Efeitos bioquímicos e histopatológicos da hirudoterapia em um modelo de rato de estresse fisiológico crônico induzido pelo exercício

Resumo

Esse protocolo estabelece um modelo de ratos para o estresse fisiológico crônico induzido pelo exercício para investigar as respostas ao estresse. Ele possibilita a avaliação controlada das interações hirudoterapia–exercício por meio de perfil bioquímico sérico e análise histopatológica. Ela fornece uma estrutura reprodutível para estudar os mecanismos de recuperação pós-exercício.

Resumo

O exercício crônico pode induzir estresse fisiológico caracterizado por danos musculares, desequilíbrio oxidativo e alterações hormonais, potencialmente prejudicando a recuperação e o desempenho. A hirudoterapia, uma intervenção bioterapêutica tradicional que contém componentes anti-inflamatórios, antioxidantes e que melhoram a circulação, tem despertado interesse como uma possível estratégia natural de recuperação. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos bioquímicos e histopatológicos da hirudoterapia após exercício crônico em um modelo de rato de estresse fisiológico induzido pelo exercício. Trinta e dois ratos machos foram distribuídos em quatro grupos: controle, hirudoterapia, exercício e hirudoterapia mais exercício. Parâmetros bioquímicos séricos e marcadores de estresse oxidativo foram analisados, e músculos esqueléticos e tecidos hepáticos foram examinados histopatologicamente para avaliar alterações induzidas pelo exercício e potenciais efeitos moduladores da hirudoterapia. Ratos expostos a exercícios crônicos apresentaram indicadores bioquímicos e estruturais de estresse fisiológico. A hirudoterapia esteve associada à atenuação parcial dessas alterações, especialmente em achados histopatológicos, enquanto as alterações nos marcadores de estresse oxidativo não foram estatisticamente significativas. Esses achados sugerem que a hirudoterapia pode exercer um efeito modulador nos processos de recuperação pós-exercício; no entanto, estudos adicionais são necessários para esclarecer seu impacto nas vias de estresse oxidativo.

Introdução

As práticas médicas tradicionais têm sido utilizadas em uma ampla variedade de contextos clínicos para o manejo de diversas condições agudas e^{crônicas 1,2}. Entre elas, a terapia medicinal com sanguessugas (hirudoterapia) tem uma longa história de uso em diferentes culturas e sistemas médicos. Nos últimos anos, essa abordagem tradicional recuperou interesse científico devido aos seus potenciais efeitos terapêuticos em diversas condições clínicas, incluindo doenças inflamatórias, osteoartrite e distúrbios^{vasculares 1,2,3}. Esses efeitos são atribuídos principalmente à complexa mistura de moléculas bioativas presentes na saliva de sanguessugas, que apresentam propriedades anticoagulantes, anti-inflamatórias e ^{antimicrobianas 3,4,5}. Além disso, estudos experimentais em modelos animais demonstraram que a hirudoterapia pode exercer efeitos protetores contra lesão tecidular por meio de mecanismos antioxidantes, anti-inflamatórios e^{apoptóticos.}

A saliva de Hirudo verbana, a espécie mais comumente usada em terapia, contém uma variedade diversificada de componentes bioativos, incluindo hirudin, bdellin, eglin e calina, além de enzimas como hialuronidase e vários metabólitos de baixo peso molecular. Esses componentes apresentam atividades anticoagulantes, anti-inflamatórias, antioxidantes, fibrinolíticas, analgésicas e^{anticancerígenas 2,7}. Esse amplo perfil de atividade biológica sugere que a saliva de sanguessugas (LS) pode servir como uma ferramenta terapêutica complementar em aplicações biomédicas modernas; no entanto, seus efeitos sistêmicos sob condições fisiológicas específicas de estresse permanecem incompletamente^{compreendidos 3}.

Atividade física intensa ou prolongada pode induzir danos microestruturais às membranas musculares, levando a aumentos significativos nos níveis séricos de enzimas como creatina quinase (CK), lactato desidrogenase (LDH) e aspartato aminotransferase (AST). A alanina aminotransferase (ALT) também pode aumentar em resposta a lesões musculares, embora tipicamente em menor grau que o AST ^5,8,9. Além disso, exercícios de alta intensidade ou longa duração desencadeiam elevações do cortisol, um hormônio do estresse chave, com respostas variando de acordo com a intensidade do exercício, duração e status fisiológico^{individual 10,11}. Aumentos na glicose no sangue após o exercício também podem ocorrer, em grande parte impulsionados pela gluconeogênese mediada pelo cortisol, representando uma característica da resposta ao estresse^{metabólico 12}. Coletivamente, esses achados demonstram que tanto os marcadores bioquímicos de dano muscular quanto os indicadores de estresse metabólico tendem a aumentar após exercícios^{intensos 5}.

