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Artigo de método

Sequenciamento de RNA de célula única do tecido pulmonar em um modelo de rato para síndrome de desconforto respiratório agudo

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DOI:

10.3791/70491

⸱

7 de abril de 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo padronizado para análise de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) de tecido pulmonar em um modelo de rato da Síndrome de Desconforto Respiratório Agudo (SDRA). Ele detalha etapas desde o estabelecimento do modelo induzido por LPS até a análise bioinformática, identificando 21 agrupamentos celulares e 6 subpopulações de macrófagos, e destaca vias inflamatórias chave envolvidas na patogênese do SDRA.

Resumo

A Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) é uma condição inflamatória pulmonar grave com alta mortalidade, caracterizada por respostas imunes desreguladas e danos alveolares, mas sua heterogeneidade celular permanece incompletamente compreendida. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) oferece uma resolução sem precedentes para dissecar mecanismos específicos de cada tipo celular, mas sua aplicação no ARDS é dificultada pela variabilidade técnica. Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para análise de scRNA-seq de tecido pulmonar em um modelo de SDRA induzido por lipopolissacarídeos (LPS). Esse método inclui dissociação de tecidos otimizada, rigoroso controle de qualidade, remoção de duplos, correção de efeito em lote e pipelines abrangentes de bioinformática para clustering, anotação e análise de expressão diferencial. Nossa abordagem identifica de forma confiável 21 populações celulares distintas e revela seis subpopulações de macrófagos/monócitos com assinaturas transcricionais únicas no ARDS. A análise específica de expressão gênica diferencial e enriquecimento funcional específica de subaglomerados identificou ainda mais genes e vias fundamentais para a patogênese do SDRA. Esse fluxo de trabalho reproduzível permite a caracterização aprofundada da diversidade celular, vias inflamatórias e alvos terapêuticos candidatos, fornecendo uma base sólida para estudos mecanicistas e translacionais em SDRA.

Introdução

A Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) é uma doença respiratória aguda caracterizada por inflamação pulmonar difusa e edema pulmonar não cardiogênico, que se manifesta principalmente como hipoxemia progressiva e insuficiênciarespiratória 1,2. Os mecanismos patológicos do SDRA envolvem cascatas inflamatórias desreguladas, ruptura da barreira alveolar-capilar, e ativação e interações anormais de múltiplos tipos de células imunes 3,4. Durante a progressão do SDRA, células imunes no tecido pulmonar impulsionam cascatas inflamatórias por meio da secreção de mediadores inflamatórios e modulação das respostas imunológicas, interrompendo assim o endotélio pulmonar, desencadeando a ativação da cascata de coagulação extraínseca e agravando a lesão pulmonar 5,6,7. No entanto, o entendimento atual dos mecanismos patológicos em nível celular no SDRA permanece limitado, o que restringe o desenvolvimento de terapias farmacológicas específicas, enquanto as estratégias atuais de manejo consistem principalmente em várias modalidades de suporte ao oxigênio e ventilaçãomecânica 1. A caracterização aprofundada da heterogeneidade celular e das mudanças dinâmicas durante a patogênese do SDRA é de extrema importância para identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver novas estratégias de tratamento 8,9,10.

O surgimento da tecnologia de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) trouxe avanços revolucionários para a pesquisa em sequenciamento de RNA, permitindo-nos dissecar a heterogeneidade celular e a dinâmica funcional na patogênese dadoença 11,12. Comparada ao sequenciamento tradicional de RNA em massa, a tecnologia scRNA-seq pode identificar subpopulações celulares raras, porém críticas, revelar processos dinâmicos de transições de estado celular e descobrir redes complexas de interação intercelular, informações frequentemente mascaradas em análises em nívelpopulacional 13,14,15. Estudos recentes de scRNA-seq em SDRA alcançaram avanços significativos, incluindo a identificação de assinaturas específicas de expressão gênica de monócitos, a descoberta de padrões anormais de polarização de macrófagos e a elucidação de redes de comunicação intercelularprofibrosas 16,17,18,19 . Essas descobertas não apenas aprofundam nossa compreensão dos mecanismos fisiopatológicos do SDRA, mas também fornecem novos insights sobre o desenvolvimento de biomarcadores, estratificação de doenças e terapia de precisão20,21.

