Artigo de método

Investigando os mecanismos em toda a rede da estimulação cerebral pálida profunda usando matrizes de microeletrodos de alta densidade

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DOI:

10.3791/70507

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16 de junho de 2026

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1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para gravações ex vivo de matriz de microeletrodos de alta densidade de fatias cerebelares agudas de um modelo distônico de hamster recebido in vivo. Estimulação cerebral pálida profunda contínua por 11 dias.

Resumo

Distonia é um distúrbio neurológico do movimento caracterizado por controle muscular anormal que afeta movimentos voluntários e posturas sustentadas. Embora a distonia esteja associada à disfunção dos gânglios basais, evidências crescentes sugerem que o cerebelo está envolvido em sua fisiopatologia. Este protocolo apresenta estimulação cerebral pálida profunda in vivo (DBS) em um modelo distônico de hamster (hamster dtsz ) combinado com registros ex vivo de matriz de microeletrodos de alta densidade (HD-MEA) para investigar a atividade cerebelar. O protocolo inclui (1) cirurgia DBS para implantação de eletrodos e estimuladores, (2) preparação aguda de fatias cerebelosas, (3) registros eletrofisiológicos de alta resolução e (4) análise de dados. Resultados representativos indicam que 11 dias de DBS pálidal restauraram a atividade do pico aos níveis normais nas camadas molecular, de Purkinje e granular, consistente com envolvimento da rede cerebelosa na distonia. Esse protocolo permite uma análise detalhada da atividade cerebelar e sua modulação por DBS, fornecendo uma plataforma para investigar mecanismos em nível de rede subjacentes às terapias de neuromodulação.

Introdução

A distonia é o terceiro distúrbio do movimento maiscomum 1, caracterizado por sinais e sintomas clínicosdistintos 2,3, embora às vezes possa ser confundido com outros distúrbiosmotores 4,5,6. As características clínicas mais proeminentes incluem contrações musculares involuntárias, movimentos repetitivos e postura anormal e/outorcida 7. Essas características podem ser acompanhadas por sintomas como dor, desempenho motor prejudicado e fadiga, que podem piorar durante períodos de estresse, ansiedade ou exaustãofísica 8,9,10,11. A fisiopatologia da distonia ainda não é totalmente compreendida12,13. Embora os estudos tradicionalmente tenham focado nos gânglios da base, evidências crescentes apoiam um conceito em nível de rede do distúrbio, envolvendo múltiplas regiões cerebrais, incluindo ocerebelo 14,15,16,17. Esse protocolo visa investigar a atividade da rede extracelular em camadas distintas do córtex cerebelar para elucidar seu papel na fisiopatologia da distonia e compreender os mecanismos em toda a rede da estimulação cerebral profunda (DBS).

A estimulação cerebral profunda (DBS) que tem como alvo o globo pálido interno (GPi) ou o núcleo subtalâmico (STN) é frequentemente usada para tratar certas formas de distonia, especialmente aquelas resistentes a medicamentos. Além disso, o desfecho do tratamento é heterogêneo e imprevisível, pois pacientes com manifestações clínicas semelhantes podem responder de forma diferente à mesma abordagemterapêutica 20. Uma compreensão mais abrangente da rede neural subjacente à distonia pode melhorar os resultados do tratamento21. Portanto, são necessárias abordagens experimentais e em larga escala, que só podem ser alcançadas por meio de estudos pré-clínicos em modelos animais. Combinar experimentos in vivo com DBS com registros ex vivo de matriz de microeletrodos de alta densidade (HD-MEA) permite monitoramento de alta resolução da atividade da rede neuronal (quase) fisiológica para melhor compreender a fisiopatologia da distonia e os mecanismos da DBS.

Os gânglios basais e o cerebelo influenciam o controle motor, ao menos em parte, por meio de suas conexões com o córtex motor primário (M1)22. Um estudo anatômico com lesão estriatal e remoção cirúrgica do cerebelo apoia essaideia 23. Em nosso estudo, usamos o modelo animal do hamster distônicodt sz 24,25, que apresenta anomalias cerebelares associadas à distonia26. Utilizando matrizes de microeletrodos de alta densidade (HD-MEAs), investigamos a atividade da rede cortical cerebelosa em hamsters distônicos e saudáveis. No entanto, abordagens eletrofisiológicas convencionais carecem da resolução espacial para capturar dinâmicas de redes específicas de camadas, enquanto este método aborda essa limitação. Por outro lado, investigamos o efeito da estimulação cerebral profunda no globo pálido interno sobre as redes corticais cerebelosas.

O sistema HD-MEA oferece a vantagem de registros eletrofisiológicos detalhados em paralelo, permitindo a análise das camadas do córtex cerebelar (granular, Purkinje e camadas molecular), com cada camada desempenhando um papel essencial no processamento das sequênciasde movimento 27. A camada granular, densamente recheada de células granulosas, recebe e retransmite informações sensoriais e motoras das fibras musgosas, permitindo a integração inicial do sinal antes do processamentoposterior 27. A camada de Purkinje, que contém células de Purkinje, transmite sinais inibitórios para os núcleos cerebelosos profundos, onde as camadas granular e molecular modulam o sinal de saída. A camada molecular, rica em dendritos e interneurônios, suporta modulação complexa por meio de interações sinápticas com células de Purkinje, ajustando finamente a saídamotora 28. O HD-MEA, ao contrário de outras técnicas de registro, não é limitado por resolução espacial ou área de amostragem, permitindo que as contribuições únicas de cada camada sejam capturadas na dinâmica neural alterada observada na distonia15. Essa abordagem oferece maior resolução espacial e capacidades de gravação paralela em comparação com métodos de registro de eletrodo único ou baixa densidade. Existem sistemas HD-MEA baseados na tecnologia complementar metal-óxido-semicondutor (CMOS)29,30, combinada com o conceito de Sensor de Pixel Ativo (APS), que fornecem imagens funcionais para visualizar a atividade elétrica de grandes populações de neurônios aolongo do tempo 31,32. Com essa técnica, a dinâmica de cada camada do córtex cerebelar pode ser monitorada, e processos específicos de transmissão sináptica podem ser investigados por lavagem com várias substâncias. Esse método é particularmente adequado para estudos que investigam a atividade complexa de redes neuronais e alterações específicas de camadas em modelos de doenças neurológicas.

