculos para compostos, triângulos para alvos e retângulos para caminhos. A força das conexões entre esses nós foi quantificada por meio da ponderação das arestas, fornecendo uma visão holística das intrincadas interações farmacológicas multilayer.
Acoplamento molecular
Para a análise de acoplamento molecular, quatro compostos bioativos — a saber, Ciclocurcumina, Albiflorina, Ácido clorogênico e Quercetina — foram selecionados como moléculas de ligando, com suas estruturas baixadas do banco de dados PubChem usando números de registro CAS correspondentes. Para preparar os receptores proteicos, a base de conhecimento UniProt foi consultada para confirmar as proteínas-alvo PI3K e AKT, e suas estruturas tridimensionais foram posteriormente recuperadas do Banco de Dados de Proteínas RCSB. Essas estruturas de proteínas e compostos foram então processadas no Discovery Studio 2019, onde átomos de hidrogênio foram adicionados, cargas atribuídas e tipos de átomos definidos; Além disso, foram identificados bolsões potenciais de ligação nos receptores. Os ligantes e receptores preparados foram posteriormente salvos no formato PDBQT para simulações de acoplamento. O procedimento de acoplamento foi realizado com a seguinte configuração: raio de cluster de pose de 0,5, geração de 10 conformações aleatórias de ligantes e 10 orientações de refinamento. Após a conclusão das passagens de acoplagem, os complexos candidatos foram avaliados e classificados de acordo com suas energias livres de ligação previstas. As poses de ligação mais favoráveis energeticamente foram finalmente selecionadas e visualizadas usando PyMOL para ilustrar interações intermoleculares chave.
Imunohistoquímica
Amostras retais embutidas em parafina, cortadas a 4 μm de espessura e obtidas das coortes de tratamento Controle, Modelo e SDPF-M, foram primeiro eliminadas de parafina e progressivamente hidratadas. Os sítios antigênicos foram desmascarados aquecendo as lâminas em tampão de citrato ajustadas ao pH 6,0. Para extinguir as peroxidases endógenas, os tecidos foram tratados com uma solução de peróxido de hidrogênio a 3%, seguida de incubação com soro de cabra normal para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos. As seções foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários direcionados a PI3K fosforilada e AKT; Seções paralelas incubadas com PBS serviam como controles negativos. Após lavagem completa, anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte foram aplicados, e a imunocoloração foi desenvolvida usando um cromógeno DAB sob observação microscópica para controlar o tempo de reação. Por fim, os tecidos foram levemente contra-tingidos com hematoxilina, desidratados por álcoois graduados, limpos e montados. Os níveis de expressão de p-PI3K e p-AKT foram avaliados qualitativamente por dois pesquisadores independentes cegamente aos grupos experimentais, e imagens representativas foram selecionadas para ilustrar as diferenças entre os grupos.
Western blot
Amostras de tecido retal de ratos foram enxaguadas duas vezes com soro salino fosfatado resfriado antes de serem homogeneizadas no gelo por 10 minutos em um volume adequado de tampão de lise RIPA. Após a homogeneização, a mistura foi centrifugada a 15.000 × g, e o sobrenadante foi mantido para análise. A quantificação da proteína foi realizada utilizando o método do ácido bicinconínico. Posteriormente, as amostras foram combinadas com o buffer de carregamento SDS e desnaturadas por incubação a 95 °C por 5 minutos. Quantidades equivalentes de proteína foram então resolvidas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e eletrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno com tamanho de poros de 0,45 μm. Após a transferência, as membranas foram deixadas secar ao ar antes de serem bloqueadas com leite seco desnatado 5% em TBST por 1 hora na temperatura ambiente. Após essa etapa, as membranas foram enxaguadas com TBST e incubadas durante a noite a 4 °C, com anticorpos primários direcionados para AQP3 (RRID: AB_2837708) e AQP8 (RRID: AB_605941). No dia seguinte, após lavagens adicionais com TBST, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte apropriado por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas imunorreativas foram finalmente detectadas e capturadas usando um sistema de imagem.
Imunofluorescência
O procedimento de coloração por imunofluorescência foi realizado em seções de tecido retal de ratos tratados com Controle, Modelo e SDPF-M da seguinte forma: após a criossecção, os tecidos foram fixados em paraformaldeído a 4%, permeabilizados com 0,1% de Triton X-100 e bloqueados com um tampão bloqueador adequado para evitar ligação inespecífica. As seções foram então incubadas durante a noite a 4 °C com uma mistura de anticorpos primários contra AQP3 e AQP8, após o que os anticorpos não ligados foram lavados e os tecidos incubados por 1 hora em temperatura ambiente, no escuro, com uma mistura de anticorpos secundários — especificamente, IgG anti-coelho de cabra conjugado a Alexa Fluor 594 (vermelho) para marcar AQP3 e IgG anti-camundongo conjugado com Alexa Fluor 488 (verde) para marcar AQP8. Após incubação secundária de anticorpos e lavagens subsequentes, núcleos celulares foram contra-coloridos com DAPI, e as lâminas foram cobertas com um meio aquoso de montagem antes da visualização e aquisição de imagem usando microscópio fluorescente ou confocal.