No entanto, a pesquisa atual sobre SCRNA-seq do ARDS enfrenta desafios, incluindo padronização metodológica insuficiente, diferenças substanciais nos protocolos de processamento de amostras e pipelines de análise de dados inconsistentes, que limitam a reprodutibilidade dos resultados da pesquisa e suas aplicações translacionaisclínicas 22,23. Este protocolo aborda os desafios técnicos associados à análise de scRNA-seq do tecido pulmonar do ARDS, otimizando procedimentos para processamento de tecidos, controle de qualidade e análise de dados, fornecendo assim uma base para estudos mecanicistas e desenvolvimento terapêutico. A abordagem padronizada garante reprodutibilidade entre diferentes laboratórios e facilita estudos comparativos na pesquisa de ARDS sobre heterogeneidade celular.

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Protocolo

Doze ratos machos específicos livres de patógenos (FPS) Sprague-Dawley (SD), com idades entre 6 e 7 semanas e pesando 220 g ± 10 g, foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Número da Licença do Animal: SCXK (Jing) 2025-0008). Os ratos foram alojados no Centro de Animais de Laboratório do Hospital Dongzhimen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, em conformidade com a norma nacional "Requisitos de Animais de Laboratório para o Ambiente e Instalações de Habitação" (GB 14925-2010, emitida pelo Comitê Técnico Nacional de Padronização de Animais de Laboratório da China). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética do Hospital Dongzhimen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (Número de Aprovação: 24-54). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de modelos e coleta de amostras

NOTA: Antes do experimento, submeta todos os ratos a um período de aclimatação de 1 semana para minimizar os efeitos induzidos pelo estresse.

  1. Dissolva lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS) em soro fisiológico a 0,9% para obter uma solução de LPS de 0,4 mg/mL.
  2. Divida aleatoriamente 12 ratos Sprague-Dawley (SD) machos do SPF em dois grupos: um grupo controle (n = 6) e um grupo modelo ARDS (n = 6).
  3. Administrar soro fisiológico a 0,9 % por injeção intratraqueal, em uma dose de 0,5 mL/100g de peso corporal, ao grupo controle.
  4. Administrar a solução de LPS de 0,4 mg/mL via injeção intratraqueal no mesmo volume (0,5 mL/100g) no grupo modelo ARDS e, após 16 horas, anestesiar os ratos usando isoflurano (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
  5. Colete sangue pela aorta abdominal, depois centrifuge (4 °C, 1000 × g, 30 min) para obter soro.
  6. Abra a cavidade torácica e extraia o tecido pulmonar.
  7. Realize lavagem broncoalveolar através do coto brônquico usando uma seringa para obter Fluido de Lavagem Broncoalveolar (BALF)24,25.
  8. Colha o lobo do pulmão direito e enxágue-o com PBS para exame patológico posterior.
  9. Colhe o lobo do pulmão esquerdo e enxágue com PBS para subsequentes experimentos de sequenciamento unicelular ebiologia molecular 26,27.

2. Avaliação histopatológica do tecido pulmonar

  1. Imerga o tecido do pulmão direito colhido de ratos em paraformaldeído a 4% para fixação por 12 horas.
  2. Após a fixação, desidrate o tecido por meio de uma série graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%), permitindo 2 horas em cada concentração.
  3. Trate o tecido desidratado com xileno até que fique transparente.
  4. Infiltre o tecido transparente com parafina derretida em um forno a 60 °C por 2 horas.
  5. Coloque o bloco de tecido infiltrado em um molde de embustionamento, despeje parafina fresca e deixe que esfrie e solidifique em um bloco de parafina.
  6. Divida o bloco de parafina em fatias de 4 μm de espessura usando um micrótomo, flutue as seções em um banho-maria a 45 °C para espalhá-las e depois as recolha com lâminas revestidas de poli-L-lisina.
  7. Asse os lâminas em um forno a 60 °C para garantir uma adesão firme das seções aos lâminas.
  8. Desparafinize as seções por imersão em xileno e reidrate-as através de um gradiente descendente de etanol (100%, 95%, 90%, 80% e 70%).
  9. Enxágue as seções com PBS, realize tingimento de hematoxilina e eosina (HE) e monte as coberturas usando resina neutra.
  10. Avalie a lesão pulmonar em seções escaneadas por lâmina inteira usando um sistema padronizado de pontuação baseado na infiltração de neutrófilos, inflamação intersticial, edema e congestão.
    NOTA: Cada parâmetro foi pontuado de 0 a 4 com base no grau de envolvimento patológico: 0 (nenhum); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Ensaio imunossorvente ligado a enzimas

NOTA: As amostras podem ser mantidas em -80 °C se a análise não puder ser realizada imediatamente após a aquisição.