Diversas estratégias, incluindo massagem, imersão em água fria e suplementos nutricionais ricos em antioxidantes (por exemplo, polifenóis, extrato de cereja azeta e curcumina), foram investigadas quanto ao seu potencial de apoiar a recuperação pós-exercício. Revisões sistemáticas sugerem que essas intervenções podem influenciar o estresse oxidativo e os parâmetros de dano muscular; No entanto, sua eficácia varia consideravelmente entre indivíduos e pode não fornecer proteção bioquímica suficiente^{de forma consistente} 13,14,15. Assim, há um interesse crescente em explorar abordagens alternativas ou complementares que possam oferecer benefícios adicionais sob condições de estresse fisiológico induzido pelo exercício. Nesse contexto, compostos bioativos presentes na saliva de sanguessugas foram relatados como modificadores do estresse oxidativo e respostas^{inflamatórias 7}. Além disso, observações clínicas sugerem que a hirudoterapia pode reduzir a dor e a inflamação, especialmente em condições musculoesqueléticas e^vasculares.

Vários compostos identificados no LS, incluindo flavonoides, molecules fenólicas e outros constituintes bioativos, contribuem para a atenuação das respostas inflamatórias por meio da modulação das vias de estresse oxidativo. Essas propriedades antioxidantes podem agir sinergicamente com outros componentes salivares, aumentando o potencial anti-inflamatório geral da hirudoterapia ^7,16. Além disso, inibidores de proteases como bdellin e eglin demonstraram reduzir a atividade de enzimas derivadas de neutrófilos, limitando assim danos aos^{tecidos 4}. Além disso, vários peptídeos e moléculas derivadas de lipídios identificados em tecidos de sanguessugas foram relatados como exercendo efeitos inibitórios nas vias de sinalização^{inflamatória 17}.

Apesar dessas descobertas, o papel potencial da hirudoterapia no estresse fisiológico induzido pelo exercício permanece insuficientemente explorado, especialmente em modelos experimentais^{controlados 1,2,4}. Embora estudos anteriores tenham demonstrado seus efeitos anti-inflamatórios, anticoagulantes e microcirculatórios, e o exercício seja bem conhecido por induzir danos musculares e respostas ao estresse^{oxidativo 18}, estudos que integram desfechos bioquímicos, hormonais e histopatológicos dentro de um único arcabouço experimental são limitados.

Portanto, o presente estudo foi projetado para fornecer uma avaliação experimental abrangente da hirudoterapia em um modelo controlado de estresse fisiológico induzido pelo exercício, integrando resultados bioquímicos, hormonais e histopatológicos. Essa abordagem multidimensional visa contribuir para a compreensão dos potenciais efeitos moduladores da hirudoterapia e fornecer uma estrutura reprodutível para avaliar intervenções bioterapêuticas complementares.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes^{ARRIVE 19}. O protocolo do estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê Local de Ética para Experimentos com Animais da Universidade Kırşehir Ahi Evran (Aprovação nº: 06/03/2025-05-1, Turquia). Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Seleção e hospedagem de animais

Trinta e dois ratos Wistar albinos machos (RRID: RGD_2308852; 8–12 semanas de idade, 200–250 g) foram utilizados. Os animais eram alojados individualmente em gaiolas de policarbonato (40 cm × 25 cm × 20 cm) com cama de barbear de madeira. As condições ambientais foram mantidas entre 22 e 24 °C, com um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Comida e água foram fornecidas ad libitum.

Um período de aclimatação de 1 semana foi realizado antes da experimentação. Durante esse período, os animais eram monitorados diariamente quanto à ingestão de alimento, estado de hidratação, comportamento de tosa e atividade locomotora. Apenas animais que apresentavam comportamento fisiológico normal foram incluídos no estudo.

2. Grupos experimentais e randomização

Os animais foram aleatoriamente designados a quatro grupos experimentais (n = 8 por grupo) usando uma sequência de randomização gerada por computador. A ocultação da alocação foi garantida atribuindo aos animais identificadores numéricos antes da alocação do grupo. Os grupos experimentais consistiam no grupo controle (C), que não recebeu intervenção; o grupo de exercícios (E), que realizava apenas exercícios na esteira; o grupo de hirudoterapia (H), que recebia hirudoterapia apenas três vezes por semana; e o grupo combinado de hirudoterapia mais exercício (HE), que passou por ambas as intervenções de acordo com o protocolo do estudo. Todas as intervenções foram realizadas ao longo de um período de 2 semanas. Para minimizar a variabilidade circadiana, todos os procedimentos foram realizados entre 09:00 e 11:00 da manhã.