Este trabalho aborda desafios técnicos relacionados ao encapsulamento do sistema de estimulação, bem como à preparação de tecidos, aquisição de dados e análise de um grande conjunto de dados eletrofisiológico. Com este trabalho, apresentamos uma opção para investigação in vitro de processamento neuronal altamente complexo que, em nosso caso, por um lado, contribui para uma compreensão mais diferenciada da dinâmica fisiopatológica em redes neuronais distônicas e, por outro lado, fornece conhecimento sobre o mecanismo terapêutico de ação da DBS.

Protocolo

Use hamsters distônicosDT SZ e controle hamsters dourados sírios paraexperimentos 26. No total, quatro grupos experimentais foram examinados no presente estudo: (1) hamsters controle não distônicos (tipo selvagem, WT), (2) hamsters nativos dedt sz não tratados, (3) dt sz-Sham (que passaram por implantação, mas sem estimulação ativa) e (4) dtsz-DBS (com DBS contínuo in vivo por 11 dias antes da preparação da fatia). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Diretiva da UE 2010/63/UE e as leis federais de proteção animal, sob a licença 7221.3-1-029/20.

1. Animais

  1. Abrigue os animais sob condições padrão do GV Solas33 em um ciclo de 14 horas de luz / 10 horas de sombra, e com acesso livre a água e alimento (hamster da dieta padrão, Altromin).
  2. Faça o rastreamento dos hamsters mutantesdt sz para sintomas distônicos usando a técnica de estimulaçãotripla 26, aos 20 ± 1 e 27 ± 4 dias
    NOTA: Este procedimento padronizado de estresse leve consiste em remover o hamster de sua gaiola de origem e transferi-lo para uma nova gaiola vazia, seguido por injeção intraperitoneal ou subcutânea de soro fisiológico e privação de sono de curto prazo. Essa sequência de estímulos leves provocadores de ansiedade induz de forma confiável ataques distônicos com latência reprodutível e, portanto, é usada para triagem fenotípica antes da inclusão em grupos experimentais. Hamsters controle não distônicos passam pelo mesmo procedimento para garantir condições experimentais comparáveis entre os grupos.
  3. Para analgesia, trate os animais dos gruposdt-sz-Sham e dt sz-DBS com metamizol peroral (p.o.) de 100 mg·kg-1. Implante ambos os grupos de acordo com o procedimento cirúrgico descrito abaixo.

2. Encapsulamento do sistema de estimulação STELLA

  1. Os sistemas de estimulação STELLA são encapsulados usando uma abordagem biocompatível para proteger os dispositivos da penetração de líquidos durante a implantação crônica. O eletrônico está alojado em uma cápsula personalizada de PETG impressa em 3D.
    1. Sele entre a tampa e a cápsula usando silicone.
    2. Além disso, vede a carcaça com silicone na saída do cabo.
    3. Se forem visíveis espaços no silicone após a secagem, repita as etapas 1 e 2.
    4. Após a solidificação completa do silicone, prepare a resina epóxi em uma proporção de mistura de 100:35 (peso).
    5. Remova as bolhas de ar da resina sob vácuo (Vevor RS-1.5).
    6. Antes da montagem do molde, aplique uma fina camada de vaselina na superfície de acoplamento do molde de silicone personalizado para melhorar a vedação e facilitar a desmoldagem após a cura com epóxi. Coloque a cápsula do estimulador no molde de silicone e preencha lentamente o molde com resina epóxi até que as junções do estimulador e do cabo estejam totalmente cobertas. Evite bolhas de ar durante o preenchimento.
    7. Depois que a resina curar, remova a cápsula do molde e alise a superfície epóxi usando uma lima fina ou ferramenta de polimento para eliminar bordas afiadas.
    8. Aplique um revestimento final fino de silicone sobre a cápsula epóxi curada, mergulhando a cápsula em silicone líquido. Use uma pipeta plástica para aplicar silicone adicional ao redor do cabo, perto da área da junção. O excesso de silicone acumulado deve ser removido com um bastão antes de curar para evitar a espessura do revestimento.
    9. Por fim, realize um teste de funcionalidade pós-encapsulamento para verificar a saída correta de estimulação antes da implantação ou uso experimental. Coloque o sistema de estimulação STELLA na solução de Ringer e ative a função magnética BIST. Confirme o padrão correto de piscar do LED (2 × 2), indicando a saída adequada de estimulação e ausência de curtos-circuitos, circuitos abertos ou condições de bateriabaixa 34.