  1. Dissolva os padrões e deixe-os em temperatura ambiente por 15 minutos, depois realize a diluição serial conforme as instruções do fabricante.
  2. Prepare a solução de trabalho com anticorpos biotinilados, a solução de trabalho conjugada enzimática e o tampão de lavagem conforme instruído no manual.
  3. Adicione 100 μL de cada amostra ou 100 μL de padrões serialmente diluídos aos poços revestidos por anticorpos e incube a 37 °C por 90 minutos.
  4. Lave a placa 4 vezes usando uma arruela de placa, adicione 100 μL de solução de trabalho de anticorpos biotinilados e incube a 37 °C por 30 minutos.
  5. Lave a placa 4 vezes, adicione 100 μL de solução de trabalho conjugada enzimática e incube a 37 °C por 30 minutos.
  6. Adicione 100 μL de solução de substrato por poço, incube protegido da luz a 37 °C por 10 minutos.
  7. Adicione 100 μL de solução de parada por poço, misture suavemente e meça a densidade óptica (OD) a 450 nm usando um leitor de microplaca.
  8. Gere uma curva padrão plotando os valores de OD em relação às concentrações padrão usando o software projetado.
  9. Determine as concentrações amostrais com base nos valores de OD medidos e na curva padrão.

4. Preparação de suspensões de célula única para sequenciamento

NOTA: Após a obtenção do tecido pulmonar, ele deve ser colocado no gelo e processado rapidamente para manter a viabilidade celular.

  1. Lave o tecido pulmonar 3 vezes com PBS pré-resfriado a 4 °C.
  2. Adicione 2 mL de PBS pré-resfriado e depois triture em fragmentos menores usando tesoura estéreis, até aproximadamente 0,5mm 3 polegadas.
  3. Use uma pipeta Pasteur para transferir o tecido picado junto com PBS para um tubo centrífugo de 15 mL.
  4. Adicione mais 1 mL de PBS pré-resfriado a 4 °C na placa de cultura, enxágue e ressuspenda os fragmentos de tecido restantes, e transfira a suspensão para o mesmo tubo.
  5. Ajuste o volume para 6,5 mL com PBS pré-resfriado a 4 °C, digera fragmentos de tecido em solução enzimática contendo Colagênase I (100 U/mL) e Dispase II (1 U/mL), e incube com sacudidas suaves em temperatura ambiente por 30 minutos.
  6. Quando os fragmentos de tecido se tornam translúcidos e não restam pedaços sólidos distintos, filtre-se o tecido digerido através de peneiras celulares de 70 μm e 40 μm, depois centrifuge (4° C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  7. Imediatamente resuspenda o pellet em 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC), misture suavemente pipetando e lise no gelo por 10 minutos.
  8. Quando o sobrenadante aparecer amarelo claro ou quase incolor, adicione 7 mL de PBS para terminar a reação, centrifuge (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  9. Adicione 3 mL de PBS para ressuspender as células e determinar a concentração e viabilidade celular usando coloração com azul de tripán.
    NOTA: Se a viabilidade celular estiver abaixo de 70%, realize um procedimento de remoção de células mortas.
  10. Lave as células duas vezes com um tampão contendo 0,04% de albumina sérica bovina (BSA) preparada em DPBS.
  11. Suspenda as células para contagem e ajuste a concentração para 1.000 células/μL para carregamento e detecção subsequentes.