3. Protocolo de exercícios crônicos

O exercício era realizado usando uma esteira motorizada para roedores equipada com uma grade de estimulação elétrica ajustável. Os animais foram colocados em faixas individuais do aparelho da esteira (Figura 1). Uma fase de adaptação de 2 dias foi realizada a uma velocidade de 15 m/min durante 15 min/dia. Após o período de adaptação, a intensidade do exercício foi aumentada para 20 m/min, e os animais foram submetidos a sessões diárias de corrida de 45 min/dia durante 2 semanas. Um estímulo elétrico leve (1,0 mA) era aplicado via rede quando necessário para manter o funcionamento contínuo.

1. Critérios de exaustão
   Exaustão foi definida como a incapacidade de sair da grade de choque por três estimulações consecutivas (~5 s cada). Animais que atingiam esse limite eram imediatamente removidos. Esse protocolo foi adaptado a partir de modelos previamente estabelecidos de exercícios em esteira para roedores, com critérios definidos de adaptação, progressão de intensidade e exaustão²⁰.
2. Aplicação de hirudoterapia
   Sanguessugas medicinais (Hirudo verbana, ~2 g) foram obtidas de uma fonte institucionalmente certificada. Antes da aplicação, a região dorsal de cada animal era raspada com uma máquina de cortar elétrica, e a pele era suavemente limpa com soro fisiológico estéril, sem antissépticos, para evitar a fixação de sanguessugas. Os animais eram então colocados em um tubo de contenção acrílico transparente para limitar o movimento e minimizar o estresse. Uma única sanguessuga foi colocada na linha média dorsal, e o sucesso da fixação foi confirmado visualmente pela fixação oral por ventosas. A alimentação foi permitida por 10 minutos (Figura 2). Após o período de aplicação, as sanguessugas foram removidas expondo a área de fixação a 70% de vapor de etanol usando um aplicador de algodão mantido aproximadamente a 1–2 cm do local. Após o descolamento, o sangramento local foi controlado com gaze estéril usando pressão suave por aproximadamente 1–2 minutos, e nenhuma sutura foi aplicada. As inscrições foram realizadas três vezes por semana durante 2 semanas. Esse procedimento foi conduzido com base nos protocolos experimentais e clínicos de hirudoterapia previamente descritos com parâmetros^{padronizados de aplicação 21}.

4. Eutanásia e coleta de sangue

Ao final do experimento (24 h após a última intervenção⁾⁶, os animais foram anestesiados intraperitonealmente com cetamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). A profundidade adequada da anestesia foi confirmada pela ausência de retirada dos pedais e reflexos corneanos. A coleta de sangue intracardíaca foi então realizada usando uma seringa estéril de 5 mL por punção ventricular esquerda. A eutanásia foi concluída por exsanguinação seguida de toracotomia. Posteriormente, o músculo gastrocnêmio medial e os tecidos do fígado foram coletados para análises adicionais. As amostras de sangue foram processadas dentro de 1 hora após a coleta, transferindo-as para tubos ativadores de coágulos e centrifugando a 1.000 × g por 15 minutos a 4 °C. O soro separado era então alicotado em porções de 200 μL e armazenado a −80 °C até a análise.

5. Análise bioquímica e ELISA

Parâmetros bioquímicos, incluindo ALT, AST, LDH, CK, glicose, eletrólitos e cortisol, foram analisados usando um analisador bioquímico automatizado de acordo com procedimentos laboratoriais padronizados. Todos os ensaios ELISA para CAT, SOD, MDA e GPX foram realizados de acordo com as instruções do fabricante sob condições padronizadas. As amostras de soro foram diluídas 1:5 com buffer de amostra quando exigido pelo protocolo do kit. Posteriormente, 50 μL de amostras padrão e 50 μL de amostras de soro foram adicionadas aos poços designados e incubadas a 37 °C por 60 minutos. Após a incubação, as placas foram lavadas cinco vezes usando o tampão de lavagem fornecido para remover os componentes não ligados. O anticorpo de detecção (50 μL) foi então adicionado a cada poço e incubado a 37 °C por 30 minutos. Depois, a solução do substrato era adicionada, e a mistura de reação era incubada por 10–15 minutos em condições escuras para permitir o desenvolvimento da cor. A reação foi interrompida adicionando 50 μL de solução de parada, e a densidade óptica foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas. Todas as amostras foram analisadas em duplicidade para garantir confiabilidade analítica e reprodutibilidade.

6. Análise histopatológica

Para avaliação histopatológica, as amostras de tecido foram processadas de acordo com procedimentos histopatológicos padrão²². Os tecidos foram inicialmente fixados em formalina tampão neutra a 10% por 72 horas, seguida por desidratação por uma série de etanol classificado composta por 50%, 70%, 80%, 96% e 100% etanol, com incubação de 1 hora em cada concentração. Após a desidratação, os tecidos foram eliminados em xileno por dois períodos consecutivos de 30 minutos e, posteriormente, inseridos em blocos de parafina. Seções com espessura de 5 μm foram obtidas usando micrótomo rotativo e coradas com Hematoxilina e Eosina (H&E) e Tricromo de Masson para exame histológico. Por fim, as lâminas coradas foram examinadas usando um microscópio óptico equipado com um sistema de imagem digital.