3. Procedimento cirúrgico para implantação de um sistema de estimulação

  1. Prepare instrumentos cirúrgicos (Figura 1) e o sistema de estimulação STELLA (plataforma modular implantável definida por software) 34.
    1. Esterilize os instrumentos metálicos da Figura 1 por aproximadamente 5 minutos a 200 °C, por exemplo, com o FST Sterilizer 250. Note que os instrumentos estão quentes ao removê-los.
    2. Desinfete o sistema de estimulação STELLA com os dois eletrodos DBS com 70% de etanol. Coloque o sistema de estimulação seco em um Falcon (tubo cônico de 50 mL) preenchido com a solução de Ringer durante a noite.
  2. Prepare o animal (entre 25 e 32 dias de idade)
    1. Coloque a câmara de anestesia (feita por si mesmo) na gaiola do hamster. O hamster entra voluntariamente no tubo após pouco tempo (Figura 2A).
    2. Quando o hamster estiver no tubo, feche o tubo na extremidade e conecte-o à saída volátil de isoflurano por 1-2 minutos (indução de anestesia com isoflurano a 4%) (Figura 2B).
    3. Retire o animal do cilindro com cuidado. Coloque o animal no controle de temperatura
      superfície (aproximadamente 38 °C) e ajustada a uma máscara respiratória (GM-4; manutenção da anestesia com isoflurano a 3%; teste de profundidade da anestesia com reflexo interdigital).
    4. Raspe a área cirúrgica da cabeça com um aparador de cabelo adequado (Figura 2C). Limpe a área com um swab úmido e injete 500 μL de bupivacaína 0,25% subcutânea (s.c.) no couro cabeludo para anestesia local adicional do perióstio. Espere pelo menos 5 minutos antes de abrir o couro cabeludo.
    5. Transfira o animal cuidadosamente para a estrutura estereotáxica e fixe-o com as barras auriculares para que bregma e lambda fiquem na mesma altura (reduza o isoflurano para 1,5–2,5% para manter a anestesia).
    6. Proteja os olhos com um substituto para lágrimas (TVM Ocry-Gel).

4. Implante o sistema de estimulação STELLA

  1. Faça uma incisão cutânea de 2 cm de comprimento medialmente no couro cabeludo. Um retrator (Figura 1, Nº 14 e Figura 2D) puxa a pele para longe. Prepare o crânio removendo localmente o periósteo com a lâmina, riscando. Pare possível sangramento com swabs.
  2. Aplique 3% deH2O2 com um aplicador de ponta de algodão para o desgaste.
  3. Pegue o sistema de estimulação da solução de Ringer e proteja os eletrodos da DBS com parafilme.
  4. Insira uma tesoura romba pela incisão de pele feita na cabeça e forme uma bolsa cutânea de 5 cm subcutânea em direção ao pescoço e flanco.
  5. Insira o estimulador, que foi retirado do Falcon e imerso em desinfecção dérmica.
  6. Aplique aproximadamente 500 μL de antibiótico (10 mg·g-1 ácido fusídico) na bolsa da pele com um aplicador de ponta de algodão.
  7. Perfure dois furos de 7 mm (com FST#19007-07) no crânio para eletrodos DBS em AP: −0,6 mm e ML: ± 2,2 mm segundo o bregma.
  8. Fure mais dois furos (9 mm; FST#19007-09) lateralmente em cada orifício do eletrodo. Aparafuse quatro parafusos (DIN 84 A2 M1x2) nos furos preparados (Figura 2D).
  9. Implante dois eletrodos DBS (SNEX-100) com DV: 6,0 mm de acordo com o bregma. Por favor, note que o suporte do eletrodo do seu quadro estereotáxico específico determina de que lado o eletrodo é implantado primeiro (a distância entre os eletrodos é de 4,4 mm).
  10. Fixe o eletrodo com uma ligação de cura por luz UV (Heliobond) nos dois parafusos. Quando ambos os eletrodos são implantados, uma camada final com ligação de cura à luz UV é aplicada entre eles. Por fim, os eletrodos são cimentados com Fluxo de Compoglass (Figura 2E).
  11. Ative o estimulador do grupo DBS magneticamente após pelo menos três dias de recuperação para 11 dias contínuos de DBS. Neste estudo, usamos parâmetros de estimulação semelhantes aos usados em clínicas (130 Hz, 50 μA e 60 μs).
  12. Verifique o padrão de luz do estimulador passando diariamente um ímã sobre o flanco do hamster (Figura 2F).

5. Preparação de fatias cerebelares agudas

  1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) e 0,5 L de sacarose para cada animal (veja a Tabela 1 e a Tabela 2 para detalhes).
  2. Use solução de sacarose a aproximadamente 4 °C durante a extração e fatiamento do cérebro, com carbogenação contínua. Além disso, prepare sacarose gelada para manter a baixa temperatura do tecido durante a dissecação rápida.
  3. Prepare o local de trabalho com ferramentas de dissecação, solução de sacarose, placas de Petri e instalação de vibrátomos (veja a Figura 3A).
  4. O sacrifício dos animais deve ocorrer em aproximadamente 15 minutos após a desligamento da DBS, e a extração cerebelosa deve começar imediatamente em seguida. Decapite o animal em anestesia profunda induzida com isoflurano volátil. Coloque a cabeça em uma placa de Petri mais alta, cheia de sacarose gelada e gelada.
  5. Dissecar o cérebro evitando cortes mediais pelo canal espinhal para proteger o tecido cerebelar de danos.
  6. Transfira o cérebro para uma nova placa de Petri cheia de sacarose gelada, com um papel filtro na parte inferior para evitar que o cerebelo escorregue durante a secção.
  7. Primeiro, remova o cerebelo através do corte coronal através da ponte com uma lâmina (Figura 3B). Em seguida, remova os hemisférios cerebelares por cortes parassagitais com uma lâmina (Figura 3C).
  8. Prepare a placa vibratome com uma gota de supercola. Remova cuidadosamente os vermes cerebelosos da placa de Petri. Tampone o plano da seção parasagital em um papel de filtro para secar antes de colar este lado (Figura 3D).
  9. Coloque a placa do vibratome na bandeja e encha com sacarose suficiente (metade granizado, metade solução) para submergir completamente os vermes. Não se esqueça de abastecer carbogênio (CB).
  10. Corte cortes parasagitulares cerebelosos com espessura de 200 μm a velocidade constante de 0,08 mm·s-1 (Figura 3E). Armazene as fatias em ACSF em um béquer constantemente gaseado com CB em temperatura ambiente (Figura 3F).
  11. Deixe as fatias se recuperarem em ACSF carbonatado em temperatura ambiente por aproximadamente 40 minutos antes de transferir para o HD-MEA, que serve como período de reaquecimento e estabilização antes da gravação. Durante esse período, mantenha o ACSF em temperatura ambiente.