5. Controle de qualidade para dados de sequenciamento de célula única

NOTA: Bibliotecas de RNA de célula única foram preparadas a partir de suspensões celulares usando um método de construção de biblioteca de célula única baseado em gotas. As bibliotecas eram sequenciadas em uma plataforma de alta capacidade usando química de sequenciamento baseada em nanobolas de DNA. Aproximadamente 21.000 células foram carregadas por biblioteca, visando uma taxa de recuperação de células de ~60%. O sequenciamento gerou um total de 5,0 × 108 leituras por biblioteca, com uma profundidade média de 30.000 a 40.000 leituras por célula. Os dados brutos do sequenciamento foram processados usando o pipeline correspondente de análise de RNA de célula única para produzir a matriz de expressão gênica para cada amostra.

  1. Construa a biblioteca Oligo por PCR e rotulagem de códigos de barras, garantindo concentração >10 ng/μL e tamanho máximo de 180 pb ±10 pb.
  2. Construa a biblioteca de cDNA por fragmentação, reparo final, ligadura de adaptadores e PCR, garantindo concentração >10 ng/μL e tamanho máximo de 350–550 pb.
  3. Gerar um objeto Seurat para cada amostra a partir da matriz de expressão gênica usando a função Read10X no pacote Seurat (v4.3.0) no software R (v4.2.0).
  4. Remova células de baixa qualidade filtrando aquelas com proporção do gene mitocondrial >10% ou proporção do gene da hemoglobina >5%.
  5. Normalize os dados usando o método "LogNormalize" com um fator de escala de 10.000.
  6. Identifique características altamente variáveis usando o método "vst" e mantenha os 2.000 primeiros genes para análise a jusante.
  7. Realize a pontuação do ciclo celular usando os genes marcadores do ciclo celular incorporados ao Seurat e regresse os efeitos do ciclo celular (G2M. Score e S.Score) durante a escalonação de dados.
  8. Detectar e remover potenciais doublets usando o DoubletFinder (v2.0.3) com pN = 0,25, pK = 0,09 e uma taxa esperada de doublet de 0,06, e exclua esses de processamento posterior.
  9. Efeitos em lote corretos entre amostras usando o pacote Harmony (v0.1.1) com theta = 2 e max.iter.harmony = 20.
  10. Adicione colunas de informações para nomes de amostras individuais e detalhes de agrupamento do grupo de modelos ARDS e grupo de controle aos metadados no objeto Seurat.

6. Redução de dimensionalidade, agrupamento e anotação de tipo de célula

  1. Realize análise de componentes principais (PCA) em genes altamente variáveis usando a função RunPCA em Seurat.
  2. Determine o número ótimo de componentes principais por meio da visualização ElbowPlot.
  3. Identifique os principais clusters de células aplicando o algoritmo de Leiden via as funções FindClusters e FindNeighbors de Seurat com resolução de 0,1.
  4. Realize a redução de dimensionalidade do UMAP usando os componentes principais selecionados.
  5. Anote tipos celulares identificando genes marcadores com a função FindAllMarkers.
  6. Visualize a expressão gênica dos marcadores entre tipos celulares usando a função DotPlot.
  7. Adicione uma nova coluna de informações com os resultados das anotações de células aos metadados e visualize a anotação do tipo de célula com o Umap.
  8. Calcule a proporção de cada grupo experimental dentro de cada tipo celular identificado usando funções dplyr para contar células e calcular percentuais.
  9. Gerar gráficos de barras empilhadas com ggplot2 para ilustrar a composição de grupos por tipo de célula, incluindo rótulos percentuais e comparações estatísticas entre grupos.

7. Análise de subpopulação

  1. Extraia a subpopulação de células-alvo usando a função de subconjunto e crie um objeto Seurat correspondente para análise subpopulacional a jusante.
  2. Renormalize e reescale os dados da subpopulação enquanto regrede genes mitocondriais, genes de hemoglobina, contagens de UMI e escores do ciclo celular.
  3. Realize uma análise secundária de PCA e aplique correção em lote de Harmony especificamente para a subpopulação.
  4. Realizar reagrupamento usando funções FindNeighbors e FindClusters para identificar subtipos distintos dentro das subpopulações celulares-alvo.
  5. Gerar novos embeddings UMAP e visualizar subagrupamentos de subpopulações com anotações de tipo celular seguindo a mesma abordagem descrita anteriormente.