7. Análise estatística

A análise de dados foi realizada usando software estatístico. A distribuição dos dados foi avaliada usando o teste de Kolmogorov–Smirnov. Para dados normalmente distribuídos, foi aplicada ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. Para dados não distribuídos normalmente, foi utilizado o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste Mann–Whitney U. Um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Parâmetros de dano muscular e fadiga

Marcadores séricos de dano muscular revelaram que os níveis de creatina quinase (CK) variaram significativamente entre os grupos (p < 0,05). Embora os valores de LDH, AST e ALT tenham mostrado tendências de alta no grupo do exercício (E), essas mudanças não foram estatisticamente significativas (p > 0,05). As concentrações de CK foram maiores no grupo E, enquanto o grupo HE apresentou níve...

Discussão

Este estudo demonstrou que a hirudoterapia esteve associada a mudanças mensuráveis em parâmetros selecionados relacionados ao estresse fisiológico induzido pelo exercício. As elevações em CK, LDH, AST e ALT observadas no grupo de exercício refletem perturbação sarcolemal e vazamento enzimático, consistente com relatos anteriores que descreveram esses marcadores como indicadores de distensão muscular 23,24,25.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-80°C; C Freezer (Modelo DF590)	Nü ve	DF590	Armazenamento de amostras em − 80º e grau; C
Tubo de contenção acrílico	N/A	N/A	Restritor acrílico transparente (6 cm de diâmetro, 20 cm de comprimento) usado para imobilização durante hirudoterapia
Analisador Bioquímico Automatizado (Alinity)	Abbott	N/A	Usado para análise de parâmetros bioquímicos do soro
Processador Automático de Tecidos	Leica Biosystems	N/A	Desidratação dos tecidos e infiltração de parafina
Centrífuga (Modelo FC5706)	OHAUS Corporation	FC5706	Velocidade máxima: 6000 rpm (&assínpita; 4.000 e vezes g, dependendo do raio do rotor)
Câmera de Microscópio Digital (Axiocam 208 colorido)	Carl Zeiss	Axiocam 208 cor	Aquisição de imagem para histopatologia
Eosina Y (amarelada)	Merck / Sigma-Aldrich	1.15935.0025	H& Coloração por E (componente de eosina)
Etanol Absoluto (99,5%)	Tekkim Kimya	TK.200655.05001	Usado para séries de desidratação por etanol
Solução de formaldeído (~37%)	Merck / Sigma-Aldrich	1.04002.2500	Usado para fixação de tecidos
Solução de Hematoxilina de Harris	BESTLAB	BS-002	H& Coloração por E (componente hematoxilina)
Cloridrato de cetamina	Grau farmacêutico (fonte comercial não especificada)	N/A	Usado para anestesia intraperitoneal (75 mg/kg)
Microscópio de Luz (Primo Star)	Carl Zeiss	Primo Star	Imagem histopatológica
Masson' s Kit de Tingimento Tricromático	GBL	REF 5022	Usado para coloração de tecido conjuntivo
Esteira Rodante Motorizada para Roedores	Columbus Instruments	Exer-3/6	Usado para exercícios padronizados em esteira, com velocidade controlada e estimulação elétrica
Kit de Catalase de Rato (CAT) ELISA	BT LAB	E0869Ra	Placa de 96 poços; Medição da atividade da CAT sérica
Kit ELISA de Peroxidase de Glutationa de Rato (GPX1)	Reed Biotech	RE2557R	Placa de 96 poços; Medição da atividade da CAT sérica
Kit ELISA de Malondialdeído de Rato (MDA)	BT LAB	E0156Ra	Placa de 96 poços; Medição da atividade da CAT sérica
Kit ELISA de Dismutase de Superóxido de Rato (SOD)	BT LAB	E0168Ra	Placa de 96 poços; Medição da atividade da CAT sérica
Microtomo Rotativo (Autocorte)	Leica Biosystems	RM Autocut	Corte 5 & mu; Seções de parafina m
Aquecedor de Ferrolho	Leica Biosystems	HI1210	Lâminas de histologia de secagem
Cloridrato de xilazina	Grau farmacêutico (fonte comercial não especificada)	N/A	Usado para anestesia intraperitoneal (10 mg/kg)
Xileno (mistura de isômeros)	Tekkim Kimya	TK.090270.05003	Limpeza de tecidos antes da incorporação de parafina