6. Preparação do Poço ÚnicoCorePlate TM do sistema BioCAM DupleX MEA para gravação

  1. Ligue o sistema de gravação BioCAM DupleX com o software Brainwave 5 (BW5) pelo menos 30 minutos antes de iniciar os experimentos.
  2. Antes de colocar a fatia de tecido no Poço SimplesCorePlate TM para gravação, avalie o nível de ruído de fundo inserindo o poço simples no sistema de gravação. O nível ideal de ruído para gravação de alta qualidade deve ser de 9-20 μV.
  3. Limpe as almofadas banhadas a ouro com 100% de etanol (Figura 4A-1), o conjunto de eletrodos com 70% de etanol e uma escova macia (Figura 4A-2). Por fim, enxágue a matriz de eletrodos com água MilliQ.
  4. Conecte o poço simples HD-MEA/CorePlate TM ao sistema de gravação (Figura 4D-1).
  5. Pipete aproximadamente 2 mL de ACSF no poço. Certifique-se de que não haja bolhas de ar nos eletrodos ou no solo (Figura 4D-2).
  6. Comece a aquisição ao vivo e grave por pelo menos 30 segundos com BW5.

7. Analisar a amplitude de pico a pico

  1. Para analisar a interface de ruído, abra o arquivo *.bxr gravado, que contém 30 segundos de gravação de ruído intrínseco (gerada pelos componentes resistivos dos eletrodos e circuitos amplificadores).
  2. Selecione "Activity Map" e, em "Metric", escolha Amplitude de pico a pico. A escala é ajustada para 500 μV, permitindo visualizar a variabilidade do sinal ao longo do conjunto de eletrodos (Figura 5A).
  3. Na janela "Activity Map", posicione o ponteiro do mouse sobre o eletrodo gravado para exibir o valor da amplitude "Média de Poço Largo".
  4. Alternativamente, você pode determinar o valor médio da amplitude criando um arquivo Excel (*.xlsx) em "Exportação de Grafo". Depois, abra esse arquivo Excel e calcule o valor médio da amplitude [=Média(Número1; Número 2;...)].

8. Analisar o ruído de base (desvio padrão do sinal)

  1. Analise o ruído de base clicando em "Reproduzir" para gerar o arquivo *.brw. Depois, selecione "Activity Map" e, em "Metric", selecione "Desvio Padrão". A escala é automaticamente ajustada para 30 μV, permitindo visualizar a variabilidade do sinal ao longo do conjunto de eletrodos (Figura 5B).
  2. Na janela "Activity Map", passe o ponteiro do mouse sobre o eletrodo registrado para exibir o desvio padrão "Médio de Largura de Poço".
  3. Alternativamente, você pode determinar o desvio padrão médio usando "Exportar Gráfico" e criar o arquivo *.xlsx Excel. Depois, abra o arquivo Excel e calcule o desvio padrão médio [=Average(Number1; Número 2;...)].

9. Para avaliar a qualidade do sinal:

  1. Calcule a Relação Sinal-Ruído (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: Boa qualidade
    SNR entre 2 e 5: Qualidade moderada
    SNR < 2: Qualidade ruim

10. Posicionamento de fatia em poço único CorePlate para aquisição de dados

  1. Com a ajuda de uma pipeta Pasteur, posicione a fatia no conjunto de eletrodos de modo que a região de interesse seja coberta por eletrodos de gravação (Figura 4 B-1). Remova a solução do poço (Figura 4 B-2). Tire uma foto com um microscópio vertical.
  2. Fixe o tecido com a âncora da fatia (Figura 4C).
  3. Usando uma pipeta Pasteur de 3 mL, adicione uma gota de ACSF à fatia.
  4. Remova o líquido usando uma pipeta Pasteur com menor volume. Remova o líquido restante com uma folha de papel torcido (repita isso de 7 a 10 vezes) (Figura 4C-2).
  5. Para perfusão durante gravações, use ACSF em temperatura ambiente e ajuste a taxa para 2 mL·min-1. A posição de entrada está acima da fatia de tecido, e a saída está na parede do poço (Figura 4D).
  6. Recomenda-se uma aterramento adicional do fluxo de entrada e saída para minimizar o ruído induzido pela perfusão, o que pode ser alcançado conectando-os ao sistema de gravação por meio de um fio (Figura 4D-1).
  7. Para reduzir distúrbios, desligue o microscópio e as luzes do ambiente.

11. Gravações da atividade da rede com o PoçoÚnico CorePlate TM

  1. Defina os parâmetros de gravação para uma frequência de amostragem de 20.000 Hz com um filtro passa-alta em 100 Hz.
    1. No software BrainWave 5, vá em Arquivo e abra uma nova sessão de gravação.
    2. Clique em "Fonte".
    3. Abra: piloto de chip e selecione para os seguintes ajustes:
      Registro de atividade neural espontânea em uma taxa de amostragem: 20.000 Hz/eletrodo.
      Corte do filtro passa-alta de hardware: 100 Hz.
      Taxa de compensação de luz: curta (estimulação direta de luz).
  2. Para selecionar o canal de calibração do chip e o tipo de traço bruto.
    1. Abrir: Sinal de controle, e selecionar: Na calibração interna do chip, selecione canal de saída: 1.1.
    2. Clique em "+" e "Gráfico".
    3. Aberto: Configuração de gráfico.
    4. Selecione traços brutos: bruto e picos.