8. Análise diferencial de expressão gênica

  1. Identifique genes diferencialmente expressos (DEGs) entre o grupo modelo ARDS e o grupo controle para cada subcluster usando o método estatístico MAST.
  2. Incorpore regressão de variáveis latentes para controlar os efeitos de profundidade do sequenciamento durante testes de expressão diferencial.
  3. Filtre DEGs com base em limiares pré-definidos de mudança logaritarítmica e valores p ajustados usando a função FindMarkers.
  4. Gerar gráficos de vulcão com a função ggplot para cada subaglomerado para visualizar padrões diferenciais de expressão gênica com rotulagem de significância.
  5. Exportar os resultados do DEG e criar tabelas resumidas abrangentes para facilitar o enriquecimento funcional e outras análises a jusante.

9. Análise de enriquecimento

  1. Mapear símbolos genéticos para IDs ENTREZ usando a org. Rn.eg.db banco de dados de anotações para compatibilidade na análise de vias.
  2. Combine DEGs de todos os subclusters e filtre genes significativos com base nos limiaritários de mudança logaritarítmica e nos valores p ajustados (teste de soma de rank de Wilcoxon, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Realize análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) usando a função de enriquecimento GO com categorias de ontologia de Processo Biológico, Função Molecular, Componentes Celulares e método de correção de Benjamini-Hochberg.
  4. Realizar a análise de enriquecimento de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) usando a função de enriquecimento KEGG com o banco de dados de organismos de ratos e aplicar limiares de significância estatística.
  5. Gerar dot plots para os resultados de enriquecimento GO e KEGG usando a função dotplot, exibindo os 15 termos significativamente enriquecidos com razões gênicas e valores p ajustados.
  6. Exporte os resultados do enriquecimento como arquivos CSV e salve gráficos de visualização para uma interpretação abrangente da análise de caminhos.

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Resultados

A coloração HE do tecido pulmonar de rato mostrou estruturas alveolares claras com inflamação mínima nos controles, enquanto o grupo modelo ARDS apresentou cavidades alveolares distorcidas, paredes espessadas e infiltração significativa de células inflamatórias, conforme mostrado nos escores correspondentes de lesão pulmonar (Figuras 1A–E). Níveis elevados de IL-6, TNF-α e IL-1β no BALF e no soro confirmaram modelagem bem-sucedida e uma resp...

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Discussão

Este protocolo apresenta uma abordagem padronizada para análise de sequenciamento de RNA unicelular do tecido pulmonar em um modelo de rato para síndrome de desconforto respiratório agudo (SDRA). Esses resultados demonstram o estabelecimento bem-sucedido do modelo de SDRA induzido por LPS, conforme confirmado pelo exame histopatológico, escores elevados de lesão pulmonar e níveis elevados de citocinas inflamatórias em BALF e soro. A análise transcriptômica de célula única revelou 21 popu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores desejam reconhecer o apoio do Projeto Horizontal do Hospital Dongzhimen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (HX-DZM-202114).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% solução de Trypan blueGibco, EUA15250061
4% de paraformaldeídoServicebio, ChinaG1101
Albumina sérica bovina (BSA)Sangon Biotech, ChinaA600332-0005
Colagênase IYEASEN, China40507ES60
CurveExpertDesenvolvimento dos Hyamsv1.4
Dispase IIYEASEN, China40104ES60
Escherichia coli lipopolissacarídeo (LPS) Sigma, EUAL6511
Coloração de hematoxilina e eosina (HE)Solarbio, ChinaG1120
Sequenciador de genes de alta produtividade  MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Inibidor de fosfataseBeyotime Biotechnology, ChinaP1081
Solução tamponada com fosfatoSolarbio, ChinaP1020
PMSFSolarbio, ChinaR0010
R software Lucent Technologies, EUAv4.2.0
rat IL-1 & beta; Kit ELISA4abio, ChinaCRE0006
kit rat IL-6 ELISA4abio, ChinaCRE0005
rato TNF-& alfa; Kit ELISA4abio, ChinaCRE0003
Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)Solarbio, ChinaR1010
Amortecedor de lise de glóbulos vermelhosTiangen Biotech, ChinaRT122-1
Água livre de RNaseAmbion, EUAAM9937
Tampão TE, pH 8,0Ambion, EUAAM9858
Tampão de Transferência Tris-GlicinaServicebio, ChinaG2017

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