Sequenciamento de rRNA 16S da microbiota fecal
Para cada grupo experimental (n = 8), DNA genômico bacteriano foi isolado de material fecal de rato usando um Kit de Extração de DNA de Solo comercial, com todos os procedimentos seguindo rigorosamente o protocolo do fornecedor. A amplificação por PCR direcionada às regiões hipervariáveis V3–V4 do gene 16S rRNA foi realizada em um ciclador térmico usando o par de primers 338F/806R. O sequenciamento com amplicons foi realizado na plataforma Illumina MiSeq de acordo com as diretrizes do fabricante, gerando profundidade suficiente de sequenciamento para alcançar a saturação da curva de rarefação e garantir uma análise confiável de diversidade microbiana. Após a conclusão do sequenciamento, as leituras brutas eram filtradas pela qualidade, removidas pelo adaptador e fundidas usando Trimmomatic e FLASH. Sequências de alta qualidade foram posteriormente agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com um limiar de similaridade de 97% usando o UPARSE, e possíveis sequências quiméricas foram identificadas e removidas usando o UCHIME. A atribuição taxonômica de sequências representativas foi realizada usando o classificador RDP contra o banco de dados de referência SILVA, com um limiar de confiança de 70%. Para avaliar a diversidade alfa dentro das comunidades microbianas, o estimador de riqueza de Chao1 e o índice de diversidade de Shannon foram calculados usando o pacote de software Mothur (v.1.30.2). Para análise de beta-diversidade, foi realizada a análise de coordenadas principais para visualizar as diferenças composicionais entre grupos. Um diagrama de Venn foi construído para ilustrar a distribuição de OTUs únicas e compartilhadas entre diferentes condições experimentais. A identificação de táxons diferencialmente abundantes entre coortes foi realizada usando análise discriminante linear tamanho do efeito. Por fim, o perfil preditivo das funções da comunidade microbiana foi realizado usando PICRUSt2, que inferiu potencial funcional a partir das anotações ortológicas do KEGG.
Estatísticas
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 23.0 e GraphPad Prism 8.0. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. Para comparações entre dois grupos, o teste t de Student com amostras independentes foi usado para dados normalmente distribuídos, e o teste U de Mann–Whitney foi usado para dados distribuídos de forma não normal. Para comparações envolvendo três ou mais grupos, a análise unidirecional da variância (ANOVA) seguida pelo teste pós-hoc de Tukey foi empregada para dados normalmente distribuídos, enquanto o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste pós-hoc de Dunn foi usado para dados não distribuídos normalmente. Para análises do microbioma, táxons diferencialmente abundantes foram identificados usando análise discriminante linear tamanho do efeito (LEfSe) com o limiar padrão (escore LDA > 2,0), e a correção múltipla foi aplicada usando o método da taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini–Hochberg. Análises estatísticas do microbioma foram realizadas usando Mothur (v.1.30.2), LEfSe (ferramenta online, laboratório Huttenhower) e PICRUSt2 (v.2.5.0). Um valor-p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Extração e liofilização de SDPF
SDPF é uma formulação multiervas composta por cinco plantas medicinais: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Figura 1A). A mistura foi extraída com água purificada e liofilizada até virar pó para análise posterior (
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Constipação crônica é um distúrbio multifatorial que envolve interações complexas entre a disbiose da microbiota intestinal, a função neuromuscular comprometida e a secreção intestinal alterada. Essas manifestações persistem por mais de seis meses e prejudicam significativamente a qualidade de vida dospacientes 19. A constipação pode ser categorizada em vários subtipos, incluindo trânsito lento, trânsito normal, transtorno da defecação e tiposmis...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (subsídio nº JCYJ20220531092203007).
Somos profundamente gratos ao Dr. Liqun Qu, da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong, por fornecer orientação técnica no estabelecimento do modelo de constipação de ratos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Moedor automatizado | Homogeneizador de tecidos de alto rendimento para moagem de amostras | JXFSTPRP-48 | |
| Sistema LC-MS | Thermo Fisher Scientific | Q Sistema LC-MS exativo de HF | Cromatografia líquida de ultra-alta performance – Sistema de espectrometria de massa |
| Espectrômetro de massa | Thermo Fisher Scientific | Q HF exativo | Espectrômetro de massa Orbitrap de alta resolução |
| Coluna C18 | Tecnologias Agilent | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 e vezes 100 mm, 1,8 e mu; m) | Coluna de fase reversa para separação composta |
| Sistema de varredura de imagem | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | Sistema de imagem em gel e blot |
| Termociclador | Biossistemas Aplicados (Thermo Fisher Scientific) | Sistema de PCR GeneAmp 9700 | Instrumento de amplificação por PCR |
| Kit de Extração de DNA do Solo | Omega Bio-Tek | D5625 | Kit para extração de DNA microbiano de amostras fecais/solo |
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