12. Insira e alinhe a imagem do microscópio no mapa de atividade

  1. Clique em "+".
  2. "Overlays and Annotations" para inserir a imagem do microscópio no mapa de atividade no BW5:
  3. Camadas de Poço Ir para Poços:
    1. Selecione gerenciar camadas e a imagem cerebelosa.
    2. Alinhar a camada de imagem selecionada: clique em iniciar.
    3. Clique nos quatro cantos da imagem seguindo a sequência numérica e aplique.

13. Configuração de compressão de dados antes da gravação

  1. Para comprimir os dados, vá para a primeira página do RECORDER:
    1. Modo cockpit: avançado
    2. Salve comprimido bruto: compressão wavelet + eventos: picos.
    3. Toque por 10 minutos antes de começar a gravação.
  2. Limpe as almofadas banhadas a ouro com 100% etanol após terminar as gravações. Em seguida, encha o poço com água pura e escove por 30 segundos.
  3. Em seguida, encha o poço com etanol a 70% e escove suavemente o conjunto de eletrodos por aproximadamente 30 segundos. Por fim, encha o poço com água pura e escove suavemente por 30 segundos (repita essa etapa 2 ou 3 vezes).
  4. Mantenha o Poço SimplesCorePlate TM seco no recipiente apropriado.

14. Análise offline de dados gravados

  1. Abra o arquivo desejado com o BW5.
  2. Divida o córtex cerebelar em três grupos selecionando eletrodos de acordo com a atribuição da camada anatômica (camada molecular, camada celular de Purkinje, camada celular granular).
    NOTA: O número de eletrodos dentro das regiões de interesse (ROIs) por camada dependia da atividade espontânea detectada em cada camada e, portanto, variava entre as gravações. Normalmente, 25-250 eletrodos por ROI foram analisados a partir de uma única fatia. Eletrodos localizados em regiões que abrangem duas camadas anatômicas foram excluídos para evitar ambiguidade na atribuição das camadas. Apenas eletrodos claramente atribuíveis a uma camada cerebelosa específica foram incluídos para avaliação adicional.
    1. Seleção e agrupamento: Vá para os grupos de unidade.
    2. Em Gerenciar grupos de unidades, clique em "+" para formar um grupo e nomeá-lo.
    3. Para incluir mais eletrodos no grupo, selecione os eletrodos e clique em "adicionar ou remover unidades selecionadas".
  3. Analise traços brutos usando o método de detecção de picos, conhecido como detecção de picos de temporização precisa (PTSD). Foca na detecção de máximos e mínimos relativos com amplitudes de pico a pico que excedem um limiar predefinido, garantindo uma identificação precisa e exata dos picos.
    1. Processamento de dados: Vá em Detecção de Picos e defina o modo para avançado.
    2. Use dados de: Raw.
    3. Algoritmo: TEPT (Detecção precisa de picos de tempo).
    4. Fator de desvio padrão: 8,0.
    5. Período máximo de vida: 2,0 ms.
    6. Período refratário: 1,0 ms.
    7. Atribuição de picos: pico negativo.
    8. Duração da onda antes do pico: 1,0 ms.
    9. Duração pós-pico da onda: 1,5 ms.
  4. Vá para o Spike sorting e configure o modo para avançado. Ajuste o seguinte parâmetro:
    1. Duração da onda antes do pico: 0,5 ms.
    2. Duração da onda após o pico: 1,0 ms.
    3. Algoritmo de extração de características: momentos Legendre.
    4. Número de recursos: 3.
    5. Algoritmo de agrupamento: K-Means & Silhouette.
    6. Número mínimo de picos por cluster: 20.
    7. Número máximo de clusters: 3.
    8. Limiar de esboço: 2.
  5. Exportando dados para o Excel.
    1. Clique em "Gráfico".
    2. Vá para Exportar Gráficos.
    3. Selecione a planilha e exporte.

Resultados

A DBS pálida aumentou o número de picos para níveis normais nas camadas corticais entre os grupos.

Analisamos o número total de espinhos em três camadas do córtex cerebelar — camada molecular (ML), camada celular de Purkinje (PL) e camada celular granular (GL) — em quatro grupos experimentais: tipo selvagem (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7) e dtsz-DBS (N = 7), com análises realizadas em fatias obtidas desses animais.

Enquanto o tecido distônico (DTsz) gerou significativamente menos picos, a DBS pálida aumentou o número de picos para níveis comparáveis aos dos controles saudáveis (Tabela 3). O teste Kruskal-Wallis H confirmou ainda mais isso, mostrando um aumento estatisticamente significativo no número de picos no ML para o grupo DBS dtsz em comparação com os grupos dtsz e dtsz-Sham (χ2(3) = 20,728, p = 0,001; Figura 6A). O grupo dtsz-DBS também mostrou um aumento semelhante nos picos em PL (χ2(3) = 16,855, p = 0,001; Figura 6B) e GL (χ2(3) = 13,164, p. = 0,004; Figura 6C), alcançando valores comparáveis aos do grupo WT (Tabela 3).

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Figura 1. Visão geral dos instrumentos cirúrgicos. A imagem mostra uma bandeja disposta contendo um conjunto de instrumentos cirúrgicos e microcirúrgicos projetados explicitamente para procedimentos que envolvem a implantação de eletrodos profundos e estimuladores. Os instrumentos são organizados em ordem sequencial de uso, aumentando a eficiência processual. Eles são colocados sobre tecido para manter a limpeza e garantir fácil acesso durante o procedimento. Esse arranjo foca em precisão, esterilidade e prontidão para fluxos de trabalho cirúrgicos complexos. (1) Tesoura cega/cega, (2) Tesoura para sutura, (3) Tesoura afiada/afiada, (4) suporte para agulha, (5) pinça para amarrar pontos, (6) pinça de farpa/curva, (7) Pinça serrilhada, (8) pinça padrão curta, (9) pinça padrão longa, (10) Microespátula, (11) eletrodo reutilizado, (12) Parafusos, (13) acessórios para furadeira, (14) ponta/grampo do afastador, (15) Bloco de cavidade de vidro a ser preenchido com 0,9% de NaCl e xilocaína. Para mais informações, confira a lista de materiais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2. Configuração experimental para anestesiação e posicionamento do animal no aparelho estereotáxico para implantação dos eletrodos de DBS e do estimulador. (A) O animal é cuidadosamente colocado dentro de uma câmara de indução feita sob medida para iniciar a anestesia. (B) A câmara de indução é conectada a uma máscara respiratória para garantir a administração adequada da anestesia (indução com isoflurano a 4%), mantendo a segurança durante o manuseio. (C) Após a anestesia, o animal é transferido para uma placa térmica com uma máscara respiratória conectada (manutenção com isoflurano a 3%) para prevenir hipotermia e garantir anestesia contínua durante a barba. (D) O animal é cuidadosamente posicionado no quadro estereotáxico. É feita uma incisão longitudinal e grampos são usados para retrair a pele. Quatro pontos indicam a posição do parafuso. Parafusos são inseridos nas áreas marcadas, e dois pontos adicionais são marcados para a colocação dos eletrodos. (E) O eletrodo é inserido no GPi e fixado com cola antes que o suporte estereotáxico seja removido. Para melhor fixação, aplica-se cimento ao redor dos eletrodos. Suturas longitudinais interrompidas são usadas para fechar o local cirúrgico e (F) o estimulador é colocado na área subcutânea do flanco do animal. O animal permanece vivo após a cirurgia, e a seta indica a localização do estimulador. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3. Ilustração de corte e fatiamento do cérebro. (A) instrumentos cirúrgicos para o procedimento de dissecação. (1*) Placa caseira de Agar Petri, (2*) Placa de Agar Petri, (3*) Grampo fixando o tubo de carbogênio, (4*) Filtro de papel, (5*) Lâmina, (6*) Supercola, (7*) Placa/suporte de vibrátomo, (8*) Pinça curva, (9*) Tesoura, afiada/Romba. (B) Preparação da amostra cerebral: após a dissecação, o cérebro é cortado, e as linhas tracejadas indicam a orientação da seção do plano coronal. (C) Corte parasagital: o cérebro é cortado ao longo do plano parasagital especificado. (D) Fixação do tecido: O tecido cerebral resultante é fixado a uma placa/suporte com cola para fixá-lo e permitir uma secção precisa. (E) Seccionamento por vibratome: A placa com tecido fixo é transferida para um vibratôme, onde são obtidas fatias ultrafinas (200 μm). (F) Fatias finais: Fatias parasagitais cerebelosas precisas são produzidas, prontas para registro eletrofisiológico35. Para mais informações, confira a lista de materiais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4. Exemplo dos passos para conseguir uma boa atividade celular. ( A) Limpeza: Esta etapa envolve preparar o HD-MEA limpando sua superfície para garantir que nenhuma sujeira interfira no acessório (touchpad, A-1) ou no processo de gravação (área plana, A-2). (B) Posição do corte: O corte de tecido é cuidadosamente posicionado no HD-MEA (B-1), garantindo o alinhamento adequado para contato eficaz com o eletrodo (B-2). Uma ponta fina da pipeta (seta) é usada para remover o ACSF restante, permitindo a inserção da âncora. (C) Fixação da fatia: a fatia é posicionada de forma segura no HD-MEA usando a âncora. Nessa etapa, é crucial colocar uma gota de ACSF e então remover cuidadosamente o excesso de líquido usando uma pipeta (C-1; seta) e um pedaço torcido de papel de limpeza de precisão (C-2). Isso garante que a fatia permaneça estável e bem conectada aos eletrodos para um registro preciso. (D) Perfusão: Por fim, um sistema de perfusão é conectado e iniciado para manter a viabilidade da fatia de tecido durante o experimento, onde o fluxo de entrada deve estar sobre a fatia e o fluxo de saída próximo à parede (D-2). Também é essencial remover todas as bolhas do solo para minimizar o ruído durante a gravação (indicado pela seta). Aterramento adicional é fixado tanto na tubulação de entrada quanto na de saída (D-1). As barras de escamas vermelhas têm 1,5 mm de comprimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-5
Figura 5. Métricas para amplitude e desvio padrão em gravações HD-MEA usando o software Brain Wave 5 (BW5) para avaliar a qualidade do sinal. (A) Métrica de amplitude pico a pico selecionada para extrair valores intrínsecos de amplitude de eletrodos (escala: 500 μV). (B) Métrica de desvio padrão selecionada para quantificar o ruído de linha de base entre eletrodos (escala: 30 μV). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Efeitos da DBS pálida na atividade dos picos através das camadas corticais cerebelosas: (A) camada molecular (ML), (B) camada celular de Purkinje (PL) e (C) camada granular (GL). Os gráficos Box-Whisker exibem a média e a mediana com uma linha transversal e horizontal, respectivamente, junto com os percentis 25 e 75. Os respectivos grupos são tipo selvagem (WT, n = 22 fatias), dtsz sem cirurgia (n = 20 fatias), dtsz DBS inativo (Sham, n = 20 fatias) e dtsz-DBS ativo (n = 20 fatias). A significância estatística foi determinada usando o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelas comparações par a par de Dunn (*p .< 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

NomePeso molecular [g/ mol]Concentração final [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
Glicose180.160.01
CaCl2 (sem água)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH 2PO4119.980.00125
pH7,35 a 7,40 (ajustável com HCl)
Osmolalidade [mosmol/ kg]290 a 300

Tabela 1: Solução de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF): Composição e concentrações molares finais dos componentes usados para preparar o ACSF para experimentos com fatia cerebelosa. O pH foi ajustado para 7,35–7,40 com HCl, e a osmolalidade foi mantida entre 290–300 mOsm·kg-1.

NomePeso molecular [g/mol]Concentração final [mol/L]
Sacarose342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (sem água)110.980.0005
MgCl295.210.007
Glicose180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH 2PO4119.980.00125
pH7,35 a 7,40 (ajustável com HCl)
Osmolalidade [mosmol/ kg]320 a 330

Tabela 2: Solução de sacarose. Composição e concentrações molares finais da solução de sacarose usada durante a preparação da fatia cerebelosa. O pH foi ajustado para 7,35–7,40, e a osmolalidade foi mantida entre 320–330 mOsm·kg-1.

Grupos:WTDTSZ dtsz-ShamDTSZ-DBS
n22202020
Coeficiente de variância
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
Número de picos
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

Tabela 3: Resumo das métricas de pico entre camadas cerebelares e grupos experimentais. WT – hamsters selvagens, não controle distônico; DTSZ - Hamsters nativos DTSZ; DTSZ-DBS - HAMSTERS DTSZ estimulados continuamente por 11 dias; dtsz-Sham - hamsters dtsz passando pela cirurgia, porém, sem DBS ativo; ML – camada molecular; PL – camada celular de Purkinje; GL. – camada celular granular.

Discussão

Descrevemos uma abordagem metodológica para investigar os mecanismos da estimulação cerebral profunda (DBS) na rede neuronal distônica patofisiológica no hamster dtsz . Passos críticos incluem implantação precisa de eletrodos, preparação rápida de cortes cerebelosos e condições estáveis de registro HD-MEA para garantir aquisição confiável de dados. Demonstramos o procedimento cirúrgico, preparação de cortes cerebelosos, técnicas de registro e análise para explorar a atividade cerebelar ex vivo e sua modulação por DBS. As medições eletrofisiológicas usando HD-MEA forneceram registros em tempo real da atividade espontânea cerebelosa com alta resolução temporal eespacial 36, que consideramos necessárias para investigar os mecanismos da estimulação cerebral pálida profunda no tratamento da distonia.

A distonia é atualmente conhecida como um distúrbio de rede caracterizado por saída motora anormal decorrente de interações disfuncionais entre gânglios basais, cerebelosos e circuitoscorticais 37,38. Anomalias cerebelares demonstraram desempenhar um papel significativo na distonia, conforme apoiado por estudos clínicos eexperimentais 15,22,39. Além disso, um estudo anatômico envolvendo a injeção do vírus da raiva retrógrada (VR) no córtex cerebelar de macacos Cebus mostra que o núcleo subtalâmico dos gânglios da base possui uma projeção substancial para o córtexcerebelar 40. Esses achados ressaltam a importância de explorar os circuitos cerebelosos ao longo das redes ganglionares da base ao estudar os mecanismos terapêuticos da DBS 40,41,42. Esse método é particularmente adequado para estudos que investigam interações neuronais e efeitos de neuromodulação em distúrbios do movimento.

Sobre os mecanismos em toda a rede da DBS pálida, estudos demonstraram que a DBS do segmento interno do globo pálido (GPi) induz mudanças generalizadas na atividade cerebral, não apenas dentro dos gânglios basais, mas também em regiões interconectadas como a redecortico-estriatal 43, otálamo 44 e ocerebelo 15. Essas observações apoiam a hipótese de que a DBS pálida pode modular a atividade em toda a rede gânglio-cerebelosa basal, contribuindo para sua eficácia terapêutica na distonia. Isso demonstra a necessidade de estudos pré-clínicos para investigar os mecanismos da DBS e a vantagem das gravações HD-MEA para capturar mudanças eletrofisiológicas em toda a rede. Além disso, o estudo de Kotyra et al. (2025) apoia a presença de remodelação neuroplástica de longa duração induzida pela GPi-DBS de longo prazo na rede motoradistônica 45. Achados in vivo mostraram que a estimulação pálida reduziu progressivamente a gravidade da distonia em hamsters dtsz e que o efeito benéfico persistiu após a pausa da estimulação, sugerindo que os efeitos induzidos pela DBS não se limitam apenas à estimulaçãoaguda 45. Além disso, estudos eletrofisiológicos recentes demonstraram modulação em toda a rede da plasticidade sináptica e dos padrões de picos após DBS de longo prazo, incluindo aumento da atividadecerebelar 15, aumento da entrada excitatória para neurônios talâmicos motores e entrada excitatória mais agrupada para M1 cortical46.

Resultados representativos indicam um impacto em toda a rede da estimulação cerebral profunda (DBS), evidenciado pela normalização da atividade dos picos nas camadas molecular, celular de Purkinje e granular do córtex cerebelar em hamsters distônicos (Figura 6). O aumento da atividade de picos observado no grupo DBS dtsz atingiu níveis comparáveis aos controles do tipo selvagem. Essa normalização da atividade do spike apoia o potencial terapêutico da DBS para o tratamento da distonia. Notavelmente, o grupodt sz-Sham apresentou valores intermediários de picos em comparação com o grupo WT em todas as camadas cerebelosas, sugerindo que a implantação de eletrodos sozinha pode influenciar a atividade da rede cerebelosa. Essa interpretação é consistente com o efeito clínicamente descrito da microlesão na distonia, onde a própria implantação de eletrodos pode melhorar temporariamente os sintomas antes do início daestimulação 47. Embora o hamster dtsz reproduza características-chave da distonia paroxística generalizada, ele não reflete totalmente a heterogeneidade clínica observada em todas as síndromes de distonia humana. Portanto, deve-se ter cautela ao traduzir esses achados para a distonia humana.

Este trabalho aborda desafios técnicos relacionados ao encapsulamento de estimuladores, cirurgia DBS, preparação de fatias e análise eletrofisiológica em larga escala. A combinação da tecnologia HD-MEA baseada em CMOS oferece uma plataforma robusta para investigação in vitro de interações neuronais altamentecomplexas. Nossos resultados contribuem para uma compreensão mais abrangente da dinâmica fisiopatológica subjacente à distonia, oferecendo insights valiosos sobre os mecanismos em nível de rede da terapia DBS. Facilitar uma análise funcional detalhada de regiões cerebrais específicas e suas interações contribui para uma compreensão mais diferenciada da dinâmica fisiopatológica nas redes neuronais distônicas e, por outro lado, fornece insights sobre o mecanismo terapêutico de ação da DBS.

Neste estudo, problemas técnicos levaram ao aumento do ruído de fundo e interromperam a aquisição estável de sinais durante as gravações HD-MEA. Passos comuns de solução de problemas incluem o tratamento das fontes de ruído, garantir o aterramento adequado e manter o contato estável entre tecido e eletrodo. Em casos de altos níveis de ruído ou medições instáveis, o aterramento, as conexões de cabos e dispositivos elétricos próximos devem ser verificados primeiro. Bolhas de ar na matriz de eletrodos também podem prejudicar o contato tecido-eletrodo e a estabilidade da gravação, e devem ser cuidadosamente removidas (Figura 4). Além disso, é necessário garantir uma transmissão estável de dados do amplificador para o computador via um cabo USB-C para USB-C de alta qualidade. Eletrodos com ruído persistente devem ser excluídos de análises adicionais. Embora a gravação de sinais extracelulares com HD-MEA permita alta resolução espacial da atividade da rede e, juntamente com a imagem microscópica sobreposta, a atribuição às camadas individuais do córtex cerebeloso, não pode ser descartado que a atividade extracelular detectada tenha sido gerada cruzando axônios a partir de uma camada diferente da atribuída. Além disso, análises estatísticas foram realizadas no nível de fatia, pois cada fatia representava um registro eletrofisiológico independente sob condições experimentais padronizadas, embora algumas fatias tenham se originado do mesmo animal.

Durante a DBS, outros problemas podem ocorrer devido ao afrouxamento do eletrodo ou a um defeito técnico no estimulador. Para minimizar esses problemas, garanta a fixação adequada dos eletrodos e mantenha condições de manuseio estériles durante todo o procedimento. Isso aconteceu em 5% de todos os ensaios do presente estudo. Para minimizar o afrouxamento dos eletrodos, a superfície do crânio deve ser seca antes de fixar o eletrodo com adesivo ou cimento dentário para melhorar a aderência e evitar deslizamento. Para garantir a esterilidade e evitar contaminação mecânica, o estimulador, a ponta do eletrodo e o fio de monofilamento devem ser manuseados apenas com pinças ou pinças de hemostasia. Além disso, as luvas devem ser desinfetadas com etanol e secas antes do manuseio do animal para minimizar o risco de infecção. A preparação rápida das fatias cerebelares cerebrais é essencial para registros eletrofisiológicos de alta qualidade. No entanto, isso significava que a posição dos eletrodos de DBS implantados não pôde ser verificada post-hoc. Em outro estudo que investigou o efeito de diferentes parâmetros de estimulação na gravidade da distonia no dt sz-Hamster, foram usados os mesmos eletrodos de estimulação e técnicas cirúrgicas. Aqui, conseguimos confirmar a posição correta dos eletrodos em 94% dosensaios 37.

Em conclusão, esse protocolo oferece uma plataforma poderosa para estudar os mecanismos eletrofisiológicos da DBS e contribui com insights valiosos sobre seu mecanismo de ação. O hamster dtsz possibilita de forma única estudos pré-clínicos dos efeitos da DBS pálida no fenótipo distônico, juntamente com o registro ex vivo de alta resolução da atividade da rede neuronal. Nossos resultados apoiam o conceito de envolvimento cerebelar na distonia e destacam a importância da análise em nível de rede para entender e otimizar terapias de neuromodulação.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo é apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) dentro do Centro de Pesquisa Colaborativa (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneFalcon-type conical tube
Agar Petri dishHandmade
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA platform
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195For cement
Capsule Dispenser GunDentsply Sirona296-0003For cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04stainless steel 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Drill accessory (13)FST19007-07Tip: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1)
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Stainless Steel 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Stainless Steel 12cm
Forceps (8)FST11231-20Stainless Steel 11cm
Forceps (8*)Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Tungsten Carbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptic solution
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100For Coordinates
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Stainless Steel 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Stainless Steel 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Stainless Steel 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation systemnon-commercial; developement of the University of Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)battery-driven DBS stimulator
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
VibratomeLaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma-Aldrich57-50-1

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